一、重组铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL的克隆、表达与活性检测（论文文献综述）
郭琼[1]（2021）在《CEACAM6启动子介导PE38KDEL毒素基因治疗人舌鳞状细胞癌的研究》文中指出人舌鳞状细胞癌（hOTSCC）是口腔癌中发病率和死亡率最高的一种,具有复发风险高、预后差的特点。临床上治疗hOTSCC的手段仍主要以手术、放疗和化疗为主。然而这些治疗手段往往缺乏靶向性,具有较高的毒副作用,对患者的生存质量造成了严重的影响。因此,开发hOTSCC的基因靶向药物成为当下的研究热点。肿瘤的毒素基因治疗通过肿瘤特异性启动子来调控毒素的表达,使毒素基因只在肿瘤细胞中表达,而在正常组织和细胞中不表达,因而使治疗具有更高的安全性和治疗效率。近年来,肿瘤毒素基因治疗受到了越来越多的研究者的青睐。然而,截止目前,关于hOTSCC毒素基因治疗的报道仍然很少。CEACAM6是细胞表面的一种粘附因子,在多种肿瘤中都过表达,糖基化的CEACAM6可以作为早期口腔鳞状细胞癌患者复发的肿瘤标志物。因此,本文拟用CEACAM6启动子来调控假单胞菌外毒素A的表达,构建hOTSCC毒素基因治疗质粒并探索其对hOTSCC的治疗效果。首先,我们通过qRT-PCR检测了CEACAM6在不同细胞中的表达情况。结果表明,CEACAM6在hOTSCC细胞中显着过表达,而在正常细胞中的表达量则很低,表现出了较强的OTSCC表达特异性。然后,利用基因重组技术构建了p CEACAM6-PE38KDEL毒素表达质粒和p CEACAM6-Basic萤火虫荧光素酶表达质粒,并利用萤火虫荧光素酶活性检测的办法测定CEACAM6启动子的表达活性及表达特异性。结果表明,CEACAM6启动子在体外条件下可以特异性地调控萤火虫荧光素酶的表达,同样表现出了较强的OTSCC表达特异性。因为PE38KDEL毒素可以导致真核细胞翻译延长因子（e EF2）失活,我们利用共转染的方法检测毒素质粒对hOTSCC细胞蛋白合成的特异性抑制作用,并分别利用细胞增殖抑制实验、流式细胞术、TUNEL、Western Blotting、Transwell和伤口愈合试验在体外检测毒素质粒对OTSCC细胞的靶向抑制和杀伤作用。和预期的一样,p CEACAM6-PE38KDEL毒素表达质粒可以特异性抑制OTSCC细胞TCA8113的蛋白合成,对其增殖、侵袭和迁移也具有明显的抑制作用,同时还能诱导其发生凋亡和细胞周期阻滞。相反,对正常细胞以及CEACAM6表达阴性的细胞则影响很小。在裸鼠移植瘤模型中,p CEACAM6-PE38KDEL同样表现出了良好的体内治疗效果,对肿瘤的形成以及生长均具有显着的抑制作用。与此同时,通过H&E、免疫组化检测我们发现,该毒素表达质粒不会对机体的正常组织及器官造成明显的损伤,具有较高的生物安全性。本文的研究结果表明,CEACAM6启动子介导的PE38KDEL毒素基因治疗药物能够有效地抑制和杀伤hOTSCC细胞,具有很高的靶向性和安全性,有望成为未来在临床上进行hOTSCC基因靶向治疗的候选药物。
李文桂,陈雅棠[2]（2020）在《铜绿假单胞菌外毒素A蛋白疫苗的研制现状》文中进行了进一步梳理铜绿假单胞菌是一种院内感染的常见致病菌,借助疫苗技术对该菌进行免疫防治是目前的研究热点。铜绿假单胞菌外毒素A（PEA）具有较好的免疫原性,可作为有效的疫苗候选抗原。对PEA蛋白分子、融合蛋白（PEA-Fla、ntPE-M2e、PEIF、PEA-GP5-M、CVN-PE38、PEA-V3MV26、PEA-HphA和IL-18-PE38）、耦合蛋白（PEA-LPS、PEACSP、PEA-Pfs25、CD4-PEA、G17-PE38和PLGA-PEA）以及核酸疫苗等的研制现状进行了综述。
张瑾,王兴勇,顾江[3]（2020）在《铜绿假单胞菌外毒素A在生物制药中应用的研究进展》文中研究指明铜绿假单胞菌外毒素A（Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA）是该菌分泌的外毒素之一,通过催化细胞延伸因子2（elongation factor-2,EF-2）的ADP核糖基化,抑制蛋白合成,从而导致细胞死亡,在铜绿假单胞菌导致的感染性疾病中发挥重要作用。PEA强烈的细胞毒性特点使得该毒素成为免疫毒素的重要成分之一,已广泛应用于肿瘤的靶向治疗中。此外,由于PEA可与抗原提呈细胞表面的α2巨球蛋白受体结合,通过胞饮作用进入胞内,辅助抗原的处理和提呈,可作为分子佐剂应用于各种疫苗的研发。本文对PEA在免疫毒素及疫苗佐剂方面应用的研究进展作一综述。
张腾飞[4]（2019）在《PDX模型的构建及纳米抗体免疫毒素在小鼠体内的研究》文中研究说明大肠癌严重影响人类的健康和生存质量,其治疗方法和药物开发不断推陈出新。常规的抗癌药物和化疗结合方法对于患者的治愈效果有限,且在抑制肿瘤细胞的同时对人体正常的免疫系统损伤极大。因此,更佳有效且能减轻患者痛苦的新疗法的开发势在必行。其中利用融合免疫毒素与抗癌胚抗原（serumcarcinoembryonic antigen,CEA）结合进行靶向免疫治疗方法引起广泛关注。本论文将两种linker（刚性linker-R、柔性linker-V）插入11C12-PE38之间构建融合免疫毒素11C12-R/V-PE38以及无linker插入构建的11C12-PE38融合免疫毒素。通过优化表达和后续分析检测,选取亲和性较高的融合免疫毒素。并在细胞层面和裸鼠移植瘤PDX模型中,研究融合纳米免疫毒素11C12-R-PE38的抗癌效果。首先,利用基因分子工程手段将两种linker插入融合抗体免疫毒素表达质粒的纳米抗体与免疫毒素PE38之间,构建融合了linker的表达质粒pET30a-11C12-R/V-PE38。然后,通过大肠杆菌BL21原核表达体系在最佳温度37℃和诱导剂浓度1 mmol/L的条件下,优化表达该融合抗体免疫毒素,通过His-tag亲和柱层析方法提纯得到11C12-PE38（无linker）、11C12-R-PE38和11C12-V-PE38蛋白浓度分别为1.60 mg/mL、1.71 mg/mL和1.56 mg/mL。采用常用的Biacore技术测定无linker、插入linker-R/V对融合抗体免疫毒素PE38蛋白的亲和力影响,结果表明11C12-PE38、11C12-R-PE38和11C12-V-PE38的平衡解离常数分别为1.00×10-7 mol/L、2.07×10-8 mol/L和1.40×10-7mol/L。平衡解离常数越小解离越少,其亲和力越高,因此根据测定的结果,插入刚性linker的11C12-R-PE38亲和性最好。随后通过扩大培养规模制备亲和性高的11C12-R-PE38用于对人结肠癌SW480、LoVo、SW403细胞的抑制效果评价。研究结果表明,11C12-R-PE38对LoVo、SW403和SW480三种癌细胞均有抑制作用,抑制率分别为89%、57%、31%,其中对LoVo的抑制性最高。最后,基于细胞实验结果,构建来源于病人肿瘤组织的裸鼠移植瘤（PDX）模型,通过小鼠体内实验验证融合抗体免疫毒素PE38的抗癌效果。在10天内测量小鼠体内肿瘤体积变化情况,结果表明,低剂量组（2μg/kg）和高剂量组（10μg/kg）给药小鼠在7天内与空白对照组肿瘤增长较快对比,变化不大。在第10天低剂量组、高剂量组和空白对照组给药小鼠的肿瘤体积分别为125 mm3、119 mm3和199mm3,虽然给药组小鼠的肿瘤在7-10天内与对照组肿瘤都成增长趋势,但明显观察到模型小鼠肿瘤组织体积增长速度放缓,表明构建的含linker R融合免疫毒素对于结肠癌肿瘤组织起到了明显的抑制效果。
张瑾[5]（2019）在《新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究》文中认为研究背景:感染是引起新生儿死亡及严重后遗症的主要原因之一。其中,新生儿细菌性脑膜炎病死率高,即便恢复亦伴发神经系统损伤后遗症,为家庭和社会造成严重的负担。大肠杆菌K1（Escherichia coli K1,E.coli K1）是引发新生儿细菌性脑膜炎的主要病原体,超过80%患者是由该菌感染所致。外膜蛋白A（Outer membrane A,OmpA）是E.coli K1的关键致病因子,其胞外Loops在E.coli K1抵抗免疫系统的损伤并引发菌血症、入侵血脑屏障导致颅内感染过程中发挥决定性的作用。新生儿感染性肺炎是新生儿期最常见的感染性疾病和重要死亡病因,即使感染控制后亦可造成不可逆损伤,严重影响大脑和身体发育。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是引起新生儿感染性肺炎的三大主要病原菌之一。PA致病因子繁多,其中外毒素A（Exotoxin A,ETA）是PA发现最早、毒力最强、也是最经典的毒力因子。它主要通过细胞识别、跨膜转位和催化活性等过程发挥其细胞的致死效应,在PA引起的新生儿感染性肺炎中发挥重要作用。随着E.coli K1和PA耐药日趋严重,常规抗感染治疗手段已捉襟见肘。因此选择合适的抗体是治疗PA,尤其对耐药PA感染的是有效替代疗法。历史经验证明:疫苗是预防与控制病原菌流行、感染及致病的最佳科学手段;抗体是中和病原菌毒素、治疗感染性疾病的特效药物。若能成功研制针对E.coli K1 OmpA和PA ETA的特异性疫苗或抗体药物,必将有效控制上述细菌的传播和致病。因此本研究针对新生儿常见病原菌Ecoli.K1和铜绿假单胞菌的严峻防控形势,研究新型疫苗和抗体为核心的免疫干预策略和药物,以期为预防新生儿感染的发生、提高其救治水平打下基础。第一部分基于脑膜炎大肠杆菌K1外膜蛋白A胞外功能片段的纳米粒疫苗的研制研究目的:本研究针对新生儿细菌性脑膜炎常见病原菌Ecoli.K1的严峻防控形势,针对其关键毒力因子OmpA研制新型疫苗,以期为预防新生儿Ecoli.K1脑膜炎的发生、提高其救治水平打下基础。研究方法:1.本课题拟在前期发现Vo抗原具有良好的免疫保护效果的基础上,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly（1actide-CO-glycolide）PLGA）和壳聚糖（Chitosan,CS）为辅料,构建包裹Vo的纳米粒疫苗。以复乳溶剂挥发法和直接吸附法制备空白纳米粒,通过检测纳米粒的形态、粒径、分散性指数等重要参数,评价PLGA、丙酮、二氯甲烷及不同修饰方法对纳米粒的影响,筛选出空白纳米粒的最优处方;通过测定不同条件下纳米粒包裹Vo蛋白的包封率,获得最大载药量Vo纳米粒（Vo nanoparticles,VoNP）的最优处方;通过检测VoNP冻干前后的外观、形态学、粒径、电位、物理及化学稳定性等参数的变化,评价冻干工艺对VoNP质量的影响,获得VoNP的最佳制备工艺;按照最佳工艺制备VoNP,通过透射电镜、扫描电子显微镜和原子显微镜,粒度和电位分析仪,质谱仪等考察纳米粒疫苗的基本理化特征及其稳定性。2.以L929国家标准细胞毒性细胞为模型,评价VoNP的体外细胞毒性;以BALB/c小鼠为模型,肌肉注射VoNP后观察心、肝、脾、肺、肾组织病理改变,评价其体内毒性;将VoNP于0,7和14天三次免疫小鼠,检测血清中抗Vo特异性抗体的水平及类型,评价VoNP的免疫原性;致死剂量攻毒VoNP免疫后小鼠,观察小鼠生存率、体重变化情况评价VoNP的保护效果,亚致死剂量攻毒VoNP免疫后小鼠,观察脾、血细菌定植量,初步评价VoNP的免疫保护机制;将制备的VoNP4℃保存180天后按上述方法评价其免疫原性和免疫保护效果,与同样处理的Al（OH）3佐剂吸附的Vo疫苗相比较,评价VoNP长期稳定性。研究结果:1.纳米粒的最适配方为:以丙酮为溶剂壳聚糖修饰的PLGA纳米粒;VoNP的最大载药量为1mg,其包封率为59%;冻干过程（冷冻3h,干燥22小时）对VoNP的形态,粒径和分散性无明显影响;最佳工艺制备的VoNP的平均粒径为250.8±2.13 nm,分散性指数为0.09±0.01,电位为0.6110±0.0267 mV,VoNP呈球状、表面光滑,无明显聚集现象,分散性好;通过MALDI-TOF MS研究证实Vo蛋白在纳米粒疫苗中稳定存在;4℃放置180天的VoNP的粒径、分散性及Zeta电位未发生明显变化,稳定性良好。2.VoNP对L929细胞无明显细胞毒性作用;肌肉注射VoNP的BALB/c小鼠7天内无死亡及不良反应的发生情况,心、肝、脾、肺和肾脏器无明显病理组织学改变,表明VoNP对BALB/c小鼠无明显毒性作用;VoNP免疫小鼠后可引起较强的体液免疫应答反应,且其免疫应答类型以Th2型免疫应答为主。在攻毒保护实验中,VoNP的免疫能通过降低外周血及脾脏中的细菌定植,减轻体重变化等方式抵抗E.coli K1的感染,提高小鼠的生存率。通过动物实验证实长期保存（180天）VoNP不仅具有稳定的理化性质,且其免疫原性和免疫保护效果未见显着变化。表明,VoNP安全性较好,质量稳定。研究结论:本研究成功建立并优化了VoNP的制备工艺,获得了质量稳定、安全性较好的VoNP疫苗,动物实验表明该疫苗具有长期稳定的免疫原性和免疫保护效果,这些发现为进一步成功研发E.coli K1疫苗奠定了基础,并对促进新生儿脑膜炎E.coli K1感染的免疫干预策略研究具有重要的推动作用。第二部分抗外毒素A人免疫球蛋白在铜绿假单胞菌肺炎中的预防和治疗作用研究研究目的:本研究针对新生儿铜绿假单胞菌肺炎治疗的难题,研究以免疫球蛋白为核心的干预策略和药物,以期为预防新生儿PA感染的发生、提高其救治水平打下基础。研究方法:1.建立以Luminex技术为基础的抗ETA抗体浓度检测方法,检测320份健康的志愿者血清中ETA特异性抗体浓度;通过Protein A亲和层析法纯化含高效价ETA抗体的免疫球蛋白（Intravenous immunoglobulin,IVIG）;用L929细胞模型评价抗ETA抗体对ETA毒素的中和活性;对BALB/c小鼠腹腔注射抗ETA抗体,后予致死剂量的ETA攻毒小鼠,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的预防性保护效果,同时,通过亚致死剂量ETA攻毒小鼠,观察肝脏细胞因子及病理组织改变,探索其保护机制。2.BALB/c小鼠腹腔注射不同浓度的抗ETA抗体,1小时后致死剂量PA103菌气管注射攻毒小鼠,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的预防性保护效果,同时,通过亚致死剂量PA103菌攻毒小鼠,观察肺部细菌定植量和炎性病理改变,检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平等参数,探索其保护机制;致死剂量PA103菌气管注射攻毒BALB/c小鼠3小时后,腹腔注射不同浓度的抗ETA抗体,观察生存率、体温体重变化,评价抗ETA抗体的治疗效果,同时,通过亚致死剂量PA103菌攻毒小鼠,观察肺部细菌定植量和炎性病理改变,检测肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平等参数,探索其保护机制;将结合GST-ETA的固相载体与纯化得到含高效价抗ETA抗体IVIG共孵育,去除其中ETA特异性IgG,用上述方法评价其毒素中和活性,预防和治疗保护效果的变化,验证其保护效果的特异性。研究结果:1.本研究成功构建了表达ETA及其无毒突变体（mETA）的工程菌株,并纯化得到重组ETA毒素,其活性与天然毒素相当;建立了以Luminex技术为基础的抗ETA抗体浓度检测方法。检测320名健康志愿者血清中抗ETA抗体水平,发现抗ETA抗体平均浓度为98.7 ng/ml,最高可达918.24 ng/ml。其中血清抗ETA抗体浓度在099 ng/ml约占54%。通过Protein A亲和层析法,成功纯化得到含有高浓度抗ETA抗体的人免疫球蛋白,其SDS-PAGE纯度大于90%。2.通过L929细胞模型发现该抗ETA抗体能有效抑制ETA的细胞毒性,且具有浓度依赖的趋势;通过ETA毒素攻毒小鼠模型发现该抗体可阻断ETA导致的肝脏损伤,从而发挥良好保护效果;在急性PA肺部感染模型上发现,高效价的抗ETA免疫球蛋白可显着降低细菌在肺部的定植和炎症反应,从而发挥预防性及治疗性效应。此外,本研究发现单独使用兔抗ETA抗体或非特异性人IgGs亦可产生有限的保护效果。研究结论:本研究成功从健康的献血者中纯化得到高效价的抗ETA抗体的免疫球蛋白,其具有良好的毒素中和活性。动物实验发现该免疫球蛋白针对ETA毒素和PA急性肺部感染具有良好预防及治疗效果。这些结果为非抗生素预防和治疗PA肺部感染奠定了基础,对PA的防控提供了新的策略和方案,也为其它耐药细菌的免疫干预提供了范例。
曹津[6]（2020）在《内含肽介导的抗体片段免疫毒素在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化》文中进行了进一步梳理背景及目的:免疫毒素是指将抗体和毒素结合的重组蛋白,用于精准定位并杀死癌细胞,是目前癌症治疗的主要研究方向之一。免疫毒素中的抗体部分常用scds Fv片段,该片段重链与轻链之间肽链和二硫键同时存在。免疫毒素中的毒素部分有不同的来源,常用的毒素为铜绿假单胞菌分泌的一种外毒素pseudomonas exotoxin A,其改造后的片段PE38KDEL是目前应用的主要形式。重组免疫毒素在大肠杆菌中表达时非常容易形成包涵体。包涵体需要经过复杂的蛋白变复性,增加了重组蛋白生产过程中的时间成本和经济成本。促溶标签能够改善免疫毒素的可溶性表达,但含有促溶标签的重组蛋白需要切除标签,去除标签常用蛋白酶,大规模生产时使用蛋白酶降解成本很高,因此应用受到限制。内含肽是一种广泛分布在细菌、真菌和古细菌中的可以在合适条件下将两端外显肽连接在一起的功能性蛋白质,其大小一般在一百到六百个氨基酸之间,可分为经典内含肽、微小内含肽和断裂内含肽。随着人们对内含肽的深入研究,其应用越来越广泛,比如在体内和体外的蛋白半合成、阶段性同位素标记、肽链的环化等方面均有内含肽的应用。此外,内含肽在蛋白质纯化过程中可与纯化标签联用,避免了通过蛋白酶等方法去除标签对目的蛋白的影响,具有很大的应用价值和发展前景。本研究将蛋白内含肽与促溶标签和纯化标签联用,实现免疫毒素在大肠杆菌内的可溶性表达,既简化了纯化流程,减少了蛋白损失,又可通过内含肽的自我剪切作用快速去除促溶标签与纯化标签,对免疫毒素生产工艺的改进具有重大意义。研究方法:本研究中,我们采用促溶标签结合低温诱导实现免疫毒素在大肠杆菌（BL21（DE3）、SHuffle T7）胞质内可溶性表达。采用亲和层析方法实现目的蛋白纯化。采用分别表达纯化后混合的方法实现内含肽的自我断裂。采用镍柱亲和层析方法实现断裂后目的蛋白的除杂。采用超滤或Capto L柱对除杂后蛋白富集。采用FACS或Fortebio方式检测蛋白亲和力。实验通过三组促溶标签、纯化标签、内含肽与重组免疫毒素的连接应用,实现免疫毒素的可溶性表达。同时,断裂内含肽可以很容易的将标签从纯化体系除去,避免了通过蛋白酶等方法去除标签,降低实验成本。此外,本课题对影响内含肽断裂的因素进行深入研究,为开发基于大肠杆菌表达系统的可溶性表达、纯化免疫毒素类药用重组蛋白方法提供参考。研究成果:实验采用的两种内含肽为ΔICM和Npu Dna E;两种促溶标签为Trx和MBP;两种纯化标签为His和MBP;两种免疫毒素为HA22（sc ds Fv）-PE38KDEL和SS1（scds Fv）-PE38KDEL,通过内含肽、促溶标签、纯化标签和免疫毒素之间的重组实现重组免疫毒素的构建,探究在不同内含肽、不同促融标签和不同免疫毒素下重组蛋白在大肠杆菌的可溶性表达。此外,实验探究了影响断裂内含肽Npu Dna E断裂效率的因素。结果表明,不同的重组免疫毒素均可实现可溶性表达,内含肽的自我剪切可以简单快速的去除促溶标签和纯化标签,空间结构、电荷因素、所连接外显肽、时间、温度和DTT浓度对Npu Dna E断裂效率均有一定影响。实验结果为免疫毒素类重组蛋白的生产纯化工艺提供了新思路。
杨远韬[7]（2018）在《重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL的制备及其抗胶质瘤作用研究》文中研究表明背景和目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤。目前,恶性胶质瘤的治疗方式主要为手术切除瘤体联合术后放、化疗,但临床疗效不理想,致死致残率高。因此,探索恶性胶质瘤的全新治疗策略,具有重要的临床意义。重组免疫毒素是当前分子靶向治疗的热点,是治疗恶性胶质瘤全新策略之一。重组免疫毒素主要有两部分构成:有靶向作用的肿瘤特异性靶向分子和发挥杀伤作用的毒素蛋白。本研究选取在恶性胶质瘤细胞及组织中高表达,而在正常脑组织中低表达的分子EphA2受体作为肿瘤目标靶点,选取其特异性配体EphrinA1作为靶向分子,铜绿假单胞杆菌外毒素的活性片段PE38KDEL作为毒素蛋白,尝试构建重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL。通过原核系统表达该重组免疫毒素,并观察其对恶性胶质瘤细胞的作用,为胶质瘤治疗的药物研发提供新的思路。方法:通过DNA克隆和突变技术,合成编码重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL的基因序列。通过目的基因引物设计和质粒酶切、目的基因和质粒的连接、载体质粒转化克隆株等实验,构建重组免疫毒素载体质粒pET28a-EphrinA1-PE38KDEL。通过载体质粒的克隆、载体质粒转化表达菌株等实验,构建重组免疫毒素菌株BL21（DE3）-pET28a-EphrinA1-PE38KDEL。通过IPTG诱导、Ni-NTA亲和层析,咪唑梯度和pH梯度洗脱纯化等实验,原核表达重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL。通过蛋白BCA法测定原核表达的重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL的浓度。通过细胞摄取实验,观察重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL能否特异性识别肿瘤靶点EphA2,能否进入肿瘤细胞。通过CCK-8增殖实验,观察重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL对EphA2高表达的胶质瘤细胞U251、U87和EphA2低表达的正常人脑星形胶质细胞HEB的作用。结果:通过对载体质粒的双酶切后PCR和基因测序验证,成功构建了含重组免疫毒素 EphrinA1-PE38KDEL 基 因 片段 的重组质 粒pET28a-EphrinA1-PE38KDEL。通过SDS-PAGE电泳、蛋白质免疫印迹实验验证,经重组免疫毒素载体质粒pET28a-EphrinA1-PE38KDEL转化的大肠杆菌BL21（DE3）能够表达的重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL。通过蛋白BCA法测定,经原核表达和纯化的可溶性重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL的浓度为0.15μg/μ1。通过细胞摄取实验,观察到重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL能够通过配体受体结合反应,进入胶质瘤细胞。通过CCK-8增殖实验,发现重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL对人胶质瘤细胞U251和U87有靶向杀伤作用,且杀伤效果随剂量增加而增加,而对人正常脑星形胶质细胞HEB的杀伤作用不显着,不影响其正常生长。结论:经原核表达产生的重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL可以靶向杀伤胶质瘤细胞,且不影响正常脑胶质细胞的生长。
毛春燕,安钢力,王祥岭,翟晓晨,孟会敏,游凤涛,杨林[8]（2017）在《靶向EGFR免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的制备及其体外活性测定》文中进行了进一步梳理目的:构建基于EGFR纳米抗体的免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,并检测其对EGFR肿瘤细胞的细胞毒作用。方法:采用分子克隆技术,将靶向EGFR的纳米抗体7D12以二价的形式,通过柔性连接肽（G4S）4与铜绿假单胞菌外毒素的截断形式PE38KDEL连接,构建原核表达载体p ET28a-BI7D12-PE38KDEL。然后将其转化到BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG进行诱导表达。通过镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,并经Western blot验证。通过流式细胞技术检测该免疫毒素与EGFR阳性细胞A549、HT29、MCF-7和EGFR阴性细胞CEM、Jurkat的结合能力后,将其按照一定的浓度梯度进行细胞毒实验研究,72 h后,使用WST-1试剂检测BI7D12-PE38KDEL对上述细胞的杀伤效果。结果:通过SDS-PAGE和Western blot实验验证,成功的制备了重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该毒素大部分以可溶性的方式表达。BI7D12-PE38KDEL能够与EGFR阳性的A549、HT29、MCF-7肿瘤细胞特异性的结合,并且对上述细胞的细胞毒作用与阴性对照组CEM和Jurkat相比具有极其显着性差异（P<0.01）。结论:成功地构建了基于EGFR纳米抗体的重组免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,该免疫毒素能特异性的结合并杀伤EGFR阳性的肿瘤细胞。
岑丹维,宋易玲,张婵琼,毛珊珊,叶晓鲜,陈俊,陈韶,朱珊丽,张丽芳[9]（2017）在《绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备》文中研究说明目的:通过原核表达系统制备绿脓杆菌外毒素（PE）PE38KDEL重组蛋白,并制备特异性兔免疫血清多克隆抗体。方法:选择PE部分基因（PE38）,并将C端609-613位的氨基酸REDLK突变为KDEL,通过原核密码子优化（http://www.jcat.de）后全基因合成,经Hind III和Xho I酶切位点克隆至p ET32a（+）原核表达载体,构建p ET32a（+）/PE38KDEL重组质粒,将测序正确的重组质粒转化到E.coli BL21（DE3）感受态细菌中,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组PE38KDEL蛋白,经Ni-NTA亲和层析法制备纯化蛋白,采用SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。进一步将PE38KDEL纯化蛋白免疫日本大耳白兔制备PE38KDEL特异性多克隆抗体,并采集免疫前后血清,用ELISA法检测免疫后的抗体反应和效价。结果:成功构建了p ET32a（+）/PE38KDEL重组质粒。在原核表达系统中该质粒成功表达并获得纯化的PE38KDEL蛋白。SDSPAGE电泳显示蛋白分子质量约为57 k Da,与预计理论值大小相符合。Western blot法检测结果显示,在分子质量约57 k Da处出现单一条带。通过免疫大耳白兔成功获得PE38KDEL特异性多克隆抗体,抗体效价高达1:60 000。结论:PE38KDEL蛋白可诱导兔产生特异性多克隆血清抗体,且该抗体效价高、特异性强,为进一步研究基于PE38KDEL毒素的生物学和免疫学等功能奠定了基础。
汤金乐[10]（2016）在《基于CD7纳米抗体的新型免疫毒素对人白血病细胞在体外和体内的活性研究》文中研究表明在过去的几十年里,白血病和淋巴瘤的临床治疗取得了很大的进展。然而在T细胞白血病和淋巴瘤中,仅仅只有一小部分的T急性淋巴细胞白血病（T-ALL）或者外周T细胞淋巴瘤（PTCL）病人获得了长期无肿瘤生存。常规的细胞毒疗法（化疗或者放疗等）对病人具有副反应且疗效有限。众所周知,当白血病或者淋巴瘤患者一旦对化疗产生耐药或者出现复发,临床治疗手段将会变得十分有限,病人的生存期也随之变得很短。因此高效的、能够避免多药耐药性机制,而且对治疗人T细胞恶性肿瘤具有良好特异性和毒性的新疗法是具有十分重要的科学和临床意义。在新的治疗药物开发中,由毒素和肿瘤细胞特异性的抗体片段或者配体等融合构成的重组免疫毒素被认为对化疗耐药性的T细胞疾病是仍然有效的。运用免疫毒素的一个关键要素就是选择肿瘤细胞适合的靶点。许多研究已经表明CD7分子在大多数T细胞淋巴瘤和白血病细胞表面表达,而在一小部分正常T淋巴细胞上缺失。CD7分子作为治疗靶点的另外一个优势就是当它和抗体或者抗体衍生物结合后会迅速内化,这使得针对CD7分子的抗体非常适合作为药物运输工具。由于上述优点,多种CD7特异性的免疫毒素被制备出来并检测它们的抗白血病效应。然而,大多数的研究主要集中在植物毒素,如蓖麻毒素,皂草素及其衍生物,这些毒素由于缺乏足够的安全和疗效而未获得临床批准。另一种免疫毒素,截短形式的铜绿假单胞菌外毒素A（ETA或PE38）融合到CD7的单链抗体片段（scFv）,被报道可造成约20%原代白血病细胞死亡,但是却没有进一步评估其体内抗白血病效应,这意味着T细胞白血病细胞可能对PE38不敏感或者报道的CD7单链抗体需要进一步的改进。事实上,由PE38构成的抗CD22免疫毒素在用于毛细胞白血病患者的临床试验中表现出令人印象深刻治疗效应,达到了46%的完全缓解,而且无明显的剂量限制性毒性,这表明PE38至少对一些淋巴细胞是敏感的。因此,新的抗CD7抗体或者可变区片段有可能为我们提高针对T细胞淋巴瘤和白血病免疫毒素功效提供新的选择。纳米抗体被选择成为我们要开发的新型抗CD7抗体的原因如下:纳米抗体是由casterman等人首先发现的一种单域抗体,来自骆驼重链抗体的重链可变区,具有诸多杰出的理化性质,这使它们成为了靶向递送生物活性药物的优秀候选者。研究人员已经证明纳米抗体可以与毒素以及其他功能性分子偶联,然后用这些偶联物去靶向细胞,对癌症和其他疾病进行治疗。目的:筛选cd7特异性的纳米抗体,构建新型的基于cd7纳米抗体和pe38的免疫毒素,在体外检测这些免疫毒素对t-all细胞系、t-all病人和aml病人原代细胞的效应,最后在体内评估它们抗白血病的作用。方法:用cd7阳性的jurkat细胞免疫骆驼,提取免疫后的骆驼外周血淋巴细胞,构建纳米抗体噬菌体文库,用生物淘洗的方法筛选获得抗cd7的纳米抗体。通过流式细胞分析仪检测纳米抗体vhh6、免疫毒素pg001（vhh6-pe38）和pg002（dvhh6-pe38）的特异性和亲和力。在体外通过检测蛋白质合成抑制和凋亡的方法来测定纳米抗体免疫毒素pg001和pg002对人cd7阳性的jurkat、cem和cd7阴性的rpmi8226、h460细胞系的细胞毒作用。通过annexinv和7-aad染色检测pg001和pg002对白血病患者原代细胞的细胞毒效应。pg001和pg002在体内的抗肿瘤潜力采用cem细胞异种移植肿瘤模型进行评估。结果:我们成功鉴定了具有高特异性和亲和力（15nm）的cd7纳米抗体——vhh6。基于vhh6的单价免疫毒素（pg001）和双价免疫毒素（pg002）对cd7阳性细胞保持有高度的特异性,亲和力分别约为16nm和4nm。这两种毒素高效地以抗原依赖型的方式促进cd7阳性白血病细胞系jurkat和cem发生凋亡,但是对cd7阴性的人多发性骨髓瘤细胞系rpmi8226和人肺癌细胞系h460增殖的几乎没有影响。特别需要指出的是,免疫毒素pg002对jurkat、cem细胞的半有效浓度分别为30pm和23pm,这提示pg002治疗cd7阳性白血病具有很大的潜力。此外,pg002在单剂量为100ng/ml浓度条件下能有效介导新鲜收集的t-all和aml患者原代细胞凋亡。在异种移植肿瘤模型中,pg001和pg002能够抑制cem细胞的增殖,并可显着延长小鼠的生存期。其中,pg002相比于pg001在肿瘤模型中的治疗效果更为突出。结论:我们构建的单价（pg001）和双价（pg002）cd7纳米抗体免疫毒素以抗原特异性的方式,以及在低浓度条件下即可有效杀伤cd7阳性t-all细胞系和新鲜t-all和aml病人来源的细胞。基于免疫毒素pg001和pg002有效杀死白血病细胞,可显着延长异种移植肿瘤小鼠的生存,PG001和PG002值得进一步开展临床前和临床试验研究,从而进一步评价它们抗白血病的潜能。
二、重组铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL的克隆、表达与活性检测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL的克隆、表达与活性检测（论文提纲范文）
（1）CEACAM6启动子介导PE38KDEL毒素基因治疗人舌鳞状细胞癌的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 人舌鳞状细胞癌概述 |
| 1.2 人舌鳞状细胞癌的治疗现状 |
| 1.2.1 手术治疗 |
| 1.2.2 放射治疗 |
| 1.2.3 化疗 |
| 1.2.4 分子靶向治疗 |
| 1.3 肿瘤基因治疗概述 |
| 1.3.1 抑癌基因的癌症治疗 |
| 1.3.2 RNA干扰和沉默 |
| 1.3.3 抗肿瘤血管生成以及抗表皮生长因子受体的基因治疗 |
| 1.3.4 免疫基因疗法 |
| 1.3.5 溶瘤疗法 |
| 1.3.6 基因编辑法 |
| 1.3.7 自杀基因疗法 |
| 1.4 假单胞菌外毒素概述 |
| 1.4.1 假单胞菌外毒素的结构及其致毒机理 |
| 1.4.2 假单胞菌外毒素在肿瘤毒素治疗中的应用 |
| 1.5 癌胚抗原相关细胞粘附因子6 概述 |
| 1.5.1 CEACAM6 的结构 |
| 1.5.2 CEACAM6 与肿瘤的转移的关系 |
| 1.5.3 CEACAM6 与肿瘤的凋亡及分化的关系 |
| 1.5.4 CEACAM6 与肿瘤抗药性的关系 |
| 1.5.5 CEACAM6 与肿瘤免疫的关系 |
| 1.6 本论文立题依据和研究内容 |
| 第二章 CEACAM6 启动子调控的PE38KDEL毒素表达质粒的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要试剂及材料 |
| 2.2.2 所用质粒的结构及特征图谱 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 RNA提取 |
| 2.3.3 反转录 |
| 2.3.4 实时荧光定量PCR |
| 2.3.5 TCA8113 细胞基因组的提取 |
| 2.3.6 CEACAM6 启动子及PE38KDEL片段的扩增 |
| 2.3.7 DNA的回收 |
| 2.3.8 DNA双酶切 |
| 2.3.9 目的基因与质粒载体的连接 |
| 2.3.10 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.11 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 2.3.12 质粒提取 |
| 2.3.13 质粒的鉴定 |
| 2.3.14 细胞转染 |
| 2.3.15 荧光素酶测定 |
| 2.3.16 BCA定量 |
| 2.3.17 数据统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 不同细胞中CEACAM6 基因的表达 |
| 2.4.2 质粒的构建 |
| 2.4.3 质粒的双酶切鉴定 |
| 2.4.4 质粒的测序鉴定 |
| 2.4.5 CEACAM6 启动子在不同细胞中的表达活性 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 CEACAM6 启动子调控的PE38KDEL毒素表达质粒的体外抗肿瘤活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 材料及试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 荧光素酶合成抑制试验 |
| 3.3.2 细胞增殖抑制试验 |
| 3.3.3 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡试验 |
| 3.3.4 TUNEL细胞凋亡检测试验 |
| 3.3.5 细胞蛋白的提取 |
| 3.3.6 蛋白免疫印迹实验(Western Blot,WB) |
| 3.3.7 线粒体膜电位检测 |
| 3.3.8 流式细胞术检测细胞周期分布试验 |
| 3.3.9 Transwell实验 |
| 3.3.10 伤口愈合实验 |
| 3.3.11 数据统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 pCEACAM6-PE38KDEL对荧光素酶合成的抑制作用 |
| 3.4.2 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4.3 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.4.4 pCEACAM6-PE38KDEL通过线粒体途径诱导细胞凋亡 |
| 3.4.5 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.4.6 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞周期的阻滞作用 |
| 3.4.7 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞迁移能力的影响 |
| 3.4.8 pCEACAM6-PE38KDEL对细胞侵袭能力的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 CEACAM6启动子调控的PE38KDEL毒素表达质粒的体内抗肿瘤活性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器及试剂 |
| 4.2.1 材料及试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 人舌鳞状细胞癌细胞皮下移植瘤动物模型的建立 |
| 4.3.2 人舌鳞状细胞癌细胞皮下移植瘤动物模型的治疗方案 |
| 4.3.3 尾静脉注射法进行小鼠体内转染 |
| 4.3.4 样本采集及切片的制作 |
| 4.3.5 H&E染色 |
| 4.3.6 TUNEL细胞凋亡检测 |
| 4.3.7 Ki-67 免疫组化 |
| 4.3.8 数据统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 pCEACAM6-PE38KDEL对肿瘤生长及形成的抑制作用 |
| 4.4.2 pCEACAM6-PE38KDEL质粒对肿瘤的体内杀伤作用 |
| 4.4.3 pCEACAM6-PE38KDEL的系统毒性 |
| 4.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）铜绿假单胞菌外毒素A蛋白疫苗的研制现状（论文提纲范文）
| 1 PEA蛋白分子 |
| 2 PEA融合蛋白 |
| 2.1 PEA-Fla |
| 2.2 nt PE-M2e |
| 2.3 PEIF |
| 2.4 PEA-GP5-M |
| 2.5 CVN-PE38 |
| 2.6 PEA-V3MV26 |
| 2.7 PEA-Hph A |
| 2.8 IL-18-PE38 |
| 3 PEA耦合蛋白 |
| 3.1 PEA-LPS |
| 3.2 PEA-CSP |
| 3.3 PEA-Pfs25 |
| 3.4 CD4-PEA |
| 3.5 G17-PE38 |
| 3.6 PLGA-PEA |
| 4 PEA核酸疫苗 |
| 4.1 反义RNA |
| 4.2 重组质粒 |
| 5 结语 |
（3）铜绿假单胞菌外毒素A在生物制药中应用的研究进展（论文提纲范文）
| 1 外毒素A在免疫毒素（immunotoxins,ITs）中的应用 |
| 1.1 SS1P |
| 1.2 BL22 |
| 2 外毒素A作为疫苗佐剂的应用 |
| 2.1 广谱甲型流感病毒疫苗 |
| 2.2 疟疾疫苗 |
| 3 展望 |
（4）PDX模型的构建及纳米抗体免疫毒素在小鼠体内的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 大肠癌病因及治疗概况 |
| 1.2 肿瘤标志物 |
| 1.3 抗体与纳米抗体 |
| 1.3.1 天然抗体-免疫球蛋白(Ig) |
| 1.3.2 纳米抗体 |
| 1.4 铜绿假单胞菌PE |
| 1.5 连接肽linker |
| 1.5.1 刚性linker |
| 1.5.2 柔性linker |
| 1.6 PDX模型 |
| 1.6.1 PDX模型的研究现状 |
| 1.6.2 PDX模型特征 |
| 1.7 论文研究目的和实验内容 |
| 第2章 linker对融合免疫毒素11C12-PE38 的亲和性影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细菌菌株 |
| 2.1.2 linker连接肽 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒的提取 |
| 2.2.2 质粒转化 |
| 2.2.3 重组菌培养诱导温度优化 |
| 2.2.4 重组菌培养诱导剂浓度优化 |
| 2.2.5 优化条件下重组菌培养及破碎 |
| 2.2.6 目标蛋白镍柱纯化 |
| 2.2.7 采用BCA法测定蛋白的含量 |
| 2.2.8 采用BIACORE技术测定纳米抗体的亲和力 |
| 2.2.9去内毒素实验 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 含目的蛋白重组菌的诱导温度条件优化结果 |
| 2.3.2 含目的蛋白的菌体培养诱导剂浓度条件优化结果 |
| 2.3.3 三种蛋白镍柱纯化和蛋白定量结果 |
| 2.3.4 三种融合免疫毒素与CEA的亲和力测定结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 细胞水平融合免疫毒素11C12-R-PE38 毒性检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 间接免疫荧光检测11C12 与三种癌细胞结合情况 |
| 3.2.3 11C12-R-PE38 对三种结肠癌细胞的活性鉴定(MTT方法) |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 11C12和SW480、Lo Vo 和SW403 癌细胞免疫荧光检测 |
| 3.3.2 11C12-R-PE38 对三种结肠癌细胞的MTT结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 基于裸鼠PDX模型11C12-R-PE38 肿瘤抑制效果 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 常用仪器设备 |
| 4.1.2 实验常用试剂 |
| 4.1.3 常用试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 肿瘤组织 |
| 4.2.2 小鼠饲养条件 |
| 4.2.3 人源化PDX裸鼠模型的构建 |
| 4.2.4 PDX裸鼠模型小鼠给药实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 给药小鼠的肿瘤增殖结果 |
| 4.3.2 肿瘤体积变化结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 基于脑膜炎大肠杆菌K1外膜蛋白A胞外功能片段的纳米粒疫苗的研制 |
| 前言 |
| 第一节 纳米粒疫苗制备及质量评价 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 第二节 纳米粒疫苗保护效果评价及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 第二部分 抗外毒素A人免疫球蛋白在铜绿假单胞菌肺炎中的预防和治疗作用研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验小结 |
| 5 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 |
（6）内含肽介导的抗体片段免疫毒素在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 免疫毒素 |
| 1.1.1 免疫毒素的概念与发展 |
| 1.1.2 单克隆抗体片段Fv的概述 |
| 1.1.3 铜绿假单胞菌外毒素(PE) |
| 1.2 肿瘤治疗的发展 |
| 1.3 内含肽的发现、种类、作用机制及应用 |
| 1.3.1 内含肽内含肽的发现 |
| 1.3.2 内含肽的分类 |
| 1.3.3 内含肽的作用机制 |
| 1.3.4 内含肽的应用 |
| 1.4 促溶标签的应用 |
| 1.5 立题依据 |
| 第二章 剪切内含肽ΔICM介导免疫毒素HA22(scdsFv)-PE38KDEL的可溶性表达与标签纯化 |
| 2.1 导言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.2 重组蛋白纯化 |
| 2.3.3 内含肽体外剪切反应的探究 |
| 2.3.4 影响断裂内含肽剪切反应因素的探究 |
| 2.3.5 C端断裂后目的蛋白的纯化 |
| 2.3.6 HA22-PE38KDEL对Raji细胞的生物活性检测 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.4.2 重组蛋白的纯化 |
| 2.4.3 内含肽体外剪切反应的探究 |
| 2.4.4 影响内含肽剪切反应的因素的探究 |
| 2.4.5 蛋白除杂 |
| 2.4.6 HA22-PE38KDEL对Raji细胞的生物活性检测 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 断裂内含肽Npu DnaE介导免疫毒素HA22(scdsFv)-PE38KDEL的可溶性表达与标签纯化 |
| 3.1 导言 |
| 3.2 材料和试剂 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组表达质粒的构建 |
| 3.3.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.3.3 重组蛋白的纯化 |
| 3.3.4 内含肽的体外剪切反应的探究 |
| 3.3.5 影响剪切反应的因素探索 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 重组表达质粒的构建 |
| 3.4.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.4.3 重组蛋白的纯化 |
| 3.4.4 内含肽体外剪切反应的探究 |
| 3.4.5 影响内含肽的体外剪切反应的因素 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 断裂内含肽Npu DnaE介导免疫毒素SS1(scdsFv)-PE38KDEL的可溶性表达与标签纯化 |
| 4.1 导言 |
| 4.2 材料和试剂 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组表达质粒的构建 |
| 4.3.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.3.3 重组蛋白纯化 |
| 4.3.4 内含肽体外剪切反应的探究 |
| 4.3.5 影响断裂内含肽剪切反应因素探究 |
| 4.3.6 蛋白除杂与目的蛋白的富集 |
| 4.3.7 Fortebio检测亲和力 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 重组表达质粒的构建 |
| 4.4.2 重组蛋白的诱导表达 |
| 4.4.3 重组蛋白的纯化 |
| 4.4.4 内含肽体外剪切反应的探究 |
| 4.4.5 影响内含肽的体外剪切反应的因素 |
| 4.4.6 内含肽断裂后蛋白纯化 |
| 4.4.7 Fortebio检测亲和力 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论及工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（7）重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL的制备及其抗胶质瘤作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL原核表达载体的构建 |
| 一 引言 |
| 二 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 三 结果 |
| 1 质粒的酶切鉴定结果 |
| 2 阳性克隆测序结果及结果分析 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 重组免疫毒素EphrinA1-PE3 8KDEL的原核表达和纯化 |
| 一 引言 |
| 二 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 三 结果 |
| 1 重组蛋白的原核表达 |
| 2 重组蛋白的验证 |
| 3 重组蛋白的纯化 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL抗胶质瘤作用 |
| 一 引言 |
| 二 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 三 结果 |
| 1 共聚焦显微镜检测活细胞摄取 |
| 2 CCK-8细胞增殖测定 |
| 四 讨论 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词简表 |
| 硕士研究生期间发表论文及参与科研项目情况 |
| 致谢 |
（8）靶向EGFR免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的制备及其体外活性测定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂 |
| 1.1.2 质粒、菌株和细胞株 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PE38KDEL基因扩增 |
| 1.2.2 重组表达质粒p ET28a(+)-BI7D12-PE38K DEL的构建 |
| 1.2.3 免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的表达及纯化 |
| 1.2.4 Western blot鉴定免疫毒素BI7D12-PE38KD EL |
| 1.2.5 免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的抗原结合特异性测定 |
| 1.2.6 WST-1检测免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的细胞毒作用 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增PE38片段 |
| 2.2 成功构建p ET28a(+)-BI7D12-PE38KDEL |
| 2.3 免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的表达纯化和鉴定 |
| 2.4 免疫毒素BI7D12-PE38KDEL特异性地结合EGFR阳性的肿瘤细胞株 |
| 2.5 免疫毒素BI7D12-PE38KDEL对EGFR阳性细胞株的杀伤作用 |
| 3 讨论 |
（9）绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 试剂与酶类: |
| 1.1.2质粒和菌株: |
| 1.1.3 实验动物: |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 PE38KDEL重组质粒构建: |
| 1.2.2 PE38KDEL重组蛋白表达、鉴定及纯化: |
| 1.2.3 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗体的制备及效价分析: |
| 1.2.4 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗体特异性分析鉴定: |
| 2 结果 |
| 2.1 p ET32a(+)/PE38KDEL重组质粒构建及鉴定 |
| 2.2 p ET32a(+)/PE38KDEL重组质粒原核表达及鉴定 |
| 2.3 PE38KDEL蛋白免疫后兔血清抗体Ig G反应及效价 |
| 2.4 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗体特异性分析鉴定 |
| 3 讨论 |
（10）基于CD7纳米抗体的新型免疫毒素对人白血病细胞在体外和体内的活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1. 主要仪器 |
| 1.2. 主要试剂 |
| 1.3. 常用缓冲液及相关试剂配制 |
| 1.4. 主要载体、宿主菌与辅助噬菌体 |
| 1.5. 主要细胞系 |
| 1.6. 骆驼及其外周血样标本 |
| 1.7. 白血病病人样本 |
| 2. 方法 |
| 2.1. 骆驼免疫、外周血淋巴细胞的分离和血清的分离 |
| 2.2. 骆驼血清细胞抗原封闭实验 |
| 2.3. 骆驼外周血淋巴细胞总RNA提取 |
| 2.4. cDNA第一链的合成 |
| 2.5. 从cDNA第一链中扩增纳米抗体基因片段 |
| 2.6. 纳米抗体基因重组载体的构建 |
| 2.7. 纳米抗体噬菌体抗体库的构建 |
| 2.8. CD7特异性纳米抗体筛选 |
| 2.9. CD7特异性纳米抗体鉴定 |
| 2.10. 纳米抗体免疫毒素的基因合成及原核表达载体的构建 |
| 2.11. 纳米抗体免疫毒素PG001和PG002的鉴定 |
| 2.12. PG001和PG002免疫毒素体外杀伤活性检测 |
| 2.13. PG001 和 PG002 在体外对 T-ALL 和 AML 病人外周血淋巴细胞的活性检测 |
| 2.14. PG001 和 PG002 免疫毒素体内抗白血病活性研究 |
| 2.15. 统计分析 |
| 三、结果 |
| 1. 纳米抗体噬菌体库的构建与筛选 |
| 1.1. 纳米抗体噬菌体库的构建与鉴定 |
| 1.2. 293T-CD7稳转细胞株的构建 |
| 1.3. CD7纳米抗体的筛选 |
| 2. CD7纳米抗体的原核表达与分析 |
| 2.1. CD7纳米抗体的亚克隆、原核表达及亲和力测定 |
| 2.2. 纳米抗体VHH6的特异性分析 |
| 3. 纳米抗体免疫的毒素的构建与活性分析 |
| 3.1. 单价纳米抗体免疫毒素的构建与鉴定 |
| 3.2. 纳米抗体免疫毒素PG001的毒理效应 |
| 3.3. 纳米抗体免疫毒素PG002的构建与体外活性鉴定 |
| 3.4. PG001和PG002有效地诱导人急性白血病原代细胞凋亡 |
| 4. PG001和PG002在NOD/SCID小鼠体内抗CEM白血病细胞活性研究 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 综述 纳米抗体在靶向肿瘤治疗中的研究进展 |
| 引言 |
| 1. 纳米抗体的结构特征与理化性质 |
| 2. 纳米抗体制备 |
| 3. 纳米抗体作为靶向因子在肿瘤治疗中的应用 |
| 3.1. 纳米抗体作为癌症治疗的拮抗药研究 |
| 3.2. 纳米抗体作为靶向携带效应分子治疗肿瘤 |
| 3.3. 纳米抗体作为载体在药物递送系统中的研究 |
| 3.4. 双特异性纳米抗体和嵌合抗原受体修饰T细胞在肿瘤治疗中的应用 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人公开发表的论文、专利 |
| 中英文主要缩略词表 |
| 致谢 |
四、重组铜绿假单胞菌外毒素PE38KDEL的克隆、表达与活性检测（论文参考文献）
- [1]CEACAM6启动子介导PE38KDEL毒素基因治疗人舌鳞状细胞癌的研究[D]. 郭琼. 吉林大学, 2021(01)
- [2]铜绿假单胞菌外毒素A蛋白疫苗的研制现状[J]. 李文桂,陈雅棠. 生物技术通讯, 2020(05)
- [3]铜绿假单胞菌外毒素A在生物制药中应用的研究进展[J]. 张瑾,王兴勇,顾江. 中国生物制品学杂志, 2020(05)
- [4]PDX模型的构建及纳米抗体免疫毒素在小鼠体内的研究[D]. 张腾飞. 长春理工大学, 2019(03)
- [5]新生儿感染病原菌脑膜炎大肠杆菌与铜绿假单胞菌的免疫干预研究[D]. 张瑾. 重庆医科大学, 2019(01)
- [6]内含肽介导的抗体片段免疫毒素在大肠杆菌中的可溶性表达与纯化[D]. 曹津. 上海交通大学, 2020(01)
- [7]重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL的制备及其抗胶质瘤作用研究[D]. 杨远韬. 南方医科大学, 2018(01)
- [8]靶向EGFR免疫毒素BI7D12-PE38KDEL的制备及其体外活性测定[J]. 毛春燕,安钢力,王祥岭,翟晓晨,孟会敏,游凤涛,杨林. 中国免疫学杂志, 2017(04)
- [9]绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备[J]. 岑丹维,宋易玲,张婵琼,毛珊珊,叶晓鲜,陈俊,陈韶,朱珊丽,张丽芳. 温州医科大学学报, 2017(01)
- [10]基于CD7纳米抗体的新型免疫毒素对人白血病细胞在体外和体内的活性研究[D]. 汤金乐. 苏州大学, 2016(01)