一、新生大鼠脊髓损伤修复差异表达基因的筛选（论文文献综述）
常宇鑫[1]（2021）在《AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建》文中研究表明研究背景肢体痉挛是脊髓损伤（SCI）后的最常见的并发症之一,据报道,12%～37%的急性脊髓损伤患者患有肌肉痉挛,而这一比例在慢性脊髓损伤患者中高达65%～78%。尽管严重的痉挛极大地影响了患者的生活质量和脊髓损伤后的恢复,但目前临床上对痉挛的治疗方式仍局限于对症处理。因此,开发一种新的抗痉挛疗法和康复模式,对于脊髓损伤患者的功能恢复和生活质量的提高至关重要。神经营养因子3（NT3）不仅能够降低运动神经元的兴奋性,而且是感觉神经元和运动神经元生存所必需的神经营养因子。研究表明,来自周围肌肉传入信号的输入对于恢复运动功能和重建脊髓损伤段的神经回路至关重要,而这可能是因为周围的肌肉纺锤体合成了NT3。同时,NT3在肌肉中的过度表达会重新平衡兴奋性和抑制性的输入。然而其能否使脊髓损伤后大鼠的脊髓反射正常化尚未得到证实。此外,运动被认为是临床上最简单,最安全,最有效的治疗方法,它能通过平衡感觉的输入和运动的输出来改善运动功能,从而改善患者的生活质量。同时强化训练可使脊髓的本体感受反射正常化。单一的治疗方法可能可以改善某种特定的功能,却无法做到面面俱到,而基于个体化医疗的某些疗法的组合,将预计取得更好的疗效。以病毒为载体的基因治疗能够将治疗基因特异性地输送到病变部位,使其在局部或全身长期稳定的表达,因此目前被广泛应用于中枢系统疾病的诊疗中。其中,腺相关病毒由于其安全、高效的优势被认为是最有希望的基因治疗载体。在众多血清型的AAV载体中,AAV9型腺相关病毒被认为是AAV载体中治疗中枢系统疾病的“标准”载体,但是由于AAV9型腺相关病毒载体穿过血脑屏障的效率仍未能达到预期,导致其治疗中枢系统疾病的效果欠佳。提高病毒的使用剂量或者调整给药途径例如鞘内给药是人们解决上述问题的两种尝试,但是前者会导致体内其他外周器官过大的暴露而产生毒性反应,而后者增加了显着的并发症风险。于是人们将目光聚集到了另外一种可能性的方式——通过对AAV载体的衣壳结构蛋白进行改造,从而改变其转染效率。研究目的构建编码人NT3的重组腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）,探究编码人NT3的重组腺相关病毒（AAV-NT3）与运动干预相结合的联合疗法对脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用,并探究这种联合疗法减轻痉挛的作用机制,为临床工作中脊髓损伤后肌肉痉挛的防治提供理论基础。此外,构建具有更高传递效率的重组AAV,并探究不同的给药途径其对大脑、脊髓等中枢神经系统的传递效率及对外周组织器官的毒性,为基因治疗在中枢神经系统疾病中的应用起到指导和借鉴意义。研究方法1.编码人NT3的腺相关病毒的构建与验证:将绿色荧光蛋白（f-GFP）、神经营养因子3（NT3）及辅助质粒插入到由人类CMV启动子驱动的AAV载体中,然后通过HEK293细胞包装生产重组AAV。使用Western Blot法检测病毒注射后大鼠后肢肌肉与脊髓背根神经节中NT3蛋白表达的变化。2.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用:通过游泳测试及大鼠后肢肌肉的H反射评价大鼠的痉挛频率,并通过BBB评分评价大鼠的后肢运动功能。3.AAV-NT3与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究:运用免疫荧光染色法探究脊髓运动神经元和中间神经元的可塑性变化,并运用Western Blot法检测重组氯化钾协同转运蛋白2（KCC2转运体）的表达。4.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建:将多肽序列插入AAV载体的衣壳蛋白基因组进行改造,生产出多种不同的腺相关病毒基因载体,并通过小鼠尾静脉注射和血脑屏障3D体外模型进行筛选。5.新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率:通过静脉注射和侧脑室注射两种主流的中枢神经系统给药途径,探究AAV-CPP.16是否可以在脊髓中高效、稳定地表达,以及其对外周器官的暴露毒性。结果1.成功构建了NT3重组腺相关病毒,并将其成功转染至大鼠体内;相比于对照组与AAV-GFP组,后肢肌肉注射了AAV-NT3的大鼠,其后肢肌肉与脊髓背根神经节（DRG）中NT3的表达水平显着增加。2.游泳测试及H反射的RDD显示AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能降低肌肉痉挛的发生频率,但是只有AAV-NT3和联合治疗可以增加后肢BBB评分。3.联合疗法可以明显增加脊髓运动神经元的数量和面积,但是单独的AAVNT3基因疗法不具有此作用;联合治疗可以显着增加脊髓胆碱能中间神经元的面积与GABA能中间神经元的数量;AAV-NT3的基因疗法与联合治疗组脊髓中KCC2的表达显着增加。4.相比于对照组wt AAV9,注射了AAV-CPP.16的小鼠大脑内RFP阳性细胞百分比显着提高,同时在血脑屏障3D体外模型中表达的荧光强度明显增加。5.经静脉及侧脑室给药后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓中绿色荧光蛋白的表达量提高,并且有更高比例的运动神经元与GFP标记的细胞相重合。6.经静脉注射后,相比于AAV9,AAV-CPP.16在脊髓DRG及除肝脏和心脏外的外周组织器官中GFP阳性细胞的比例显着增高;经侧脑室注射后,AAV9与AAV-.CPP.16在外周组织器官中几乎不表达GFP蛋白。结论1.AAV-NT3的基因治疗、运动干预及联合治疗均能减轻损伤后的肌肉痉挛;与单纯的基因治疗或运动干预相比,联合治疗有一定的疗效趋势,但差异并不显着。2.AAV-NT3的基因疗法对运动神经元的作用效果有限,而单纯的运动干预无法改善后肢的运动功能。二者的联合治疗不仅可以通过改变脊髓运动神经元、中间神经元的兴奋性以及增加脊髓内KCC2的含量来减轻脊髓损伤后的肌肉痉挛,也可以显着改善后肢的运动功能。3.相比于wt AAV9,AAV-CPP.16在多种品系小鼠及食蟹猴体内均具有更高的血脑屏障穿透效率和大脑细胞转染效率,并且随着病毒剂量的提升,其效率也随之显着提升。4.经静脉内或侧脑室给药后,相对于AAV9,AAV-CPP.16将基因传递给成年小鼠脊髓及运动神经元的效率均显着提高。5.静脉注射AAV-CPP.16不会带来明显的DRG与肝脏毒性,但是会引起外周组织的大量暴露;而在侧脑室给药途径下,极高传递效率的AAV-CPP.16不会造成明显的DGR毒性,其对外周组织也几乎不具有暴露毒性。
刘晓云[2]（2021）在《3D打印技术构建干细胞仿生支架用于软骨及脊髓损伤修复的研究》文中进行了进一步梳理3D打印技术以生物材料、细胞等生物活性分子为单元,能够精确、高效地构建复杂、个性化的仿生功能性支架。近些年来已经成为组织工程以及再生医学领域的研究热点。但是目前利用3D技术进行组织工程修复还存在一定局限性,例如生物材料缺乏良好的打印性、力学性能与天然组织器官不匹配以及诱导细胞发挥作用的生物功能有限等。针对目前软骨及脊髓损伤修复存在的难题,本博士论文利用3D打印技术通过构建个性化仿生三维支架来模拟不同组织的微环境,有效诱导干细胞的增殖与分化,从而在体内外环境下,研究其在软骨以及脊髓损伤修复中的潜在应用价值。本论文主要研究可分为三部分:1、为了构建生物功能、力学性能双重仿生支架用于关节软骨修复,通过3D打印技术构建聚己内酯（PCL）加固的具有微孔道结构的羟丁基壳聚糖-纳米短纤维（HBC-NF）复合水凝胶模拟关节软骨微环境以及力学强度,调控人间充质干细胞（hMSCs）存活和分化,从而实现对软骨组织损伤的修复。实验结果表明,HBC-NF具有良好的生物相容性,在体外培养环境下能够有效促进hMSCs的增殖。更重要的是,所制备的HBC-NF水凝胶内部拓扑结构可以促进细胞间的相互作用,增强软骨分化早期的“聚合作用”,从而显着提高hMSCs的软骨分化能力。与此同时,利用3D打印技术构建PCL网格骨架以及支架内部的微孔道,提高整个支架的力学性能以及物质交换能力。实验证明该复合支架具有与软骨相似的力学性能,同时能在体内很好地诱导软骨的形成,有望在未来实现对关节软骨的有效修复。2、脊髓损伤是一种严重的致残性损伤。利用生物3D打印技术,将生物材料与神经干细胞（NSCs）相结合,精确控制细胞的密度与分布,构建具有生物活性的支架,模仿天然脊髓的结构与功能,可以有效修复脊髓损伤。基于上一研究的发现,HBC具有良好的可打印性能,本研究利用HBC、透明质酸以及基质胶组合的新型生物墨水。该生物墨水可实现20 s快速成胶以及自动二次交联,从而实现“一步法”生物3D打印,构建NSCs脊髓仿生支架,从而解决目前NSCs生物3D打印中打印过程繁琐、细胞存活率低、细胞-支架相互作用弱等问题。实验表明,打印后的NSCs存活率高（>95%）,优化的支架微环境能够加强细胞-支架相互作用,诱导NSCs向神经元分化,形成神经网络。利用生物3D打印技术构建脊髓样支架,移植到全横断脊髓损伤大鼠模型中,在脊髓损伤处实现神经元再生,降低胶质瘢痕沉积,从而明显改善了大鼠的后肢运动能力。该工作有望用于脊髓损伤以及神经相关疾病的治疗和再生修复。3、在NSCs生物3D打印仿生支架的基础上,第三部分的研究进一步探究药物小分子对NSCs分化的作用,通过构建功能性神经支架,负载并缓释诱导小分子更好地促进NSCs的神经元分化。本章研究首次探讨了 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶抑制剂OSMI-4小分子对NSCs分化的影响及其分子机制。实验结果表明,OSMI-4能够通过抑制NSCs的Notch通路,促进细胞向神经元分化。利用甲基丙烯酰化明胶与丙烯酰环糊精构建超分子水凝胶,制备可生物3D打印的生物墨水,该墨水具有良好可打印性,打印后的支架能够提高细胞-支架相互作用,有利于NSCs在支架内部的粘附以及增殖。更重要的是该水凝胶能够负载并缓释疏水性OSMI-4小分子,诱导NSCs向神经元分化。动物实验表明,该功能支架能够促进脊髓损伤处神经元再生以及轴突生长,从而明显改善脊髓损伤大鼠的后肢运动能力,为脊髓损伤治疗提供新的治疗策略。
蒋玲丽[3]（2021）在《小RNA转录组分析大鼠脊髓完全横断对坐骨神经损伤修复早期的影响》文中指出目的:为了探究脊髓损伤对周围神经损伤修复早期的影响,建立了SD大鼠坐骨神经横断模型组（PNI组）和脊髓完全横断联合坐骨神经横断模型组（SCI组）,通过检测两组模型坐骨神经损伤修复早期的神经残端华勒变性情况,以及使用小RNA转录组测序分析两组之间差异表达的miRNA,筛选出脊髓调控周围神经损伤修复早期可能的miRNA。方法:（1）建立SD大鼠PNI组和SCI组模型,分别在第0天、3天和7天观察两组模型神经断端的情况;（2）分别取两组模型第0天、3天和7天坐骨神经远端神经残端进行组织病理染色及透射电镜检测,评估脊髓横断对周围神经损伤修复早期华勒变性的影响;（3）取两组模型第3天和7天的坐骨神经远端残根进行小RNA转录组测序,使用生物信息学分析高通量测序数据,筛选两模型组之间差异表达的miRNA,并对它们预测到的候选靶基因进行功能分析;（4）对筛选出的miRNA进行qPCR验证其相对表达量,对miRNA的作用靶点进行预测,并分析蛋白互作关系。结果:（1）成功建立了坐骨神经横断模型和脊髓完全横断联合坐骨神经横断模型,在第0天、3天和7天对神经大体进行观察,发现在同一时间点坐骨神经横断组的神经远端残根较脊髓完全横断联合坐骨神经横断组肿胀、柔软,脊髓完全横断联合坐骨神经横断组神经肿胀不明显,神经质地与第0天（对照组）时类似;（2）通过HE染色、髓鞘甲苯胺蓝染色、髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫荧光染色等病理染色以及透射电镜,发现PNI组的华勒变性程度显着高于SCI组,且PNI组华勒变性发生时间更早;（3）血小板-内皮细胞粘附分子（CD31）免疫组化染色结果显示,随着神经损伤后修复时间增加,PNI组神经内血管数量逐渐增多,血管口径逐渐增大,而SCI组神经内的血管在数量和口径大小上变化均不明显;（4）小RNA转录组测序数据分析显示,在坐骨神经横断后第3天,PNI组与SCI组之间筛选出30个差异表达的miRNA,其中有13个为上调,17个发生了下调;筛选到第7天差异表达的miRNA有6个,其中4个上调,2个下调;（5）经qPCR验证,两模型组的miR-134-5p和miR-142-5p表达趋势与高通量测序结果一致,均为PNI组相对于SCI组高表达结论:（1）脊髓完全横断后周围神经损伤修复进程受到影响;（2）miR-134-5p和miR-142-5p在脊髓调控周围神经损伤后修复早期华勒变性启动及进展中可能发挥着重要作用。
郑超然[4]（2021）在《Sigma1R对大鼠脊髓运动神经元的功能影响及肝细胞癌中SNHG1基因调控网络的研究》文中研究说明肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophiclateral sclerosis,ALS）,是一种影响脊髓和大脑运动神经元（Motorneuron,MN）的神经退行性疾病。其特征是在疾病过程中患者上（UMN）、下（LMN）运动神经元发生退行性变性,可导致多个脑区（包括大脑皮层运动区、脑干和脊髓部分）中的运动神经元丧失功能,进而影响肌力、呼吸、吞咽等功能,最终致使患者瘫痪以及死亡。ALS引起的神经元功能障碍导致的突触传递异常,神经元兴奋-抑制平衡失衡对于神经元影响深远,因此,了解在ALS病程中脊髓运动神经元是如何受到影响,能否通过其他途径来弥补以改变疾病的病程,能为推进疾病治疗方法的进步提供思路。Sigma1R是一种较小的（仅28 KDa）、高度保守的跨膜蛋白,位于运动神经元突触后C-终末的下池（Subsurfacecisternae）,通常特异性地在线粒体相关膜（MAM）区域的内质网膜上富集。在动物体内,Sigma1R选择性高表达于神经系统,尤其是脊髓的运动神经元中。研究显示Sigma1R的缺失突变可导致一种被称为ALS16的神经退行性疾病或者其它类似的运动神经元缺陷。此外,即使在非Sigma1R突变的病例中,Sigma1R也被发现参与ALS的发病。我们认为,Sigma1R在神经系统中可能参与介导神经发生等一系列过程的调节,并广泛参与疾病病程中的各种细胞过程。我们的前期实验已经验证Sigma1R敲除的大鼠表现出神经损伤相关的表型,随后我们分离大鼠背部的脊髓,采用RNA-seq技术进行对照组（野生型组）和基因敲除组（Sigma1RKnockout组）的转录组学研究。最终得到在Sigma1R-/-中上调的基因为551个,下调的基因为674个。通过Sigma1R敲除后上调基因的KEGG功能富集分析我们发现HVP感染过程和PI3K-Akt信号通路相关基因功能的富集。通过Sigma1敲除后分析下调基因的KEGG功能富集发现钙信号通路和γ-氨基丁酸等相关功能的富集。通过Sigma1R敲除后上调基因的GO功能富集分析我们发现,神经元鞘和轴突鞘相关功能的富集。通过Sigma1R敲除后下调基因的GO功能富集分析可以检测到大量神经递质和突触相关功能的富集。在对Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元的影响进行研究的过程中,我们以脊髓腹角运动神经元的数量作为体现相应的脊髓目标脑区的功能受损程度的重要指标。尼氏染色结果显示,在敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元在六月龄时就已经存在数量减少,细胞体积萎缩的现象,该现象会随着年龄的增加而愈趋严重,在一年龄时神经元的数量显着降低,神经元的胞体体积也显着降低,提示敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元会发生进行性的退行,这种现象可能是Sigma1R基因参与神经退行性疾病的病理生理过程的重要证据之一。通过对突触囊泡糖蛋白（SV2B）的标记显示,在敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元胞体上的兴奋性突触连接数量显着减少,其原因可能与神经元的数量整体减少有关;同时神经元的突触发生和损伤修复功能的弱化也有可能导致神经元突触末梢的发育和维持发生障碍,从而无法将兴奋性突触的数量维持在原本的水平。随后我们使用透射电镜方法对脊髓运动神经元突触的超微结构进行了观察,结果显示,在敲除Sigma1R基因后,大鼠脊髓运动神经元突触中突触前活性带的长度没有显着变化,突触间隙变宽,突触后致密区显着增厚,提示Sigma1R敲除对神经元突触前释放递质的能力影响不大,但会使突触可塑性降低。电生理技术是研究神经元生理学活动的直接手段。通过对急性分离脊髓脑片进行膜片钳记录,我们得出以下结论,Sigma1R敲除大鼠和野生型大鼠相比:（1）脊髓腹角运动神经元的兴奋性明显增高,静息膜电位明显降低,膜电阻无显着变化,被给予电流刺激之后所产生的动作电位的最大幅度明显增高。（2）动作电位的幅度略小,峰型更宽,复极化所需要的时间更长,并且后超极化电位更小,指示钾离子流出过程的减慢。（3）激发动作电位的频率普遍更高,指示Sigma1R敲除能使神经元更易兴奋,且兴奋水平更高。（4）PSC频率显着更高,说明在正常生理条件下其囊泡释放的数量更多,提示更频繁的突触前活动;而PSC的幅度在两者间没有显着差异,说明两者在正常生理条件下突触后受体水平方面差别不大。（5）mEPSC频率略高于野生型,说明在没有动作电位的作用下其囊泡释放的数量更多,提示更频繁的突触前活动;mEPSC幅度显着升高,说明缺失Sigma1R基因的神经元的兴奋性突触后受体水平和反应能力的升高;电流峰面积更大,说明突触后对信号接受能力更强。在上述研究之外,我们对肝细胞性肝癌（HCC）患者的GDC数据进行了整理和挖掘,寻找其中关键的lncRNA-miRNA-mRNA网络和竞争性内源RNA（ceRNA）。我们发现SNHG1在HCC患者中过表达。SNHG1的上调与几种主要生物学功能的富集有关,包括细胞增殖,转录和蛋白质结合。小核仁RNA宿主基因1（SNHG1）,E2F8（E2F转录因子8）,FANCE（FA互补组E）和LMNB2（编码lamin B2）的表达趋势相似。在与SNHG1相关的网络中,SNHG1（对数秩p值=0.0643）,E2F8（对数秩p值=0.000048）,FANCE（对数秩p值=0.00125）和LMNB2（对数秩p）的高表达水平值=0.0392)与低生存率显着相关。单细胞分析表明,E2F8可能参与肿瘤发生或癌症发展。
李芳[5]（2021）在《ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究》文中认为研究背景脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是指由于外界直接或间接因素导致的中枢神经系统疾病,受累神经细胞的结构和功能受损,最终导致损伤部位以下运动功能和感觉的缺失,严重影响患者生活质量,降低患者生命预期,给家庭和社会带来沉重的负担。由于神经细胞的再生能力较低,损伤后微环境改变等不良因素,脊髓损伤治疗预后较差,使脊髓损伤的治疗成为了世界性的医学难题。传统的脊髓损伤治疗方法手术减压、药物对症治疗及术后康复治疗,不能促进神经细胞和轴突的再生,没有从根本上恢复神经功能,因此需要联用新的有效治疗方法共同作用。随着近几年分子生物学和细胞生物学研究的巨大进步,细胞移植作为脊髓损伤的一种新型治疗手段受到了广泛关注和研究,间充质干细胞（mesenchymal stromal cells,MSCs）由于其低免疫原性,体外容易培养,能分泌大量生物活性分子,成为研究的热点。体内外实验表明,脂肪来源的间充质干细胞（adipose tissue-derived stromal cells,ADSCs）移植在治疗脊髓损伤中具有良好的应用前景。在脊髓损伤动物模型中,与骨髓间充质干细胞相比,脂肪来源的间充质干细胞体内移植到脊髓损伤部位时具有更高的存活率。也有研究表明,ADSCs可以通过分泌细胞因子和生长因子,促进轴突再生,减少炎症细胞的浸润和空洞形成,从而促进脊髓损伤的恢复。尽管已有研究证明ADSCs在治疗脊髓损伤中的作用,但ADSCs促进脊髓损伤修复的具体机制尚不完全清楚。Torres-Espin等研究发现,大鼠脊髓损伤后MSCs体内移植可促进前胶原赖氨酸-2-酮戊二酸 5-双加氧酶 2（procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2,PLOD2）表达,PLOD2可能通过促进胶原纤维的交联和细胞外基质重塑起到组织修复的作用。越来越多的研究表明,在肿瘤的侵袭和迁移过程中,HIF-1α、TGF-β1 和 microRNA-26a/b 等分子通过 PI3K-AKT、TGF-β/Smad 信号通路,调控PLOD2的表达。但是PLOD2在治疗脊髓损伤中发挥的作用,目前还未见文献报道。ADSCs可以通过分泌多种细胞因子促进脊髓损伤的修复,TGF-β1作为ADSCs分泌的重要因子,具有抗炎、修复和神经保护功能。ADSCs能否通过分泌TGF-β1,上调PLOD2的表达,进而促进脊髓损伤的恢复,成为本研究的重点。本研究分为三个部分,第一部分:ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用,第二部分:ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复,第三部分:ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复。第一部分ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用研究目的1.从人脂肪组织中分离培养间充质干细胞,通过成脂成骨分化能力和细胞表面标志的表达对其进行鉴定。2.培养PC12细胞和大鼠皮质神经元原代细胞,体外建立神经细胞机械损伤模型。3.体外建立ADSCs和损伤神经细胞共培养体系,通过相关检测,明确ADSCs对损伤神经细胞的修复作用,以及PLOD2在ADSCs治疗神经损伤中的表达变化。研究方法1.ADSCs的分离培养及鉴定间充质干细胞从健康志愿者脂肪组织培养获得。P3-P5代的细胞用于后续实验。ADSCs经成脂成骨诱导分化后,Oil Red O染色,观察成脂诱导分化情况,Alizarin Red S和Von Kossa染色,观察成骨诱导分化情况。流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况。2.神经细胞机械损伤模型制备（mechanical injury,MI）150ng/mLNGF诱导PC12细胞向神经细胞分化,MAP2染色鉴定。取Wistar新生鼠大脑皮质,分离培养原代神经细胞,NeuN染色鉴定。使用10ul枪尖于6孔板内“井”字划割,造成神经元机械性损伤。3.ADSCs共培养对损伤神经细胞的影响ADSCs接种Transwell上室,每孔接种3×105细胞,接种24h后与机械损伤的PC12细胞或大鼠皮质神经元共培养3天,EdU实验检测ADSCs对神经细胞的促增殖情况。微板试剂盒检测细胞培养上清中LDH表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2和神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达。研究结果1.ADSCs的分离培养及鉴定镜下观察从脂肪组织中分离出的细胞,呈典型的成纤维样梭形细胞;经成脂和成骨诱导培养基诱导分化后,Oil Red O染色成阳性,表明ADSCs具有成脂分化的能力,Alizarin Red S和Von Kossa染色成阳性,表明ADSCs具有成骨分化的能力;流式细胞仪检测其表面抗原的表达,结果显示ADSCs高表达CD13、CD44、CD73、CD90 和 CD105,低表达 HLA-DR、CD34 和 CD45。2.神经细胞的培养及鉴定PC12细胞经150ng/mL NGF诱导分化5-7天后,有神经突起长出,细胞形态类似于神经细胞,MAP2染色结果阳性。大鼠皮质神经元体外培养6-8天,细胞体较小,从胞体延伸出轴突和树突,轴突细长,NeuN染色结果阳性。3.ADSCs共培养促进损伤神经细胞的修复ADSCs与损伤神经细胞共培养三天,结果显示神经细胞伤口愈合率显着升高;EdU结果显示,ADSCs共培养能促进大鼠皮质神经元的增殖;LDH检测结果显示,ADSCs共培养可以抑制神经细胞LDH的释放;qRT-PCR和western blot结果显示,ADSCs共培养可以促进PLOD2和神经细胞相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。研究结论1.我们成功地从脂肪组织中分离出间充质干细胞。2.ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞伤口愈合率,促进大鼠皮质神经元的增殖。ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。提示ADSCs可能通过提高神经元的存活率,促进神经细胞生长和轴突再生,减少胶质瘢痕的形成而促进损伤神经细胞的恢复。3.神经细胞机械损伤以后,PLOD2表达降低,ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞PLOD2的表达。第二部分ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复研究目的1.通过米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测抑制PLOD2表达对ADSCs神经修复作用的影响。2.ELISA检测共培养体系中TGF-β1的表达情况,同时使用外源性TGF-β1作用于损伤的神经细胞,明确TGF-β1的神经修复作用。3.SB431542 抑制 TGF-β1/Smad 信号通路,LY294002 抑制 PI3K/AKT 信号通路,明确PLOD2具体的信号调控通路。研究方法1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测PLOD2下调对ADSCs神经修复作用的影响不同浓度米诺地尔（0.25mM,0.5mM,1.0mM）作用于PC12细胞,筛选米诺地尔抑制PLOD2表达的最佳作用浓度。在ADSCs与神经细胞共培养体系中加入米诺地尔,免疫细胞化学技术、EdU实验和LDH释放实验检测抑制PLOD2基因表达对ADSCs神经保护作用的影响,qRT-PCR和western blot检测PLOD2以及神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达变化。2.TGF-β1对受损神经细胞的修复作用ELISA检测损伤神经细胞及ADSCs共培养上清中TGF-β1的表达。外源性TGF-β1（浓度分别为 0.31,0.62,1.25,2.5,5.0,10,20 ng/mL）作用于划痕损伤的 PC12 细胞,qRT-PCR 和 western blot 检测 PLOD2、P-AKT、AKT、P-Smad3和Smad2/3的表达变化。3.抑制TGF-β1/Smad、PI3K/AKT信号通路,对PLOD2表达的调控ADSCs与损伤神经细胞共培养体系中加入SB431542,抑制TGF-β1/Smad信号通路。PC12细胞经NGF诱导分化后,加入LY294002抑制PI3K/AKT信号通路。ELISA检测上清中TGF-β1的表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2、TGF-β1、P-Smad3、Smad2/3、P-AKT、AKT 和神经相关分子 MAP2、NSE、GAP43、GFAP的表达变化。研究结果1.抑制PLOD2的基因表达,体外实验结果显示ADSCs的神经细胞修复作用减弱根据qRT-PCR及western blot结果,我们最终确定米诺地尔实验浓度为0.5mM。在共培养体系中,MAP2的免疫荧光染色结果显示,抑制PLOD2表达,ADSCs的神经修复作用减弱。EdU结果显示,米诺地尔可以降低ADSCs对大鼠皮质神经元增殖的刺激作用。LDH释放实验表明,米诺地尔可增加共培养体系中LDH含量。qRT-PCR和western blot实验进一步证实,米诺地尔可以抑制神经细胞PLOD2、MAP2、NSE和GAP43的表达,促进GFAP表达。2.TGF-β1在修复神经细胞损伤中的作用ELISA检测结果显示,ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞培养上清中TGF-β1含量。qRT-PCR和western blot检测结果显示,外源性TGF-β1作用于划痕损伤的PC12细胞,低浓度TGF-β1（0.31-2.5 ng/mL）促进PLOD2的表达,当TGF-β1浓度达到5 ng/mL时这一作用减弱,当TGF-β1浓度为10和20 ng/mL时则抑制PLOD2表达。Western blot检测结果显示,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.TGF-β1/Smad信号通路在ADSCs促进损伤神经细胞修复中的作用共培养体系中加入SB431542可以降低共培养上清中TGF-β1的含量,抑制神经细胞TGF-β1、P-Smad3和PLOD2的表达,降低神经相关分子MAP2、NSE、GAP43的表达,提高GFAP表达水平。加入LY294002抑制P-AKT表达后,PLOD2表达下降。上述结果进一步证实了 AKT信号通路可以调控PLOD2的表达,但是当低浓度TGF-β1存在时,PLOD2主要受TGF-β1/Smad信号通路调控。研究结论1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2基因表达后,ADSCs的神经细胞修复作用减弱,提示PLOD2在ADSCs修复神经细胞损伤中发挥重要作用。2.ADSCs共培养可以增加细胞培养上清中TGF-β1的含量,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3和PLOD2的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.体外实验显示SB431542抑制TGF-β1/Smad信号通路后,降低ADSCs神经修复作用及PLOD2表达。ADSCs通过分泌低剂量TGF-β1,激活Smad3信号通路促进PLOD2表达,发挥神经修复作用。第三部分ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复研究目的1.建立脊髓损伤动物模型,体内实验验证ADSCs输注对脊髓损伤动物模型的治疗作用。2.大鼠体内输注SB431542,验证ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路促进脊髓损伤功能恢复的作用。研究方法1.大鼠脊髓损伤模型制备大鼠腹腔麻醉后,以大鼠T8-T10棘突为中心取后正中切口切开,剥离并咬除棘突、椎板暴露脊髓,血管夹夹击脊髓30s,建立脊髓损伤模型。2.实验分组脊髓损伤模型制备成功3天后,大鼠分别给予PBS、ADSCs和SB431542原位注射。实验具体分为5组:假手术组,PBS对照组,ADSCs治疗组,ADSCs治疗+SB431542 组,SB431542 组。3.ADSCs输注对脊髓损伤的治疗作用在治疗后 3、7、14、21、28 天根据 BBB（Basso,Beattie,and Bresnahan）量化评分标准对所有动物运动功能进行评定。大鼠心脏取血,离心收集血清,ELISA检测血清中TGF-β1的含量。移植后3天随机取各组动物,取出脊髓组织,4%多聚甲醛固定,制作石蜡和冰冻切片,进行HE染色,尼氏染色,免疫组织化学染色检测脊髓组织中MAP2的表达。取出治疗3天后的脊髓组织,提取总RNA和总蛋白。qRT-PCR和western blot检测神经细胞相关分子（MAP2、NSE、GAP43和 GFAP）和 PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和 Smad2/3 的表达变化。研究结果1.ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以促进大鼠运动功能的恢复,减少脊髓病变体积及空泡的形成,增加尼氏小体数量,促进脊髓神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43表达,抑制GFAP表达。2.ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以显着提高大鼠血清中TGF-β1的含量,促进脊髓神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3的基因和蛋白表达。抑制剂SB431542输注明显抑制ADSCs对大鼠运动功能的恢复作用,脊髓组织结构损伤加重,神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和神经相关分子（MAP2、NSE、GAP43）表达降低,GFAP表达增加,ADSCs的神经修复作用减弱。研究结论1.脊髓损伤动物实验研究结果显示,ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复,同时也能促进神经元的存活,促进损伤结构的恢复。2.体内实验表明,ADSCs的治疗作用会被SB431542抑制。体内实验进一步证实ADSCs通过激活TGF-β1/Smad3信号通路促进神经细胞PLOD2表达,从而促进脊髓损伤的修复。
刘良乐[6]（2021）在《新型复合释氧支架的构建及促进大鼠脊髓损伤修复的实验研究》文中研究指明研究背景:脊髓损伤后复杂的微环境变化,使得内源性修复再生的能力非常有限。虽然组织工程材料的植入在治疗脊髓损伤实验中取得了一定的进展,然而,局部损伤部位的缺氧、缺血影响了细胞的存活,也严重制约了组织工程材料的植入修复效果。因此,如何改善局部缺氧,减轻局部继发性组织损害,促进神经修复已成为学者关注的焦点。目的:本研究旨在前期研究基础上构建一种新型复合释氧支架,测定其释氧特性、对细胞存活增殖的影响,同时将其植入大鼠脊髓损伤部位,探究其对脊髓功能修复的效果,为新型释氧支架的研发与临床转化提供一定的实验基础。方法:1.构建新型复合释氧支架:首先采用双乳化法以CPO和PLGA为原材料制备缓释微球,然后搭建自组装多肽水凝胶,接着将释氧微球按比例均匀混入凝胶中,即可获得新型复合释氧支架。通过扫描电镜观察支架的微观形态,测定其释氧曲线。2.释氧支架对细胞存活与增殖的影响:在1%低培养氧箱中,培养含GFP-MSCs的释氧支架材料,观察细胞的存活情况;CCK法测定细胞的活性、增殖情况。3.释氧支架对大鼠脊髓损伤的修复作用:首先建立大鼠急性脊髓损伤模型,在缺损处植入释氧支架,于术后12内周行大鼠运动功能BBB评分,并取材行组织学和免疫学检测。结果:1.释氧微球直径约275μm～600μm,平均329.5±35.2μm,在光镜下呈圆形、不透明和淡黄色形态,在扫描电镜下呈球形、多孔的形态,通过显微切割,可见CPO均匀分布于PLGA中。在扫描电镜下,可见大小不一的微球均匀分布于多肽水凝胶中,构成复合释氧支架。2.新型释氧支架释氧持久而稳定,时间超过3周,约在12天后达到一个平台期。3.低氧培养下,可见GFP-MSCs黏附并分布于支架的各个层面,生长良好。在7、14、21天,支架组细胞增殖活性显着优于低氧凝胶组和低氧细胞组（P<0.05）。4.支架材料植入脊髓损伤区域12周后,大鼠BBB评分达到11.8±1.26,优于SCI组和凝胶组（P<0.05）;支架组HE染色显示材料空腔显着缩小;免疫荧光染色显示支架组NF增加,GFAP下降;vwf染色显示支架组新生血管增加,均优于其他两组（P<0.01）。结论:1.本实验通过双乳化法制备了 PLGA-CPO释氧微球,并进一步复合自组装多肽水凝胶,构建了新型复合释氧支架。2.新型复合释氧支架具有良好的释氧性能,释氧时间超过3周,能满足细胞低氧存活、增殖的要求。3.新型复合释氧支架能够缓解局部组织缺氧状态,促进神经纤维和血管再生,从而改善脊髓损伤后大鼠后肢运动功能。
董万亮[7]（2020）在《骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6通路促进脊髓损伤修复的作用及机制研究》文中认为脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是脊髓由于外力撞击、压迫等直接或间接因素造成的一种严重的神经损伤性疾病。SCI常在脊髓原发性损伤的基础上,继发缺血、水肿、缺氧、炎症反应、钙超载等病理过程,导致运动功能丧失和SCI后相应节段下的感觉异常[1]。运动功能的丧失以及感觉异常,严重的影响了患者的生存质量,并给患者的家庭带来了沉重的经济负担。目前该病发病率呈逐年上升的趋势[2],且针对脊髓损伤尚无十分有效的治疗方法,大部分治疗以对症治疗为主,因此临床上急需可以改善脊髓损伤后病情的发展和预后的新的治疗方法。近年来,干细胞的生物治疗逐渐引起人们的关注,并在再生医学领域的研究和临床治疗中得到广泛的应用。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是一类具有自我更新能力和多项分化潜能的成体干细胞,它来源广泛,且具有低免疫原性的特点,是组织工程修复的理想移植物。MSCs作为公认的抗炎症反应屏障,是目前SCI细胞移植治疗的最佳选择。大量的文献报道显示MSCs移植在SCI的治疗中有着积极的效应。研究发现,MSCs不仅可以抑制SCI后损伤局部的炎症反应和细胞凋亡情况,还可以促进损伤处轴突及血管的生成;也有文献发现,MSCs可以减少星形细胞疤痕和组织空洞,促进运动功能恢复,但具体机制尚不清楚。在MSCs的临床应用中,存在着细胞移植后存活率低,疗效不稳定等问题。而MSCs上清中提取的外泌体治疗SCI有很大优势,外泌体在血液、培养基中更加稳定,利于保存,易于质量管理,更加安全、体积小不易堵塞血管,不会诱发或者产生肿瘤,它是纳米级载体,可以有选择地到达炎症部位。外泌体是细胞外小泡的一种,在细胞与细胞间的通讯中起着重要作用,MSCs上清中提取的外泌体治疗SCI是通过基因信息和交换蛋白的方式为解决这些问题提供了新思路,促进细胞间的信息交流。外泌体在自然界中的来源及其分布比较广泛,大多数哺乳动物当中都可以分泌,在各种体液中也存在分布,不同的细胞分泌的外泌体有差异,尤其在发生疾病时,正常细胞分泌的外泌体和病态分泌的外泌体成分差别很大。因此对提高MSCs来源的外泌体治疗效果具有重要意义。肿瘤坏死因子α刺激基因-6（Tumor necrosis factor α stimulated gene 6,TSG-6）编码的分泌性蛋白是一种保护性的炎症反应因子,它通过与透明质酸、硫酸软骨素或蛋白多糖结合,介导炎症细胞迁移、黏附与免疫调节和细胞外基质重塑,进而发挥炎症调控作用[3]。重组TSG-6蛋白已应用于多种疾病模型的研究,并表现出了有效的抗炎作用。最近的研究发现,重组人TSG-6局部应用可减轻多种疾病的炎症反应和病理表现[4]。而TSG-6已被证明可在MSCs中表达,并在MSCs移植治疗一些疾病中,发挥了重要作用[5]。因此,明确TSG-6是否在MSCs来源的外泌体移植治疗中发挥关键作用,并以此为基础对MSCs来源的外泌体进行修饰,提高MSCs来源的外泌体移植治疗SCI的效果,对于临床MSCs来源的外泌体移植治疗SCI,有着指导意义。第一部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体对脊髓损伤的影响目的外泌体（exosomes）是近年来新发现的细胞与细胞相互作用的重要手段。它们是纳米级小囊泡（30-150纳米）,内含复杂的RNA和蛋白质,可以通过膜受体和其他方式结合到靶细胞。外泌体参与生物信息的调节;各种细胞在正常和病理条件下都能分泌外泌体。外泌体主要来源于细胞内溶酶体微粒形成的多胞体,通过多胞外膜与细胞膜融合释放到细胞外基质中。大量研究表明,移植的间充质干细胞来源的外泌体具有良好的治疗效果,在神经系统损伤的修复中起着关键作用。在该研究中,分离来自骨髓间充质干细胞（BMSCs）的外泌体并通过尾静脉移植到大鼠SCI模型中。观察移植前后大鼠SCI模型的行为学和组织学变化,初步观察尾静脉注射BMSCs外泌体对SCI的治疗作用。方法1.从大鼠骨髓中原代分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）;2.采集BMSCs细胞培养上清液。用试剂盒提取外泌体。并利用透射电镜观察外泌体的形态。蛋白质印迹法鉴定外泌体表面标记蛋白;3.将30只大鼠随机分为三组,每组分别10只:假手术组、手术对照组和外泌体组。外泌体组大鼠术后1h静脉注射500μl外泌体,手术对照组大鼠术后1h静脉注射500 μl无菌磷酸盐溶液。4.通过BBB评分法和斜板实验评估术后各组大鼠的运动功能;5.通过Nissl染色、HE染色和LFB染色观察脊髓组织形态。结果1.透射电镜结果显示,上清中提取的外泌体,显示出大量具有圆形或椭圆形形状的囊泡状结构。囊泡周围的膜结构明显。尺寸相对均匀,直径约为40-100nm。2.Western Blot检测结果显示CD9和CD63呈阳性,鉴定提取物,确定其为外泌体。3.各组大鼠术前行为学评分均位于正常水平。术后外泌体组以及手术对照组BBB评分和斜板评分均明显低于假手术组（p<0.05）。外泌体注射7天后,外泌体组的BBB评分以及斜板评分高于手术对照组（p<0.05）,且差异具有统计学意义。4.移植后D28结果显示,Nissl染色、HE染色和LFB染色发现假手术组的脊髓形态结构正常,手术对照组大鼠体内Nissl体减少,炎性细胞浸润,髓鞘丢失明显。与手术对照组相比,外泌体组脊髓组织内Nissl体增多,炎性细胞浸润减少,髓质减少,减少了鞘层损耗。结论骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以减轻脊髓损伤后的组织损伤程度,促进神经运动功能的恢复。第二部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗脊髓损伤的基因表达谱分析目的本研究中我们制作大鼠脊髓损伤模型后利用转录组测序技术,建立大鼠脊髓损伤及骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗的基因表达谱分析。在转录组测序中,可以通过将读数的数量映射到基因区域来估计基因表达水平,但读数的数量不仅与基因表达水平成正比,而且与基因本身的长度和测序数据的数量成正比。为了使不同基因和不同样品之间的基因表达水平相当,将读数转化为FPKM（每百万映射读数的外显子模型的片段每千克碱基）以标准化基因表达。方法SD大鼠（SPF级）,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,利用美国PSI公司,型号IH-0400撞机仪制作大鼠脊髓损伤的模型,20g的撞击棒,在4.5cm处自由落体撞击T10椎体层面脊髓中央,造模成功的标志性为,大鼠双下肢抽搐,尾巴甩向一侧,出现双下肢的瘫痪。从损伤脊髓中提取总RNA,以脊髓中心为中点,上5mm,下5mm。采用转录组测序技术扫描总RNA,获得脊髓损伤后大鼠差异mRNA表达谱从。大鼠骨髓中原代分离骨髓间充质干细胞（MSCs）;采集MSCs细胞培养上清液。用试剂盒提取外泌体。并利用透射电镜观察外泌体的形态。蛋白质印迹法鉴定外泌体表面标记蛋白;将12只大鼠随机分为四组,每组分别3只:假手术组、手术对照组、骨髓间充质干细胞组和外泌体组。外泌体组大鼠术后1 h静脉注射500 μl外泌体,手术对照组术后1h静脉注射500 μl无菌磷酸盐溶液,骨髓间充质干细胞组大鼠术后1 h静脉注射500 μ1骨髓间充质干细胞。并于术后24h,通过透射电镜观察外泌体在脊髓组织中的分布情况;成功建立大鼠脊髓损伤模型,并对提取的总RNA进行质量评价,质量可靠。采用转录组测序技术获得脊髓损伤后大鼠mRNA的差异表达谱。观察差异性表达基因数目,并制作基因聚类分析热图。结果通过差异基因筛选并文献查阅,从中选定TSG-6基因进一步研究,测序结果显示,TSG-6在手术对照组中表达比假手术组显着降低;脊髓损伤大鼠经外泌体治疗后,该基因表达水平较手术对照组增高,低于假手术组。结论TSG-6在手术对照组和假手术之间表达有差异;而且治疗组和手术对照组之间存在差异。通过转录组测序,假手术组、手术对照组、外泌体组和骨髓间充质干细胞组之间存在基因表达水平差异。根据基因表达差异和GO功能分析及KEGG信号通路分析,结合文献阅读,选定TSG-6基因与神经损伤相关。第三部分 TSG-6在骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗脊髓损伤中的关键作用目的本研究通过沉默和高表达MSCs来源的外泌体中的TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠。观察注射前后大鼠脊髓损伤模型的行为学和组织学变化。确定TSG-6在脊髓损伤治疗中的作用。方法1.从大鼠骨髓中纯化并培养MSCs,慢病毒沉默和高表达MSCs中的TSG-6基因和鉴定,提取外泌体。将75只雄性SD大鼠分为五组,每组分别15只:假手术组,手术对照组,外泌体组,TSG-6沉默组,TSG-6高表达组。术后24h进行大鼠灌注,观察外泌体在脊髓组织中的定位和分布。其他大鼠在术后1,3,7,14和D28测试运动能力和行为的变化。同时在术后D28,通过组织切片染色观察损伤处组织形态的变化。2.术后24h观察外泌体在脊髓损伤处分布。术后D28,通过Nissl染色,HE染色和Luxol fast blue（LFB）染色观察脊髓的形态学变化。3.沉默TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠,通过BBB评分和术后各时间点的斜板实验评分观察各组神经损伤的恢复情况。4.高表达TSG-6基因,并将其外泌体注射给SCI大鼠,通过BBB评分和术后各时间点的斜板实验评分观察各组神经损伤的恢复情况。结果1.荧光显微镜观察慢病毒转染效果。采用聚合酶链反应（PCR）和蛋白质印迹（Western blot）检测转染效果。结果显示MSCs内TSG-6基因沉默和高表达成功;2.外泌体组和TSG-6高表达组大鼠脊髓损伤后BBB评分和斜板评分均显着高于手术对照组（p<0.05）,而TSG-6沉默组与手术对照组相比无显着统计学差异。脊髓损伤后第7天TSG-6高表达组BBB评分以及斜板评分均高于外泌体组（p<0.05）。3.移植后D28结果显示,Nissl染色、HE染色和LFB染色发现假手术组的脊髓形态结构正常,手术对照组和TSG-6沉默组大鼠体内Nissl体减少,炎性细胞浸润,髓鞘丢失明显。与手术对照组相比,外泌体组和TSG-6高表达组脊髓组织内Nissl体增多,炎性细胞浸润减少,髓质减少,减少了鞘层损耗。且TSG-6高表达组优于外泌体组。结论MSCs来源的外泌体可以降低脊髓损伤后组织损伤程度,促进神经运动功能的恢复,为生物移植治疗脊髓损伤提供了新的方向和思路。但是高表达TSG-6的MSCs来源的外泌体显示具有更强的治疗效果,TSG-6在MSCs来源的外泌体治疗脊髓损伤中发挥着重要的作用。
巫荣华[8]（2020）在《脊髓损伤后环状RNA和长链非编码RNA的表达谱及在星形胶质细胞中的功能初探》文中指出目的:脊髓损伤是一种致残率极高的中枢神经系统疾病,系统而全面地了解脊髓损伤过程中病理生理事件,以及相关的细胞机制和分子机制,对于制定新的治疗策略至关重要。因此,我们建立了大鼠T9半横断模型,对大鼠脊髓损伤后环状RNA、长链非编码RNA、信使RNA等进行较高密度时间点的测序分析,筛选出随时序性变化起重要调控作用的环状RNA和长链非编码RNA。然后在星形胶质细胞中进行功能初探,进一步揭示其分子机制。本课题的开展和完成将有助于从新的角度阐明脊髓损伤修复的机制,为临床治疗提供新的分子干预靶点。方法:1、制备大鼠T9半横断模型。为了全面、准确地研究脊髓损伤过程中环状RNA和长链非编码RNA的时序表达,我们选取了T9半横断后0 h、0.5 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d共11个时间点进行取材,存于液氮后送至公司进行全转录组测序（包括信使RNA,环状RNA和长链非编码RNA测序）。2、环状RNA和长链非编码RNA的鉴定。对于测序后的数据进行筛选,采用实时定量PCR对选取的环状RNA和长链非编码RNA进行表达模式的验证。选取了circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675进行进一步的功能探究。3、体外培养脊髓来源的原代星形胶质细胞。采用FISH实验检测circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675的细胞定位。设计circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675的si RNA和对照si RNA,电转染培养至P2代的星形胶质细胞。采用CCK-8法和Ed U法检测干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675对星形胶质细胞增殖的影响;采用划痕实验和Transwell小室实验检测干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675对星形胶质细胞迁移的影响;通过流式细胞仪检测干扰circRNA＿01477和LncRNALOC100909675对星形胶质细胞凋亡的影响。4、干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675后表达谱分析及验证。将circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675敲降后的星形胶质细胞提取RNA后,进行信使RNA芯片分析或测序分析。通过生物信息学分析工具进行聚类分析及蛋白互作网络分析;选取与星形胶质细胞增殖、迁移相关的基因进行实时定量PCR验证。5、体内干扰circRNA＿01477和LncRNA LOC100909675对胶质瘢痕的影响。合成si RNA或者构建AAV病毒进行脊髓损伤后T9位置原位注射。采用实时定量PCR检测干扰效率,通过免疫组织化学方法检测GFAP、NF200等的表达;采用BBB评分和TSE精细评估系统检测大鼠后肢运动功能。结果1:1、免疫组织化学结果显示成功建立了大鼠T9半横断模型。全转录组测序结果显示,在脊髓损伤后的任何时间点（第0、1、3、7、14、21或28天）,360个环状RNA均有差异表达（P<0.05）。在这些环状RNA中,有31个是外显子类型的（占8.61%）,33个是基因间的（占9.16%）,1个是内含子的（占0.28%）,295个是意义重叠的（占81.95%）。94%差异表达的环状RNA水平从第3天开始下降。2、在差异表达的外显子类型中选取了19个环状RNA进行进一步的研究。RNase R处理和经DNA测序鉴定,结果显示环状RNA特征。选取了circRNA＿01477、circRNA＿03612、circRNA＿26782、circRNA＿17645进行q RT-PCR检测。结果显示,所选环状RNA的表达水平在脊髓损伤后显着降低,其模式与RNA-seq结果一致。3、细胞核和细胞质分离实验显示,93.5%的circRNA＿01477分子在胞质中,6.5%的存在于细胞核中。FISH实验结果显示18s r RNA在胞质中表达,而circRNA＿01477在胞质和胞核中都表达。4、采用CCK-8法检测细胞活力,结果显示干扰circRNA＿01477的表达明显降低了星形胶质细胞的活力;Ed U染色结果显示干扰circRNA＿01477的表达明显抑制了星形胶质细胞的增殖。采用Transwell实验和划痕实验来验证敲降circRNA＿01477对星形胶质细胞迁移的影响,结果显示干扰circRNA＿01477的表达显着的抑制了细胞迁移。流式结果显示,敲降circRNA＿01477不会引起星形胶质细胞的凋亡。5、免疫组织化学结果显示,体内降低circRNA＿01477的表达可以减少脊髓中GFAP的表达,减少胶质瘢痕空洞的大小。6、circRNA＿01477 si RNA处理星形胶质细胞后进行表达谱芯片分析,得到差异变化的基因有1528个,其中上调的基因有633个,下调的基因有895个。对差异基因进行GO分析,结果表明,Biological Process板块中富集最多的是趋化性;Cellular Component板块富集最多的是胞外空间;Molecular Function板块富集最多的是细胞因子的活性;基于KEGG通路的顶部富集是细胞因子-细胞因子受体相互作用。7、敲降circRNA＿01477显着降低了IL6R、Ccnd3、Cxcl12、Cxcl14、Gcnt1、Inhbb1、Ntrk2基因的表达水平;抑制circRNA＿01477显着提高了mi RNA-423-5p水平,而mi R-760没有明显变化。在星形胶质细胞中过表达mi RNA-423-5p mimic,q RT-PCR检测Cxcl12、Cxcl14、Gcnt1和Ntrk2的表达,结果显示过表达mi RNA-423-5p,可以明显降低Cxcl12、Cxcl14的表达,而对Gcnt1和Ntrk2的表达没有影响。结果2:1、全转录组测序筛选到1182个差异表达的长链非编码RNA。q RT-PCR验证显示LncRNA LOC100909675在脊髓损伤后各时间点表达逐渐上调,与RNA-seq结果相似。软件分析结果表明LOC100909675不能编码蛋白质,是一个非编码RNA。2、RACE结果显示LOC100909675的全长为1270 bp。细胞核和细胞质分离实验显示,11.2%的LOC100909675分子在胞质中,88.8%的存在于细胞核中。FISH实验结果显示18s r RNA在胞质中表达,而LOC100909675主要在细胞核中表达。3、采用CCK-8法检测细胞活力,结果显示干扰LOC100909675的表达明显降低了星形胶质细胞的活力;Ed U染色结果显示干扰LOC100909675的表达明显抑制了星形胶质细胞的增殖。Transwell实验和划痕实验显示干扰LOC100909675的表达显着抑制了星形胶质细胞的迁移。流式结果显示,敲降LOC100909675不会引起星形胶质细胞的凋亡。4、免疫组织化学结果显示,体内降低LOC100109675的表达可以增加脊髓中NF200的表达,减少胶质瘢痕空洞的大小。5、BBB评分显示,注射AAV9-sh LOC100909675大鼠的后肢运动能力相对于对照组在7 d、10 d和14 d有明显的提高。进一步采用TSE精细运动评估系统评价大鼠的精细运动,结果显示,对照组大鼠髋关节的角度变化率为9.7%,注射AAV9-sh LOC100909675的为16.7%;对照组大鼠膝关节的角度变化率为13.1%,注射AAV9-sh LOC100909675的为18.9%;对照组大鼠踝关节的角度变化率为14.6%,注射AAV9-sh LOC100909675的为30.9%。6、LOC100909675 si RNA处理星形胶质细胞后进行表达谱测序分析,得到差异表达的基因1457个,其中上调表达的705个,下调表达的752个。对差异表达的基因进行GO富集分析,发现富集程度最高的是细胞周期。KEGG富集分析结果显示富集最显着的也是细胞周期。q RT-PCR验证显示,敲降LOC100909675显着降低了与细胞周期相关的基因Anxa1、Anrkb、Brca1、Bub1、Prc1、Kif11、Foxm1、Ect2、Ccna2、Skp2、Cdk1、Cdc20表达,其趋势与测序结果相似。结论:1、成功建立SD大鼠T9半横断模型,筛选到360个差异表达的circRNA和1182个差异表达的LncRNA,提示非编码RNA参与了脊髓损伤的病理生理过程。2、对其中选择的circRNA＿01477的功能和机制的研究表明:该分子主要定位在细胞质中,敲降其表达显着抑制了星形胶质细胞的增殖、迁移和愈伤能力,对凋亡没有影响;体内降低circRNA＿01477的表达可以减少胶质瘢痕空洞的大小。通过GO分析和KEGG分析,circRNA＿01477可能是SCI诱导的免疫炎症反应的重要调控因子,推测其可能通过mi RNA-423-5p-Cxcl12/Cxcl14轴来调控细胞增殖和迁移。3、对其中选择的LncRNA LOC100909675的功能和机制的研究表明:该分子主要定位在细胞核中,敲降其表达显着抑制了星形胶质细胞的增殖、迁移和愈伤能力,对凋亡没有影响;体内降低LOC100909675的表达可以促进SD大鼠后肢功能恢复。根据GO富集分析和KEGG富集分析结果,LOC100909675可能是一个细胞周期调控分子。
李贺[9]（2020）在《靶向Pim-1表达修复受损神经元样细胞的作用及机制》文中研究指明目的:中枢神经系统神经元内在再生能力不足是导致受损神经元再生和功能恢复失败的主要原因。神经元损伤后多个细胞内信号通路之间协同调节的靶基因可显着促进神经元的存活,增强神经元的内在再生能力,使受损神经元长距离轴突再生、神经回路重建和功能恢复变成可能。因而,找准靶点基因提升受损中枢神经元的内在再生能力是治疗中枢神经损伤的关键所在。莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒插入位点（provirus integration site for Moloney murine leukemia virus,Pim-1）为原癌基因,可编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是许多细胞因子及生长因子细胞内信号通路的共同下游效应分子,通过磷酸化下游蛋白质丝氨酸/苏氨酸位点,在细胞增殖、存活及凋亡等过程中发挥重要作用。基于Pim-1是多个信号通路共同下游效应分子,且对细胞的增殖及存活具有重要作用,本研究首先观察Pim-1在体外受损中枢神经元样细胞内的表达变化,睫状神经营养因子（CNTF）和神经突起素（Neuritin,Nrn1）调控下游信号通路对Pim-1表达的影响,以及这种影响对受损神经元的作用及相关机制。以Pim-1基因为靶点,用重组慢病毒（recombinant lentivirus）载体过表达Pim-1,或用Pim-1 siliencer特异性干扰Pim-1表达,探讨直接调控Pim-1表达对体外受损神经元样细胞的活性和突起再生的作用,为临床治疗中枢神经元损伤提供新的方法及其实验和理论依据。本研究还基于长链非编码RNA（long non-coding RNA,Lnc RNA）调控神经发育和损伤的相关研究以及Lnc-Pim1与Pim-1基因位点、序列的密切关系,观测Lnc-Pim1在体外中枢神经元样细胞的序列全长、表达定位、损伤后表达变化、与Pim-1相互作用关系,并以Lnc-Pim1基因为靶点,用重组慢病毒载体过表达Lnc-Pim1,或用Lnc-Pim1siliencer特异性干扰Lnc-Pim1表达,探讨调控Lnc-Pim1表达对体外受损神经元样细胞的修复作用,同时还应用CHIRP-MS和RNA-seq技术探究Lnc-Pim1发挥作用的初步分子机制。方法:（1）在体外用20μmol/ml反式视黄酸（RA）将Neuro-2a细胞诱导成为神经元样细胞（N-2a-N）;用50μmol/L去铁胺亚磺酸盐（DFO）抑制Neuro-2a细胞增殖;用1mmol/L丙烯酰胺（ACR）损伤N-2a-N细胞突起。N-2a-N细胞分为正常对照组、PBS组、300μg/L CNTF组、500μg/L Nrn1组。用Image J 6.0测量细胞突起长度,用CCK-8法检测细胞活性。免疫荧光细胞化学法检测N-2a-N细胞表型及Pim-1蛋白表达,Real-time PCR和Western blotting检测Pim-1在各组的表达变化。Western blotting检测调节Pim-1活性的相关信号转导分子（Stat-3、p-Stat-3、Erk1/2、p-Erk1/2）,细胞存活、凋亡相关分子（Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2）及轴突再生相关分子GAP-43的表达变化。（2）用RACE法获得N-2a-N细胞内Lnc-Pim1全长序列。用Phylo CSF、CPC和CNCI软件对Lnc-Pim1编码能力进行预测。用FISH法和核质分离技术检测Lnc-Pim1在Neuro-2a细胞、正常N-2a-N细胞以及受损N-2a-N细胞内的亚细胞定位。用Real-time PCR检测不同时间点受损N-2a-N细胞中Lnc-Pim1的表达变化。（3）构建Pim-1、Lnc-Pim1重组慢病毒载体,用Real-time PCR测定病毒的滴度。（4）设计Pim-1、Lnc-Pim1特异性干扰试剂Pim-1 siliencer和Lnc-Pim1 siliencer,采用Real-time PCR检测不同浓度干扰试剂对N-2a-N细胞内Pim-1、Lnc-Pim1表达的影响。（5）用MOI值为40携带杀稻瘟菌素抗性的Pim-1重组慢病毒载体感染Neuro-2a细胞,用80μg/ml的杀稻瘟菌素对重组慢病毒感染的Neuro-2a细胞进行抗性筛选。用1mmol/L ACR损伤N-2a-N细胞,实验分为Ctrl组、ACR组、LV-Blank/ACR组和LV-Pim-1/ACR组,并于损伤24 h后进行检测;用200nmol/ml的阴性对照物（Negtive control,NC）silencer或Pim-1 siliencer转染N-2a-N细胞,实验分为NC silencer组、Pim-1 silencer组,并于转染48 h后检测。倒置相差显微镜下对各组N-2a-N细胞进行拍照,并对细胞突起长度进行测量、统计。用CCK-8检测各组细胞活性,用Real-time PCR及Western blotting检测各组Pim-1基因及蛋白的表达,用Western blotting检测各组GAP-43蛋白表达。（6）用MOI值为40携带嘌呤霉素抗性Lnc-Pim1的重组慢病毒感染Neuro-2a细胞,用20μg/ml的嘌呤霉素对重组慢病毒感染的Neuro-2a细胞进行抗性筛选。用1mmol/L ACR损伤N-2a-N细胞,实验分为Ctrl组、ACR组、LV-Blank/ACR组和LV-Lnc-Pim1/ACR组,并于损伤24 h后进行检测;用100nmol/ml Lnc-Pim1 silencer转染N-2a-N细胞,实验分为NC silencer组、Lnc-Pim1 silencer组,并于转染48 h后检测。用CCK-8法检测各组细胞活性,倒置相差显微镜下对各组N-2a-N细胞进行拍照,用Image J对细胞突起长度进行测量、统计。用Real-time PCR检测Lnc-Pim1的表达,用Western blotting检测Erk1/2、p-Erk1/2的表达。（7）N-2a-N细胞用重组慢病毒载体分别过表达Pim-1和Lnc-Pim1,用200nmol/ml Pim-1 silencer和100nmol/ml Lnc-Pim1 silencer分别敲低Pim-1和Lnc-Pim1的表达,用Real-time PCR检测过表达或敲低Pim-1、Lnc-Pim1对彼此基因表达的影响。（8）用CHIRP-MS技术检测正常N-2a-N细胞内Lnc-Pim1的互作蛋白,用RNA-seq技术检测正常N-2a-N细胞Lnc-Pim1过表达或敲低所导致的差异性表达基因,分别对互作蛋白和差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析。结果:（1）细胞免疫荧光显示N-2a-N细胞表达神经元标志分子β-ⅢTubulin和Neurofilament-200,Pim-1主要表达在N-2a-N细胞的细胞质。50μmol/L DFO能有效抑制Neuro-2a细胞的增殖。用1mmol/L的ACR成功建立N-2a-N细胞突起损伤模型。N-2a-N细胞损伤后,Pim-1基因表达呈现先降低、后升高、再降低的趋势。与PBS组相比,CNTF组和Nrn1组最长神经突起所占比例明显增加,细胞内信号转导分子Erk1/2、p-Erk1/2、Stat3、p-Stat3、Pim-1表达上调,凋亡相关分子Cleaved Caspase-3、Bax表达下调,抗凋亡相关分子Bcl-2表达上调,神经突起生长相关分子GAP-43表达上调。（2）RACE法获得的N-2a-N细胞内Lnc-Pim1序列全长为2262个碱基;Phylo CSF、CPC和CNCI软件证实Lnc-Pim1具有较低的编码蛋白潜能;FISH法和核质分离技术证实Lnc-Pim1在Neuro-2a细胞、正常N-2a-N细胞以及受损N-2a-N细胞内主要表达于细胞质,少部分表达在细胞核。N-2a-N细胞损伤后,Lnc-Pim1基因表达呈现出先降低、后升高、再降低的趋势,变化的时相点早于Pim-1。（3）成功构建LV-Pim-1和LV-Lnc-Pim1过表达载体,LV-Pim-1滴度为2.64×108TU/ml,LV-EGFP滴度为6.82×108TU/ml;LV-Lnc-Pim1滴度为3.65×108TU/ml,LV-mcherry滴度为1.18×109TU/ml。（4）200nmol/ml Pim-1 silencer和100nmol/ml LV-Lnc-Pim1silencer可分别特异性干扰N-2a-N细胞内Pim-1和LV-Lnc-Pim1的表达。（5）MOI值为40的Pim-1重组慢病毒载体具有较高的感染率,且不影响Neuro-2a细胞活性;80μg/ml的杀稻瘟菌素能有效纯化病毒感染的Neuro-2a细胞。病毒感染的Neuro-2a细胞,经纯化5代后其感染率可达85%以上。经筛选、传代培养后的Neuro-2a细胞具有较高的Pim-1表达水平。Pim-1过表达可增强受损N-2a-N细胞的活力,上调GAP-43蛋白的表达,进而促进受损N-2a-N细胞突起再生。200nmol/ml Pim-1 silencer可导致N-2a-N细胞内Pim-1 m RNA和蛋白表达下调、细胞活性减弱、GAP-43蛋白表达下调,N-2a-N细胞突起的生长受到显着抑制。（6）MOI值为40的Lnc-Pim1重组慢病毒具有较高的感染率且不影响Neuro-2a细胞活性;20μg/ml的嘌呤霉素能有效纯化病毒感染的Neuro-2a细胞;病毒感染的Neuro-2a细胞经纯化5代后其感染率可达到90%以上。经筛选、传代培养后的Neuro-2a细胞具有较高的Lnc-Pim1表达水平。Lnc-Pim1过表达可激活Neuro-2a细胞Erk1/2信号通路,具有促进细胞分化的潜能,并能促进受损N-2a-N细胞突起再生。Lnc-Pim1silencer可敲低N-2a-N细胞内Lnc-Pim1的表达,抑制N-2a-N细胞突起的生长,不影响细胞活性。（7）N-2a-N细胞Pim-1过表达导致Lnc-Pim1表达下调,Pim-1表达下调对Lnc-Pim1的表达无显着性影响;Lnc-Pim1过表达可促进Pim-1表达上调,Lnc-Pim1表达下调对Pim-1表达无显着影响。（8）CHIRP-MS共检测出N-2a-N细胞内183个Lnc-Pim1特异性的互作蛋白,GO和KEGG富集分析显示Lnc-Pim1特异性的互作蛋白主要分布在N-2a-N细胞的细胞质、少部分分布在细胞核。这些互作蛋白与N-2a-N细胞内基因和蛋白的表达调控、细胞间黏附、外泌体分泌、蛋白酶体活性、物质代谢等多种生物学过程相关。在这些互作蛋白中,Tubulin与Histone H2的可信度值最高。RNA-seq结果显示N-2a-N细胞Lnc-Pim1过表达导致140个差异表达的基因,其中93个表达上调,47个表达下调;N-2a-N细胞Lnc-Pim1敲低导致982个差异表达的基因,其中732个表达上调,250个表达下调。GO和KEGG富集分析显示MAPK和PI3K/Akt信号通路可能在Lnc-Pim1对N-2a-N细胞突起生长的效应中起重要作用。过表达和敲低Lnc-Pim1后,一些通路上共表达的Ccl2、Ccl5、Ghr、Hgf和Il1b基因可能是Lnc-Pim1作用的靶基因。结论:（1）Pim-1、Lnc-Pim1主要表达在N-2a-N细胞的细胞质,修复受损N-2a-N细胞有过表达Pim-1和Lnc-Pim1的需要。（2）神经营养因子CNTF、Nrn1可激活受损N-2a-N细胞Erk1/2及Stat3信号通路,上调Pim-1,进而增强细胞活性、减少细胞凋亡、上调GAP-43表达,从而促进受损N-2a-N细胞突起再生。（3）Pim-1过表达能够增强受损N-2a-N细胞活性、上调GAP-43表达,进而促进突起再生。敲低N-2a-N细胞Pim-1的表达,细胞活性、GAP-43表达和突起生长受到明显抑制。（4）Lnc-Pim1过表达可促进受损N-2a-N细胞突起再生,还可能具有促进Neuro-2a细胞分化的作用。Lnc-Pim1表达下调抑制N-2a-N细胞突起生长。（5）Lnc-Pim1过表达可能顺式增强Pim-1表达,Pim-1过表达可抑制Lnc-Pim1表达。（6）N-2a-N细胞中一些Lnc-Pim1的互作蛋白及受Lnc-Pim1调节的基因,为下一步研究Lnc-Pim1作用机制提供了初步实验基础。总之,N-2a-N细胞的Pim-1、Lnc-Pim1主要表达于细胞质,修复受损N-2a-N细胞有过表达Pim-1、Lnc-Pim1的需要;外源性CNTF或Nrn1经上调Pim-1表达以及Pim-1、Lnc-Pim1经重组LV载体过表达,均能促进受损N-2a-N细胞突起的再生,并初步阐明了一些相关作用机制。
马海涵[10]（2003）在《新生大鼠半横切脊髓内胚胎脊髓移植后大脑皮层cDNA差示文库构建及部分相关基因分析》文中进行了进一步梳理愈来愈多的研究表明，提供适当条件后损伤的CNS能够再生，轴突的再生是由神经元固有的特性和其所处的环境暗示（environmental cues）共同决定的。 影响CNS再生的因素很多，主要分为内在因素和外在因素两个方面，内在因素是指与CNS神经元轴突中断有关的基因表达，外在因素是指CNS中抑制轴突再生的分子和/或物理屏障。影响轴突生长外在因素也能通过诱导内在的神经基因的表达变化而发挥作用。实验证明直接给予损伤神经元胞体营养因子处理可逆转细胞萎缩，增强生长相关蛋白-43（GAP-43）和Tα-1微管蛋白（Tα-1 tubulin） mRNA表达，促进轴突再生。内在因素方面，CNS神经元在轴突中断后基因表达在数量及种类上与PNS明显不同，寻找并增强再生相关基因中关键基因的表达,以促进CNS损伤后轴突再生和/或出芽的反应是神经科学研究的重要方向。研究表明，新生大鼠CNS的再生能力强于成年大鼠，而应用胚胎脊髓移植处理脊髓损伤后的新生大鼠,与未处理的新生大鼠有更强的再生能力。提示，接受胚胎脊髓移植后，可能刺激新生大鼠的神经元表达功能更有意义的再生相关基因。为了探索胚胎脊髓移植后新生大鼠再生过程中皮层神经元基因表达的变化，探讨相关的再生机制及寻找更有效的治疗方法，本课题采用新生大鼠脊髓半横切模型，并即刻局部移植胚胎脊髓，结合SMART技术和SSH方法构建再生相关基因差异显示文库，并对验证为阳性的EST片段进行测序、克隆及同源性分析，另外,对一条可能与再生相关的新基因进行电子克隆、初步验证及生物信息学分析，初步证明，其在CNS轴突再生中可能有重要作用。主要研究结果和结论如下：1．本实验建立了新生1-2天大鼠双侧脊髓半横切及单侧胚胎脊髓移植的模型，该模型能客观反映皮质脊髓束对肢体运动功能单侧和交叉支配的结构特点，易于功能观察，致伤因素单一，致伤条件一致,可实现同一动物体内双侧对比，是一种稳定、重复性良好的再生研究模型。2．用原位杂交的方法观察到，胚胎脊髓移植后5天损伤脊髓GAP-43mRNA强<WP=10>烈表达，提示选择该时间窗观察再生相关基因表达是可行的。同时，与未损伤组及未移植组相比，移植组GAP-43mRNA的表达显着增强，表明我们建立的实验模型能够满足实验的需要。3．用SMART和SSH相结合的办法构建了新生大鼠脊髓损伤及胚胎脊髓移植后5天皮层神经元cDNA差异显示文库。分析文库中的基因，发现新生大鼠脊髓损伤胚胎脊髓移植后第5天，基因表达变化范围广泛，包括与细胞能量和蛋白合成代谢、细胞增殖活动、促进细胞迁移及细胞生长的诱导调控、细胞生物氧化和磷酸化作用等有关基因。表明脊髓损伤后再生过程由ERK/MAPK（mitogen-activated protein kinase, MAPK） 通路等多种信号转导系统参与，并涉及多种生物化学作用。4．我们在GenBank中成功注册了25个新EST序列。5．用Northern blot 检测H3（CA854305）变化，实验显示新生大鼠脊髓损伤后5天，给予胚胎脊髓移植组对侧大脑皮层中的H3表达，与未移植组和未损伤组有显着性差异，移植组强于未移植组，未移植组强于未损伤组；提示H3可能与再生关系密切。分析该基因定位于大鼠第8号染色体q31。电子克隆获得最大长度1635bp,最大开放阅读框位于49-591bp,结构分析符合Cozak规则。6．用RT-PCR试验初步验证了最大开放阅读框的序列，对推测翻译的蛋白序列在Genbank中进行BLASTP,证明与人类N-乙酰氨基葡萄糖-6-0-磺基转移酶具有高度相似性（98％）。分析该蛋白一级、二级和三级结构，并结合该蛋白结构上存在的蛋白酶作用位点，我们认为 H3基因及其推导蛋白质分子可能是分布于CNS中特殊部位并与CNS低分化状态有一定关系的信号分子。
二、新生大鼠脊髓损伤修复差异表达基因的筛选（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新生大鼠脊髓损伤修复差异表达基因的筛选（论文提纲范文）
（1）AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛神经机制的研究进展 |
| 1.1.1 脊髓损伤后肌肉痉挛概述 |
| 1.1.2 脊髓损伤后肌肉痉挛的发生机制 |
| 1.2 以构建新型腺相关病毒为代表的基因疗法 |
| 1.2.1 基因疗法概述 |
| 1.2.2 腺相关病毒作为基因疗法关键工具的研究进展 |
| 1.3 神经营养因子3 的研究现状 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 神经营养因子3 在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.4 运动干预与脊髓损伤可塑性 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 运动干预疗法在脊髓损伤后肌肉痉挛中的作用 |
| 1.5 选题依据及研究意义 |
| 第2章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒的构建及其在大鼠后肢肌肉及背根神经节中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物与细胞系 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器与耗材 |
| 2.1.4 实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 2.2.1 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 2.2.2 重组腺相关病毒的注射 |
| 2.2.3 Western blot法检测NT3 蛋白的表达变化 |
| 2.2.4 大鼠脊髓组织NT3 的半定量分析 |
| 2.2.5 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 大鼠后肢肌肉中人神经营养因子3 的表达 |
| 2.3.2 大鼠脊髓背根神经节中神经营养因子3 的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛的保护作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器与耗材 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 实验设计 |
| 3.2.2 脊髓挫伤模型的建立 |
| 3.2.3 运动训练 |
| 3.2.4 游泳测试 |
| 3.2.5 BBB评分 |
| 3.2.6 H反射的RDD记录 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 AAV-NT3、运动干预及二者的联合治疗对大鼠脊髓损伤后游泳测试时痉挛行为发生频率的影响 |
| 3.3.2 单独或联合治疗对后肢运动功能的影响 |
| 3.3.3 单独或联合治疗对H反射RDD的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 编码人神经营养因子3 的腺相关病毒与运动干预对大鼠脊髓损伤后肌肉痉挛保护作用的机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器与耗材 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 脊髓切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 4.2.2 免疫荧光定量 |
| 4.2.3 蛋白质印迹 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 单独或联合治疗后脊髓运动神经元及突触素(SYN)的变化 |
| 4.3.2 单独或联合治疗后 Ch AT 兴奋性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.3 单独或联合治疗后GABA抑制性中间神经元可塑性变化 |
| 4.3.4 单独或联合治疗后脊髓KCC2 蛋白表达的变化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16 的构建 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物与细胞系 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 实验试剂的配置 |
| 5.2 实验方法与步骤 |
| 5.2.1 生产病毒载体所需的质粒构建 |
| 5.2.2 重组腺相关病毒载体的制备 |
| 5.2.3 中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的构建模式 |
| 5.2.4 新一代血脑屏障3D体外模型构建、鉴定与AAV筛选 |
| 5.2.5 小鼠尾静脉注射进行AAV体内筛选 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 小鼠体内筛选高效率转导的新型中枢靶向性病毒载体 |
| 5.3.2 血脑屏障3D体外模型验证AAV-CPP.16 穿透BBB的 能力 |
| 5.3.3 探索适宜的用于小鼠体内AAV-CPP.16 的病毒载量 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 新型中枢靶向性基因载体AAV-CPP.16的转导效率 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法与步骤 |
| 6.2.1 小鼠尾静脉注射 |
| 6.2.2 小鼠侧脑室病毒注射 |
| 6.2.3 脊髓和外周组织器官切片的灌注、固定和免疫荧光染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.2 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.3 IV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.4 IV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.3.5 ICV注射AAV-CPP.16 在小鼠大脑中的转导效率 |
| 6.3.6 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓的转导效率 |
| 6.3.7 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓运动神经元的转导效率 |
| 6.3.8 ICV注射AAV-CPP.16 靶向脊髓背根神经节的转导效率 |
| 6.3.9 ICV注射AAV-CPP.16 外周毒性研究 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论 |
| 7.1 研究工作总结 |
| 7.2 本研究的创新性 |
| 7.3 工作局限及未来方向 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）3D打印技术构建干细胞仿生支架用于软骨及脊髓损伤修复的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 关节软骨损伤及治疗 |
| 1.1.1 关节软骨及其损伤 |
| 1.1.2 关节软骨损伤修复 |
| 1.2 脊髓损伤及治疗 |
| 1.2.1 脊髓结构与损伤 |
| 1.2.2 脊髓损伤修复治疗 |
| 1.3 生物3D打印技术 |
| 1.3.1 3D打印技术在再生医学领域的发展以及分类 |
| 1.3.2 3D打印技术在关节软骨修复中的应用 |
| 1.3.3 3D打印技术在脊髓修复中的应用 |
| 1.4 本论文的研究意义与内容 |
| 1.4.1 本论文的研究意义 |
| 1.4.2 本论文的主要研究内容 |
| 第2章 3D打印构建具有微孔道结构的纤维水凝胶支架促进间充质干细胞软骨分化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂与仪器设备 |
| 2.2.2 hMSCs的分离、培养以及鉴定 |
| 2.2.3 HBC制备与表征 |
| 2.2.4 PLGA静电纺丝以及NF的制备与表征 |
| 2.2.5 水凝胶的制备与表征 |
| 2.2.6 HBC-NF水凝胶细胞毒性测定 |
| 2.2.7 hMSCs在水凝胶中的增殖 |
| 2.2.8 hMSCs在水凝胶中的软骨分化诱导及表征 |
| 2.2.9 3D打印具有微孔道结构的PCL-HBC-NF支架及其表征 |
| 2.2.10 体内软骨形成检测 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 hMSC的鉴定 |
| 2.3.2 PLGA短纤维的制备与表征 |
| 2.3.3 HBC水凝胶的制备与表征 |
| 2.3.4 HBC-NF水凝胶的表征 |
| 2.3.5 hMSCs细胞毒性与增殖 |
| 2.3.6 体外软骨分化 |
| 2.3.7 具有微孔道结构的PCL-水凝胶的制备与表征 |
| 2.3.8 hMSCs的体内软骨分化 |
| 2.4 实验讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 生物3D打印神经干细胞支架用于脊髓损伤修复 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂与仪器设备 |
| 3.2.2 HBC/HA/MA生物墨水的制备 |
| 3.2.3 HBC/HA/MA水凝胶的表征 |
| 3.2.4 NSCs提取 |
| 3.2.5 NSCs的生物3D打印 |
| 3.2.6 生物3D打印支架内NSCs的存活与增殖 |
| 3.2.7 生物3D打印支架内NSCs分化 |
| 3.2.8 支架移植入SD大鼠脊髓损伤模型 |
| 3.2.9 SD大鼠行为学表征 |
| 3.2.10 大鼠脊髓切片免疫荧光染色 |
| 3.2.11 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HBC、HA-SH以及HA-VS的表征 |
| 3.3.2 HBC/HA/MA生物墨水的表征 |
| 3.3.3 生物3D打印NSCs负载的HBC/HA/MA支架 |
| 3.3.4 生物打印支架中NSCs的分化行为 |
| 3.3.5 SCI大鼠移植支架后运动功能恢复情况 |
| 3.3.6 组织学分析脊髓损伤修复情况 |
| 3.3.7 外源NSCs在体内的存活与分化 |
| 3.4 实验讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 缓释OSMI-4小分子的神经干细胞生物打印支架用于脊髓损伤修复 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂与仪器设备 |
| 4.2.2 材料制备 |
| 4.2.3 SM水凝胶的表征 |
| 4.2.4 NSCs的提取以及培养 |
| 4.2.5 SM水凝胶的细胞毒性测定 |
| 4.2.6 NSCs在水凝胶中的粘附以及增殖 |
| 4.2.7 OSMI-4诱导NSCs神经元分化 |
| 4.2.8 SM水凝胶中OSMI-4缓释 |
| 4.2.9 NSCs的生物3D打印 |
| 4.2.10 生物3D打印支架内NSCs的存活与增殖 |
| 4.2.11 生物3D打印支架内NSCs的分化 |
| 4.2.12 OSMI-4诱导NSCs神经元分化细胞通路检测 |
| 4.2.13 支架移植入SD大鼠脊髓损伤模型 |
| 4.2.14 BBB评分 |
| 4.2.15 大鼠脊髓切片免疫荧光染色 |
| 4.2.16 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 GelMA以及Ac-β-CD结构表征 |
| 4.3.2 SM水凝胶表征 |
| 4.3.3 NSCs细胞毒性、粘附与增殖 |
| 4.3.4 OSMI-4对NSCs分化的影响 |
| 4.3.5 生物3D打印NSCs负载的SM支架 |
| 4.3.6 SM-OSMI-4打印支架诱导NSCs神经元分化 |
| 4.3.7 OSNI-4调节NSCs分化的作用机理 |
| 4.3.8 生物打印支架对大鼠脊髓损伤的修复 |
| 4.4 实验讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文以及所取得的奖励 |
（3）小RNA转录组分析大鼠脊髓完全横断对坐骨神经损伤修复早期的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 脊髓完全横断损伤抑制周围神经损伤修复过程 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 小RNA转录组测序分析PNI和SCI两组间差异表达的miRNA及其验证 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 周围神经损伤修复过程以及miRNA在周围神经修复中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）Sigma1R对大鼠脊髓运动神经元的功能影响及肝细胞癌中SNHG1基因调控网络的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 论文创新点 |
| Sigma1R 对大鼠脊髓运动神经元的功能影响 |
| 第一章 背景概述 |
| 1.1 肌萎缩性脊髓侧索硬化症概述 |
| 1.2 Sigma1R概述 |
| 1.2.1 Sigma1R的发现及其分子药理学特征 |
| 1.2.2 Sigma1R的结构和定位 |
| 1.2.3 Sigma1R的分子功能 |
| 1.2.4 Sigma1R作为配体伴侣 |
| 1.2.5 Sigma1R的人类遗传学研究 |
| 1.3 Sigma1R与神经退行性疾病 |
| 1.4 ALS与脊髓运动神经元 |
| 1.5 转录组分析 |
| 1.6 电生理记录在研究神经元特性中的应用 |
| 1.6.1 动作电位 |
| 1.6.2 mEPSC微小兴奋性突触后电流 |
| 1.7 神经元功能与神经元膜表面各种通道的关系 |
| 第二章 Sigma1R敲除影响脊髓运动神经元的转录组分析及验证 |
| 引言 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物及分组 |
| 2.1.2 主要实验仪器及耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制和用具预处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠组织样本转录组测序分析 |
| 2.2.2 大鼠脊髓组织实时荧光定量PCR |
| 2.3 分析结果 |
| 2.3.1 数据产出及质控 |
| 2.3.2 差异基因分析 |
| 2.3.3 上调基因功能注释 |
| 2.3.4 下调基因功能注释 |
| 2.3.5 Quantitative Real-time PCR验证 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 2.4.1 上调基因的KEGG富集功能促进神经损伤 |
| 2.4.2 下调基因的KEGG富集功能影响神经的兴奋和抑制过程 |
| 2.4.3 上调基因的GO富集功能增强神经元和外周神经发育 |
| 2.4.4 下调基因的GO富集功能影响神经递质水平和突触功能 |
| 第三章 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元的影响 |
| 引言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物及分组 |
| 3.1.2 主要实验仪器及耗材 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 实验动物的基因组提取 |
| 3.2.2 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元数量的影响 |
| 3.2.3 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元兴奋性突触数量的影响 |
| 3.2.4 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元突触超微结构的影响 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Sigma1R敲除大鼠脊髓运动神经元数量和面积都存在变化 |
| 3.3.2 Sigma1R敲除大鼠脊髓运动神经元胞体兴奋性突触数量存在变化 |
| 3.3.3 Sigma1R敲除对脊髓运动神经元突触超微结构的影响 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元电生理学功能特性的影响 |
| 引言 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物及分组 |
| 4.1.2 主要实验仪器及耗材 |
| 4.1.3 实验所需试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 大鼠脊髓脑片的制备和细胞活力评估 |
| 4.3.2 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元的基本电生理性质的影响 |
| 4.3.3 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元动作电位的影响 |
| 4.3.4 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元兴奋性特性的影响 |
| 4.3.5 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元突触后电流(PSC)的影响 |
| 4.3.6 Sigma1R敲除对大鼠脊髓运动神经元m EPSC的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 总结与展望 |
| 肝细胞癌中SNHG1 的表达和基因调控网络的研究 |
| 第五章 背景概述 |
| 5.1 肝癌概述 |
| 5.1.1 肝癌的形成机制 |
| 5.1.2 肝癌相关的部分基因 |
| 5.1.3 肝癌的筛查 |
| 5.1.4 肝癌的治疗 |
| 5.2 肝癌发生与miRNA |
| 5.2.1 微小RNA |
| 5.2.2 miRNA沉默基因表达的机制 |
| 5.2.3 miRNA参与癌症发生的机制 |
| 第六章 肝细胞癌中SNHG1 的表达研究 |
| 引言 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要数据库 |
| 6.1.2 主要软件 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 数据下载和组织 |
| 6.2.2 基因表达分析 |
| 6.2.3 功能分析 |
| 6.2.4 代谢通路分析 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 RNA在 HCC中的表达 |
| 6.3.2 差异表达基因的功能注释和富集分析 |
| 6.3.3 差异表达基因的功能调控网络 |
| 6.3.4 肝癌中差异表达基因所影响的代谢通路 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 肝细胞癌中SNHG1 的基因调控网络的研究 |
| 引言 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 主要数据库 |
| 7.1.2 主要软件 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 数据下载和组织 |
| 7.2.2 ceRNA网络分析 |
| 7.2.3 单变量生存分析 |
| 7.2.4 单细胞分析 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 肝癌中的生物相互作用网络 |
| 7.3.2 肝细胞癌共表达基因的单因素生存分析 |
| 7.3.3 血管内皮细胞和巨噬细胞SNHG1 相关mRNA的表达 |
| 7.4 小结与讨论 |
| 总结与展望 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的科研成果 |
| 致谢 |
（5）ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 五、总论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
（6）新型复合释氧支架的构建及促进大鼠脊髓损伤修复的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 立项依据 |
| 1.3 前期研究基础 |
| 1.4 研究目的与内容 |
| 第二章 新型复合释氧支架的构建与释氧性能 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 第三章 新型复合释氧支架对细胞存活、增殖影响的实验研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 第四章 新型复合释氧支架对大鼠脊髓损伤修复作用的实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 神经组织工程技术在脊髄损伤修复中的研究进展与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 中英文缩略词表 |
| 附录二 大鼠后肢BBB运动功能评分表 |
| 攻读博士期间主要成果 |
| 致谢 |
（7）骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6通路促进脊髓损伤修复的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体对脊髓损伤的影响 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗脊髓损伤的基因表达谱分析 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6治疗脊髓损伤 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脊髓损伤的细胞移植治疗 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（8）脊髓损伤后环状RNA和长链非编码RNA的表达谱及在星形胶质细胞中的功能初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 脊髓损伤后环状RNAs(Circular RNAs)的表达谱及在星形胶质细胞中的功能初探 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.SD大鼠T9半横断模型的建立 |
| 2.CircRNA的类型、数量统计和表达谱 |
| 3.CircRNA的鉴定 |
| 4.脊髓损伤过程中环状RNA表达模式的验证 |
| 5.原代培养星形胶质细胞的鉴定 |
| 6.CircRNA_01477 及其宿主基因的表达模式 |
| 7.CircRNA_01477 的定位 |
| 8.敲降circRNA_01477 对星形胶质细胞增殖的影响 |
| 9.敲降circRNA_01477 对星形胶质细胞迁移的影响 |
| 10.敲降circRNA_01477 对星形胶质细胞凋亡的影响 |
| 11.体内敲降circRNA_01477 对胶质瘢痕的影响 |
| 12.敲降circRNA_01477 芯片杂交分析 |
| 13.敲降circRNA_01477 生物信息学分析和ce RNA网络构建 |
| 14.CircRNA_01477-ce RNA网络验证 |
| 讨论 |
| 第二部分 脊髓损伤后长链非编码RNAs(Long noncoding RNAs)的表达谱及在星形胶质细胞中的功能初探 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果 |
| 1.SD大鼠T9半横断模型的建立 |
| 2.LncRNA表达谱及其验证 |
| 3.LOC100909675的特征分析 |
| 4.LOC100909675的全长序列 |
| 5.LOC100909675的定位 |
| 6.敲降LOC100909675对星形胶质细胞增殖的影响 |
| 7.敲降LOC100909675对星形胶质细胞迁移的影响 |
| 8.敲降LOC100909675对星形胶质细胞凋亡的影响 |
| 9.体内敲降LOC100909675对胶质瘢痕的影响 |
| 10.体内敲降LOC100909675对脊髓损伤后肢运动功能的影响 |
| 11.敲降LOC100909675后转录组测序与生物信息学分析 |
| 12.敲降LOC100909675后转录组测序结果验证 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 脊髓损伤与非编码RNA |
| 综述参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 博士生期间发表科研论文及学术会议情况 |
| 博士生期间参加科研项目 |
| 致谢 |
（9）靶向Pim-1表达修复受损神经元样细胞的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 调控Pim-1表达修复受损神经元样细胞 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| (一)实验细胞系 |
| (二)主要实验试剂 |
| (三)主要溶液配制 |
| (四)主要设备 |
| (五)实验方法 |
| 三、结果 |
| (一)Neuro-2a细胞成功诱导成神经元样细胞(N-2a-N) |
| (二)成功建立ACR损伤N-2a-N细胞突起模型 |
| (三)CNTF和 Nrn1 促进受损N-2a-N细胞突起的再生 |
| (四)CNTF和 Nrn1 增强受损细胞的活性并减少其凋亡 |
| (五)CNTF和 Nrn1 促进受损N-2a-N细胞内Pim-1 的表达 |
| (六)CNTF和 Nrn1 上调Pim-1 相关信号转导分子的表达 |
| (七)CNTF和 Nrn1 调控N-2a-N细胞突起再生的分子基础 |
| (八)成功构建Pim-1 重组慢病毒载体(LV-Pim-1) |
| (九)Pim-1重组慢病毒载体包装 |
| (十)抗性筛选LV-Pim-1 感染的Neuro-2a细胞 |
| (十一)抗性筛选后Neuro-2a细胞中Pim-1 的表达 |
| (十二)Pim-1 过表达具有修复受损N-2a-N细胞的作用 |
| (十三)沉默Pim-1 表达抑制N-2a-N细胞突起生长 |
| 四、讨论 |
| (一)体外神经元突起损伤模型制备 |
| (二)CNTF、Nrn1 上调Pim-1 表达促进受损神经元样细胞突起再生 |
| (三)Pim-1促进受损神经元样细胞突起再生 |
| 第二部分 Lnc-Pim1 修复受损神经元样细胞的作用及机制 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| (一)主要实验试剂 |
| (二)主要实验设备 |
| (三)实验方法 |
| 三、结果 |
| (一)N-2a-N细胞Lnc-Pim1 序列全长 |
| (二)预测Lnc-Pim1 的编码能力 |
| (三)Lnc-Pim1 在细胞中的表达定位 |
| (四)Lnc-Pim1 在受损N-2a-N细胞表达的时相变化 |
| (五)成功构建Lnc-Pim1 重组慢病毒载体质粒 |
| (六)Lnc-Pim1 重组慢病毒载体包装 |
| (七)Lnc-Pim1 重组慢病毒载体感染及抗性筛选 |
| (八)Neuro-2a细胞Lnc-Pim1 过表达促进突起生长并激活Erk1/2 通路 |
| (九)Lnc-Pim1 过表达促进受损N-2a-N细胞突起再生 |
| (十)敲低Lnc-Pim1 表达抑制N-2a-N细胞突起生长 |
| (十一)Lnc-Pim1 过表达促进Pim-1 表达上调 |
| (十二)N-2a-N细胞内Lnc-Pim1 的互作蛋白 |
| (十三)调控Lnc-Pim1 表达所导致的差异性基因表达 |
| 四、讨论 |
| (一)Lnc-Pim1 及其在神经元样细胞的表达和损伤后的变化 |
| (二)神经元样细胞Lnc-Pim1与Pim-1 的相互关系 |
| (三)Lnc-Pim1 过表达促进神经元样细胞突起再生及相关机制 |
| 全文小结 |
| 创新点及意义 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述(已发表) LncRNA在视网膜发育和病变中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 荣誉与奖励 |
| 致谢 |
（10）新生大鼠半横切脊髓内胚胎脊髓移植后大脑皮层cDNA差示文库构建及部分相关基因分析（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 新生大鼠半横切脊髓内胚胎脊髓移植后大脑皮层cDNA差示文库构建及部分相关基因分析 |
| 前言 |
| 第一部分 建立新生大鼠脊髓半横切损伤即刻胚胎脊髓移植后再生模型 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 新生大鼠脊髓损伤及胚胎脊髓移植后再生过程中大脑皮层差示cDNA文库构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 新生大鼠脊髓损伤胚胎脊髓移植后再生过程中差示基因测序及分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 一种新基因的克隆、鉴定及其生物信息学初步分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 文献综述 脊髓损伤后轴突再生的机制 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表文章 |
四、新生大鼠脊髓损伤修复差异表达基因的筛选（论文参考文献）
- [1]AAV-NT3与运动对脊髓损伤后肢体痉挛的干预及新型基因载体AAV-CPP.16的初步构建[D]. 常宇鑫. 吉林大学, 2021(01)
- [2]3D打印技术构建干细胞仿生支架用于软骨及脊髓损伤修复的研究[D]. 刘晓云. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [3]小RNA转录组分析大鼠脊髓完全横断对坐骨神经损伤修复早期的影响[D]. 蒋玲丽. 遵义医科大学, 2021
- [4]Sigma1R对大鼠脊髓运动神经元的功能影响及肝细胞癌中SNHG1基因调控网络的研究[D]. 郑超然. 武汉大学, 2021(02)
- [5]ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究[D]. 李芳. 山东大学, 2021(11)
- [6]新型复合释氧支架的构建及促进大鼠脊髓损伤修复的实验研究[D]. 刘良乐. 南方医科大学, 2021
- [7]骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过TSG-6通路促进脊髓损伤修复的作用及机制研究[D]. 董万亮. 郑州大学, 2020
- [8]脊髓损伤后环状RNA和长链非编码RNA的表达谱及在星形胶质细胞中的功能初探[D]. 巫荣华. 苏州大学, 2020(06)
- [9]靶向Pim-1表达修复受损神经元样细胞的作用及机制[D]. 李贺. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [10]新生大鼠半横切脊髓内胚胎脊髓移植后大脑皮层cDNA差示文库构建及部分相关基因分析[D]. 马海涵. 第三军医大学, 2003(01)