一、系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞CD80和CD86的表达（论文文献综述）
柯昌浩[1]（2021）在《DC源lncRNA在急性冠脉综合征中的差异性表达及其调控机制》文中研究说明研究背景:急性冠脉综合征（acute coronary syndromes,ACS）作为最常见的致命性疾病之一,其患病率及死亡率高居不下。因此,深入了解ACS的发病机制,降低患者死亡率,提高生存质量已成为不可忽视的全球性社会卫生问题。尽管已有大量研究报道ACS多种复杂的发病机制,但不同类型ACS病理机制的不同导致了临床治疗策略和预后有所差异,对各个亚型ACS发病机制的了解仍处于起步阶段。免疫炎症反应学说与ACS的发生发展及转归有着密切联系,在ACS发病过程中,坏死的心肌细胞激活免疫系统,产生剧烈的炎症反应,已修复坏死的组织区域。然而,不同亚型ACS是否有不同程度的炎症反应,炎症反应的发生发展是否受精准分子的调控,尚无明确定论。而作为功能强大的抗原呈递细胞,树突状细胞（Dendritic cell,DC）在不同类型ACS发病过程中的功能对于先天性及适应性免疫的平衡至关重要。因此,探讨不同亚型ACS中树突状细胞的具体功能作用,揭示其在发挥生物学效应中的具体机制,便是本研究的主要内容。本研究拟通过RNA测序技术,探讨不同类型ACS患者外周血单个核细胞源树突状细胞的（mononuclear cell-derived dendritic cells,moDC）长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）和信使RNA（Message RNA,m RNA）差异性表达谱,寻找到与moDC分化发育相关的lncRNA,并对其调控DC功能的具体机制进行深入探讨,以揭示moDC源lncRNA在DC的激活及ACS的发生发展中的相关联系。第一部分不同类型ACS病人moDC的形态及其功能具有差异目的:培养不同类型ACS病人和健康正常人的moDC,并对其形态及功能进行实验研究,以探讨moDC与不同类型ACS之间的关联。方法:（1）通过Ficoll密度梯度离心法分离人外周新鲜血液,获取PBMC。采用免疫磁珠阳性分选法收集CD14+单核细胞,经完全培养基及细胞生长因子GM-CSF、IL-4诱导6天,培养出实验所需的moDC。通过倒置相差电子显微镜观察moDC的形态特征,并利用流式细胞术对DC相关表面分子（CD11c、CD14、CD80、CD86、HLA-DR）进行鉴定。（2）收集UA患者6例（UA组）,NSTEMI患者8例,（NST组）,STEMI患者9例（ST组）,健康志愿者8例（CON组）,计算各组病人获取的PBMC数量及诱导后的moDC数量,获得moDC得率。通过扫描电子显微镜（SEM）观察各组DC形态,并使用流式细胞术检测moDC的表面共刺激分子（CD80、HLA-DR）、鸡卵白蛋白（OVA）,ELISA检测moDC上清IL6、IL10、IL12p70含量,以探讨不同类型ACS病人之间moDC的功能差异。结果:（1）FCM检测发现,PBMC经MACS分选后,CD14+阳性率高达95%。CD14+单个核细胞经细胞因子GM-CSF、IL-4诱导六天后,分化为DC。镜下可见DC为悬浮细胞,细胞伸出少量树突样伪足,并呈葡萄样聚集,为典型DC形态。流式细胞术显示DC特异性表面分子CD11c、HLA-DR呈高表达,CD80、CD86在未受任何抗原刺激下为弱表达。（2）在相同培养体系下,ACS患者所提取的PBMC数量及诱导后的DC得率高于健康志愿者（p<0.05）。通过SEM发现,与CON组相比,UA组、NST组、ST组的DC具有更长、更密集的伪足样突起。相比于CON组、UA组,ST组与NST组CD80、HLA-DR表达水平增高,OVA表达水平减弱（p<0.05）。ST组、NST组moDC上清中的IL6、IL12p70表达水平显着高于CON组与UA组（p<0.05）,而IL10的表达量在四组中并没有显着的差异。结论:（1）利用Ficoll密度梯度离心法结合MACS可有效培育出纯度较高、数量可观的树突状细胞。（2）相同培养体系下,相比于CON组或UA组,AMI患者moDC具有更强的抗原呈递能力、促炎分泌功能及较弱的吞噬能力。第二部分不同类型ACS病人moDC源DElncRNA的筛选及生信分析目的:通过不同类型ACS病人moDC源lncRNA表达谱及生信分析,筛选出差异表达的lncRNA并进行验证,以探讨DElncRNA在不同类型急性冠脉综合征发病机制中的潜在调控机制。方法:（1）收集3例不稳定型心绞痛患者（UA组）、3例非ST段抬高型心肌梗死患者（NST组）、3例ST段抬高型心肌梗死组（ST组）、3例健康志愿者（CON组）外周血单个核细胞诱导的树突状细胞,采用RNA测序技术,建立m RNA、lncRNA差异表达谱并进行GO分析、KEGG分析、共表达网络分析,筛选出候选lncRNA。（2）扩大样本量,采用RT-PCR验证候选的DElncRNA,并与树突状细胞共刺激分子（CD80、CD86、HLA-DR）、白细胞（WBC）及AMI相关诊断指标CKMB、TNT-hs做相关性分析。结果:（1）在各个组两两比较m RNA和lncRNA表达差异情况时,发现CON组与UA组相比,ST组与NST组相比,两者的m RNA与lncRNA表达水平并无显着变化。将STEMI组与NSTEMI组中的样本合并,归纳在一个新的实验组中,取名为急性心肌梗死组（AMI）组,并与CON组进行显着分析研究。结果显示:CON组与AMI组相比,共有833个m RNA（229个上调,604个下调）和70个lncRNA（21个上调,49个下调）异常表达（fold change>2.0、p值<0.05）。（2）对AMI组与CON组中的差异性m RNA进行GO分析及KEGG通路分析。结果显示,大多数富集的信号通路和发挥的生物学效应与树突状细胞的分化、发育、激活密切相关。lncRNA-m RNA共表达网络数据显示,共表达网络由13个lncRNA与34个m RNA之间的47个网络节点和35个网络连接组成。其中,ENST00000418499.3能最多与12个m RNA相连接。（3）根据lncRNA的保守性评分、差异表达倍数择优选取了5个lncRNA（NR＿026793.1、NR＿027922.3、ENST00000446952.1、ENST00000457097.1、ENST00000590780.1）,在14个AMI患者及5个健康志愿者中进行RT-PCR验证。与RNA测序结果一致,NR＿026793.1、NR＿027922.3、ENST00000446952.1、ENST00000590780.1表达上调（p<0.05）,然而ENST00000457097.1表达水平在两组之间无统计学意义。（4）RT-PCR发现AMI患者的moDC的共刺激分子（CD80、CD86、HLA-DR）在RNA水平上表达上调。此外,通过相关性分析,发现ENST00000590780.1（R=0.61,p<0.05）表达水平与CD80呈正相关。ENST00000446952.1（R=0.61,p<0.05）、NR＿027922.3（R=0.56,p<0.05）表达水平与CD86呈正相关。NR＿027922.3（R=0.47,p<0.05）、ENST00000446952.1（R=0.69,p<0.05）表达水平与WBC呈正相关。NR＿027922.3（R=0.60,p<0.05）、ENST00000446952.1（R=0.63,p<0.05）表达水平与CK-MB呈正相关。NR＿027922.3（R=0.66,p<0.05）、ENST00000446952.1（R=0.58,p<0.05）表达水平与TNT-hs呈正相关。结论:（1）AMI患者moDC源m RNA、lncRNA与正常健康者存在差异性表达,而UA患者与健康正常人,ST患者与NST患者之间,差异性表达的m RNA和lncRNA数量较少。（2）AMI患者moDC源DElncRNA与ACS的发病机制具有潜在的联系,这可能与DElncRNA调控树突状细胞的生物学功能相关。第三部分DElncRNA CCL15-CCL14在moDC中的作用及机制研究目的:探讨lncRNA CCL15-CCL14在树突状细胞发挥生物学功能中的调控作用及其具体机制方法:（1）过表达或沉默lncRNA CCL15-CCL14,通过流式细胞术、RT-PCR检测moDC在抗原呈递、细胞因子的分泌等生物学功能变化,Western Blot检测moDC PI3K-AKT蛋白通路磷酸化水平。（2）通过荧光原位杂交技术探索lncRNA CCL15-CCL14在moDC中的亚定位,并结合lncRNA数据库预测其可能的作用靶点。结果:（1）以慢病毒为载体,可成功将lncRNA CCL15-CCL14过表达至moDC中。以脂质体为载体,可成功将CCL15-CCL14 Smart Silencer转染至moDC中,沉默lncRNA CCL15-CCL14。（2）过表达CCL15-CCL14（OE CCL15-CCL14）可促进moDC的激活,增强抗原呈递能力,促进细胞分泌促炎因子。此外,沉默CCL15-CCL14（SS CCL15-CCL14）能抑制moDC的正向免疫调控功能。Western Blot结果显示:lncRNA表达水平的变化会影响moDC中PI3K/AKT的磷酸化水平。（3）荧光原位杂交技术及lncRNA数据库分析结果显示:CCL15-CCL14是跨越CCL14与CCL15两个位点的非编码RNA,其主要定位于细胞核中,对趋化因子CCL14可能具有正向调控作用。结论:lncRNA CCL15-CCL14可调控CCL14的表达水平,引起PI3K/AKT蛋白通路磷酸化水平的改变,从而影响moDC的生物学效应。
林杉[2]（2021）在《肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制》文中研究指明研究背景与目的:调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）是一群具有免疫调节功能的B细胞的统称,近年来的研究发现Breg细胞在自身免疫性疾病、感染、肿瘤等多种疾病参与免疫调节反应。Breg细胞通过多种机制发挥促肿瘤作用,而肿瘤微环境中Breg细胞的分化机制尚不明确。乳酸是肿瘤细胞的代谢产物之一,乳酸影响多种免疫细胞的分化及功能,在肿瘤免疫耐受、免疫逃逸等方面发挥重要作用。而乳酸对B细胞分化及功能影响的研究较少,尚不明确。本课题通过对体外乳酸处理后B细胞免疫表型和功能的变化及其机制的研究,结合小鼠体内LDHA敲低D121细胞肺腺癌模型中B细胞及CD8+T细胞等其他免疫细胞的比率及活性研究,阐释了乳酸诱导B细胞向Breg样细胞分化及促进肿瘤进展的作用及其机制。研究方法:（1）磁珠分选小鼠脾脏B细胞,使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养B细胞2天,流式检测乳酸对B细胞中Bregs相关表型分子表达的影响。磁珠分选小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞,将上述两组B细胞分别与CFSE标记的CD3、CD28刺激的CD4+和CD8+T细胞共培养2-3天,流式评估乳酸处理的B细胞对T细胞增殖的影响。（2）使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养小鼠脾脏B细胞2天,荧光定量PCR检测两组B细胞内IL-10等免疫抑制分子以及PPARα、NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达差异。流式检测两组B细胞内IL-10、TGFβ、PD-L1以及ROS等分子的表达差异。蛋白免疫印迹检测两组B细胞内p40phox和p47phox蛋白表达差异。（3）磁珠分选小鼠脾脏B细胞体外培养2天,分为BAFF,BAFF+乳酸,BAFF+GPR81激动剂,BAFF+乳酸+GPR81抑制剂,BAFF+乳酸+PPARα抑制剂处理组,比较不同处理方法对B细胞免疫抑制功能的影响。此外,在体外乳酸诱导的B细胞与T细胞共培养体系中,分别加入anti-IL-10抗体,anti-TGFβ抗体,anti-PD-L1抗体,iNOS拮抗剂,arg-1拮抗剂或过氧化氢酶,流式评估上述分子对乳酸诱导Breg样细胞免疫调节功能的影响。明确乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能的分子机制。（4）应用慢病毒CRISPR/cas9技术敲低小鼠肺腺癌细胞系D121细胞内LDHA基因,分别给予B6小鼠接种NC组D121细胞和LDHA KD D121细胞得到肺腺癌小鼠模型。记录两组荷瘤鼠肿瘤大小,绘制肿瘤增长曲线,以此评估LDHA敲低对小鼠肿瘤增长的影响。第20天处死小鼠,流式检测两组荷瘤小鼠脾脏、肿瘤内CD8+INFγ+T细胞、CD8+GrB+T细胞、CD25+CD81+B细胞、IL-10+B细胞、Treg细胞和MDSCs的比例,以及B细胞内ROS表达水平,磁珠分选两组肿瘤内B细胞,荧光定量PCR比较两组B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达水平,明确乳酸对Breg样细胞分化的影响及其促进肿瘤增长的机制。（5）流式细胞分析法测定肺癌患者及健康对照组外周血中CD24hiCD38hiB细胞和IL-10+B细胞的比例,磁珠分选健康人外周血中T和B细胞,乳酸培养B细胞2天,B细胞与CFSE标记的CD3、CD28刺激的T细胞共培养3-5天,流式评估乳酸对B细胞IL-10、ROS及CD24、CD38表达的影响,流式评估乳酸诱导的Breg样细胞对T细胞增殖的影响。通过免疫荧光染色明确肺腺癌组织及癌旁组织内LDHA与ROS+CD19+B细胞的共定位关系,明确乳酸对表达ROS的Breg样细胞分化的影响。研究结果:（1）乳酸上调小鼠B细胞CD25和CD81的表达,使B细胞具有Breg样表型。（2）乳酸诱导的Breg样细胞显着抑制T细胞增殖。乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能与IL-10、TGFβ、PD-L1、arg-1、i NOS、IDO等效应分子无关。（3）乳酸通过NADPH氧化酶上调小鼠B细胞ROS的表达,乳酸诱导的Breg样细胞通过ROS发挥抑制T细胞增殖的免疫调节功能。（4）乳酸促进小鼠B细胞中GPR81 m RNA的表达,GPR81激动剂3,5-DHBA处理的B细胞高表达ROS,并抑制T细胞增殖,而GPR81阻断剂3-OBA可逆转乳酸诱导的Breg样细胞的免疫抑制功能,乳酸通过结合并激活GPR81受体诱导小鼠B细胞发挥免疫抑制功能。（5）乳酸通过结合小鼠B细胞表面GPR81受体,促进小鼠B细胞中PPARα的表达,诱导B细胞内ROS表达水平增高,PPARα阻断剂逆转乳酸诱导B细胞ROS的表达和免疫抑制功能的发挥,乳酸通过GPR81-PPARα-ROS通路诱导Breg样细胞分化并发挥免疫抑制功能。（6）LDHA敲低使荷瘤小鼠肿瘤体积减少,肿瘤组织内Ki-67表达降低,脾脏及肿瘤内CD25+CD81+B细胞和MDSCs比例降低,肿瘤组织内B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平降低,同时,肿瘤引流淋巴结、脾脏及肿瘤内CD8+INF-γ+T细胞及CD8+Gr B+T细胞比例增多,而肿瘤内Treg细胞比例降低。（7）肺腺癌患者外周血乳酸含量、CD24hiCD38hiBreg细胞和IL-10+Breg细胞比例高于健康对照组,乳酸上调B细胞CD24、CD38及IL-10的表达,并促进B细胞内NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平,乳酸培养的B细胞通过ROS抑制T细胞增殖。人肺腺癌肿瘤组织内LDHA表达水平高于癌旁组织,并与表达ROS的CD19+B细胞共定位。结论:乳酸通过GPR81/PPARα/NADPH氧化酶信号诱导B细胞分化为Breg样细胞,Breg样细胞通过ROS抑制T细胞增殖,促进肿瘤进展,敲低肿瘤细胞内LDHA减少Breg样细胞的产生及其ROS的表达,提示靶向降低肿瘤微环境内乳酸含量,可以减少Breg样细胞的分化,进而起到抗肿瘤的治疗作用。这为肿瘤内Breg细胞的致病作用提供新的理论依据,为临床治疗肿瘤提供新的思路。
罗璇[3]（2021）在《一、糖代谢对原发性干燥综合征B细胞功能影响的研究 二、原发性干燥综合征外周血单核细胞DNA甲基化分析》文中研究表明第一部分糖代谢对原发性干燥综合征B细胞功能影响的研究背景和目的原发性干燥综合征（Primary Sj（?）gren’ssyndrome,pSS）以高免疫球蛋白血症和外分泌腺受累为主要特征的系统性自身免疫病。临床主要表现为唾液腺及泪腺组织受累引起的口干、眼干、猖獗性龋齿和腮腺炎等。长期以来,临床及机制研究表明B细胞的异常,可导致pSS出现自我反应性自身抗体的出现,并贯穿疾病始终,因此,B细胞被认为是pSS发病的关键细胞。细胞代谢是细胞存活周期中一个不可缺少的生化过程,它提供了非常基本的能量和物质。近年研究认为,免疫细胞的代谢异常可能在自身免疫性疾病的发展中起着关键作用。由于B细胞在pSS发病、发展过程中发挥了重要作用,而目前pSS外周血B细胞的代谢情况尚无报道。因此,本研究重点关注pSS患者B细胞糖代谢是否存在异常,抑制B细胞糖酵解和氧化呼吸通路是否会影响B细胞的活化、增殖、分化、类别转化及B细胞分泌抗体的能力。材料和方法本研究共入组pSS患者35例,纳入年龄、性别匹配的健康对照者43例。分离外周血单个核细胞（PBMC）并利用磁珠分选法分选出外周血B细胞,应用Seahorse XF24的糖酵解压力测试模块和线粒体压力测试模块,检测B细胞的糖酵解和氧化磷酸化水平。应用流式细胞术检测糖酵解抑制剂和氧化磷酸化抑制剂对B细胞的活化、增殖及分化的影响;应用qPCR技术检测抑制代谢通路后B细胞向浆细胞分化时基因变化。并对既往B细胞高通量测序数据进行再分析。结果1.可溶性CD40配体（sCD40L）+白介素（Interleukin-4,IL-4）+胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）的寡脱氧核苷酸（ODN）刺激方案下,pSS外周血B细胞较健康对照拥有更高的最大糖酵解能力和最大呼吸能力;2.sCD40L+IL-4+CpG 方案培养（加/不加 2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-arabino-hexose,2-DG）（2mM）处理）,B细胞活化相关因子CD80平均荧光强度（mean fluorescence intensity,MFI）显着降低（2485.57±626.11 vs.3001.00±798.53,P=0.03）,B 细胞活化相关因子 CD86MFI 显着降低（4653.43±1305.40 vs.7103.00±2259.41,P<0.001）;sCD40L+IL-4+Anti-IgM 方案培养（加/不加 2-DG（2mM）处理）,B 细胞活化相关因子 CD80MFI 显着降低（1586.14±249.89 vs.1845.43±259.24,P=0.002）,B细胞活化相关因子 CD86MFI 显着降低（3960.71±1221.45 vs.6736.57±2680.82,P<0.001）;3.采用sCD40L+IL-4+CpG培养方案对外周血B细胞进行培养,随着2-DG浓度的增加,无论是在SS组还是HC组,外周血B细胞的增殖均可被2-DG显着抑制,差异具有统计学意义（2-DG=1mM,P=0.014;2-DG=2 mM,P=0.017）;4.采用 sCD40L+IL-4+CpG 方案培养,结果表明 CD19+IgD+CD38+/-Naive B细胞在2-DG（2mM）的干预下比例出现升高（80.58%±6.28%vs.72.82%±9.19%P=0.029）,CD 19+IgD-CD38-memory B 细胞比例下降（2.12%±1.21%vs.4.51%±0.35%,P=0.013）,CD19+IgD-CD38hi 浆母细胞比例下降（0.6%±0.18%vs.1.19%±0.16%,P=0.004）,差异具有统计学意义;采用sCD40L+IL-4+Anti-IgM方案培养,结果表明CD19+IgD+CD38+/-Naive B细胞在2-DG（2mM）的干预下比例出现升高（83.30%±5.38%vs.79.35%±5.77%P=0.019）,CD19+IgD-CD38-memory B 细胞比例下降（3.50%±0.57%vs.4.52%±0.69%,P=0.026）,CD19+IgD-CD38hi 浆母细胞比例下降（0.28%±0.06%vs.0.52%±0.11%,P=0.049）;5.采用sCD40L+IL-4+CpG方案培养,使用2-DG（2mM）或二甲双胍（10mM）处理后,PAX5mRNA 表达显着下降（2-DG:0.12±0.02 vs.0.37±0.17,P=0.02;Met:0.08±0.06 vs.0.37±0.17,P=0.03）,而对IRF4及XBP1 的影响不显着。采用 sCD40L+IL-4+CpG 方案培养,当 2-DG=2mM 时,PAX5 mRNA 的表达量（0.079±0.017 vs.0.147±0.019,P<0.001）及 IRF4 mRNA 的表达量（0.093±0.005 vs 0.20±0.036,P=0.044）显着下降;使用二甲双胍干预时,PAX mRNA（Met=5mM:0.106±0.036 vs.0.147±0.020,P=0.002;Met=10mM:0.047±0.029vs.0.147±0.020,P=0.004）表达量及 XBP1 mRNA表达（0.085±0.040 vs.0.543±0.207,P=0.012）显着减少;6.sCD40L+IL-4+CpG 培养方案下,2-DG（2-DG=2mM:43.23±10.59（ng/mL）vs64.78±13.32（ng/mL）,P=0.003;2-DG=1mM:51.11±6.48（ng/mL）vs.64.78±13.32（ng/mL）,P=0.028）和二甲双胍（Met=10mM:50.60±29.68（ng/mL）vs.77.46±28.64（ng/mL）,P<0.001;Met=5mM:61.46±35.58（ng/mL）vs.77.46±28.64（ng/mL）,P=0.016）均可明显抑制B细胞分泌IgG的能力;pSS外周血B细胞分泌的IgM可受到 2-DG（2-DG=2mM:5.14±2.05（ng/mL）vs.12.70±4.74（ng/mL）,P<0.001;2-DG=1mM:7.53±4.54（ng/mL）vs.12.70±4.74（ng/mL）,P=0.013）和二甲双胍（Met=10mM:10.25±2.51（ng/mL）vs.16.722±4.10（ng/mL）,P=0.02）的抑制;pSS外周血B细胞分泌的IgA可受到2-DG抑制（2-DG=2mM:5.77±1.89 vs.9.16±3.37,P=0.031;2-DG=1mM:7.21±2.14vs.9.16±3.37,P=0.039）,差异具有统计学意义。7.挖掘既往pSS外周血B细胞高通量测序数据,其中部分差异基因可富集于代谢相关通路,包括糖代谢、氨基酸代谢和脂肪酸代谢。结论pSS外周血B细胞拥有更高的糖酵解能力和呼吸能力,使用代谢通路抑制剂可在一定程度上抑制B细胞功能,包括B细胞的活化、增殖、分化及抗体分泌。代谢可能参与pSS外周血B细胞功能的维持。第二部分 原发性干燥综合征外周血单核细胞DNA甲基化分析背景和目的近年来随着机制研究的深入,固有免疫系统在原发性干燥综合征（Primary Sj（?）gren’ssyndrome,pSS）中的作用备受关注,越来越多的证据指出固有免疫在pSS早期阶段和维持促炎的重要性。单核/巨噬细胞是固有免疫系统的重要组成部分,研究认为,单核/巨噬细胞功能的紊乱会造成自身免疫的发生,单核/巨噬细胞反映了pSS患者的炎症状态,可能与pSS的发病密切相关。越来越多的证据表明表观遗传对自身免疫性疾病的发病机制有贡献。既往研究表明,T细胞、B细胞DNA甲基化模式的改变是pSS发生发展的一个重要特征。我们对来自pSS和对照受试者的外周血单核细胞（Monocyte）进行DNA甲基化研究,从多个角度分析pSS外周血单核细胞DNA甲基化的特征。材料和方法本实验入组北京协和医院风湿免疫科门诊就诊的pSS患者1 1例,并收集年龄、性别相匹配的健康人5例。应用磁珠分选法对外周血CD14+单核细胞进行阳选,应用Illumina850K甲基化芯片对单核细胞存在的DNA甲基化位点进行检测。通过对比分析,筛选出pSS和健康对照者之间的差异DNA甲基化位点（DMPs）,利用GO注释和KEGG pathway对DMPs所注释的基因进行富集,分析DMPs注释基因可能存在的生物学功能。结果1.通过对11例pSS患者和5例健康对照者外周血单核细胞进行DNA甲基化芯片检测,通过比对,共筛选到2819个DMPs（1977个低甲基化位点和842个高甲基化位点）;2.在2819个DMPs中筛选到25个满足|Δβ|>0.6且P<0.05的DMPs,注释到17个基因上,其中IFI44L、MX1、PARP9、EPSTI1、IFITM1与IFN信号通路相关,分析pSS和HC中这些基因的变化模式,我们发现这些DMP在pSS中均为低甲基化表现;3.pSS患者和健康对照者之间共检测到1193个DMR,存在于1053个基因上,最显着的DMR位于6号染色体（adjustP=2.98E-37）,与TNXB对应。TNXB位于6号染色体,属于腱生蛋白家族,与细胞黏附相关;4.GO分析注释发现DMPs注释基因涉及的生物过程主要包括细胞黏附、抗原提呈、I型干扰素通路;进行KEGG pathway分析发现DMPs注释基因富集在钙信号通路、cGMP-PKG信号通路、抗原提呈、细胞黏附及病毒感染等通路。5.将外周血单核细胞的DMPs与来自公开数据库唾液腺上皮细胞（SEGC）、T淋巴细胞、B淋巴细胞的DNA甲基化数据进行比较,单核细胞与唾液腺上皮细胞有21个相同DMPs,与T淋巴细胞之间有11个共同DMPs,与B细胞之间有85个相同DMPs。共同低甲基化DMPs所注释的基因多与IFN信号通路相关;6.分析抗SSA抗体+并且抗SSB抗体+的pSS患者与健康对照者之间的差异,对DMPs注释的差异基因进行分析,发现主要富集于细胞黏附、抗原提呈以及病毒感染等相关通路,而抗SSA抗体+并且抗SSB抗体-的pSS患者与健康对照者之间DMPs明显少于抗SSA抗体+并且抗SSB抗体+的pSS患者;7.分析高IgGpSS患者（IgG≥18g/L）与非高IgGpSS患者（IgG<18g/L）外周血单核细胞的DNA甲基化模式,共筛选到89个DMPs,包括21个高甲基化的DMPs,注释68个低甲基化的DMPs,KEGG Pathway分析,发现差异DMPs注释到的基因主要富集到Notch信号通路、丙酮酸代谢及氨基酸代谢相关通路。结论pSS单核细胞中存在异常的DNA甲基化,强调了固有免疫及表观遗传DNA甲基化的异常在pSS发病机制中的潜在作用,并表明IFN相关基因以及单核细胞黏附、Notch信号通路、抗病毒和抗原加工/呈递相关的基因在外周血单核细胞中存在异常DNA甲基化状态。
汤亚微[4]（2021）在《类风湿关节炎患者外周B细胞功能紊乱的糖代谢机制研究》文中研究说明背景类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以多关节、对称性滑膜炎为主要特征的慢性自身免疫病,其发病机制主要与T细胞亚群分化失衡、细胞因子网络调节紊乱及自身抗体产生密切相关。免疫细胞的活化需要大量的能量和代谢物供应满足其生物合成的需求,从而完成增殖、分化和效应功能的执行;此外,免疫细胞的功能又会受到代谢信号的调控。研究显示,在不同活化状态和病理因素作用下,B细胞通过选择合适的代谢途径介导其增殖、抗体产生等免疫功能。RA患者体内存在大量自身抗体,提示B细胞功能紊乱参与疾病的发生和发展,但引起RA患者外周B细胞功能紊乱的机制尚不清楚。滤泡辅助性T（T follicular helper T,Tfh）细胞是一群位于次级淋巴器官生发中心内具有辅助B细胞活化及产生抗体功能的T细胞亚群。近年来,在RA及其它自身免疫病的非淋巴器官中发现能辅助B细胞应答的Tfh-like细胞,在B细胞活化、分化和产生抗体的过程中发挥更重要的作用。目的本课题旨在揭示RA患者外周B细胞的能量代谢类型及对其功能紊乱的影响,阐明RA炎症微环境调控外周B细胞功能紊乱的代谢机制;此外,本课题将进一步研究RA患者外周中辅助B细胞产生抗体的关键T细胞亚群及潜在机制。方法分离RA患者和健康对照组（Healthy control,HC）外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,流式细胞术检测浆母细胞（CD19+CD27+CD38hi）、浆细胞（CD19+CD138+）百分比,B细胞表面共刺激分子CD80和CD86表达、哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路磷酸化水平、缺氧诱导因子-1?（Hypoxia inducible factor-1?,HIF-1?）表达、葡萄糖摄取能力以及糖酵解相关限速酶表达;免疫磁珠法分离RA患者和HC外周血中CD19+B细胞,用anti-CD40/Cp G联合刺激1-5天,实时荧光定量PCR和流式细胞术检测B细胞中糖酵解和脂肪酸氧化相关限速酶表达,流式细胞术检测B细胞表面共刺激分子CD80和CD86表达、增殖、凋亡和各亚群百分比,酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞培养上清中免疫球蛋白和细胞因子水平,比色法检测上清中乳酸含量,在部分培养体系中加入糖酵解抑制剂2-DG、mTOR通路抑制剂雷帕霉素或脂肪酸氧化抑制剂乙克莫舍;分离HC中CD19+B细胞,分别用含2%胎牛血清、2%RA患者血清和2%健康对照组血清刺激1-5天,在部分实验中加入抗IL-27抗体,流式细胞术检测B细胞增殖、活化、分化、葡萄糖摄取能力及mTOR信号通路磷酸化水平,实时荧光定量PCR方法和流式细胞术检测糖酵解相关限速酶表达,比色法检测细胞培养上清中乳酸水平;收集RA患者和HC血清,蛋白芯片方法检测其中440种细胞因子表达,ELISA方法检测IL-27和免疫球蛋白Ig M、Ig G水平,比色法检测乳酸含量,并分析RA患者血清中IL-27水平与临床指标相关性;分离RA患者CD19+B细胞,体外用重组IL-27刺激1-5天,在部分实验中加入抗IL-27抗体、2-DG或雷帕霉素,流式细胞术检测B细胞增殖、活化、分化、葡萄糖摄取能力、B细胞表面gp130、WSX-1表达以及mTOR信号通路磷酸化水平;实时荧光定量PCR和流式细胞术检测B细胞中糖酵解相关限速酶表达;ELISA方法检测上清中免疫球蛋白和细胞因子水平,比色法检测上清中乳酸含量;分离RA患者和HC外周血PBMCs,流式细胞术检测CD4+PD-1+T细胞和CD4+PD-1+Foxp3-T细胞百分比,并分析其数量与RA患者临床指标相关性;流式细胞术检测CD4+PD-1+T细胞和CD4+PD-1+Foxp3-T细胞表面活化分子（ICOS、CD40L、HLA-DR、CD38）表达和分泌细胞因子（IL-4、IL-6、IL-10、IL-21）情况;流式细胞术分离RA患者CD4+PD-1-T细胞、CD4+PD-1+CD25-T细胞CD4+PD-1+CD25+T细胞分别与异基因B细胞共培养8天,流式细胞术检测浆母细胞和浆细胞百分比,收集细胞培养上清,ELISA检测免疫球蛋白Ig M和Ig G水平;磁珠分离RA患者外周CD4+T细胞,在培养体系中分别加入anti-TNFR2 antibody（0.25?g/ml）、anti-IL-1?R antibody（0.25?g/ml）、anti-IL-6R antibody（0.5?g/ml）联合anti-CD3 antibody/anti-CD28 antibody（2?g/ml）培养3天,采用流式细胞术检测CD4+PD-1+Foxp3-T细胞百分比、活化和分泌细胞因子情况。结果1.RA患者外周B细胞mTOR-糖酵解信号通路增强促进其功能紊乱的研究:与HC相比,RA患者外周B细胞增殖和活化显着增加、浆母细胞和浆细胞百分比上调、但凋亡细胞百分比无显着差异;RA患者血清中免疫球蛋白Ig M和Ig G水平增加;RA患者外周B细胞糖酵解相关限速酶表达上调,其葡萄糖摄取能力及乳酸水平增加,同时mTOR信号通路磷酸化增强,阻断糖酵解或抑制mTOR信号通路可改善RA患者B细胞功能紊乱;RA患者外周中B细胞脂肪酸氧化相关基限速酶表达上调,加入脂肪酸氧化抑制剂对RA患者B细胞功能紊乱无影响。2.IL-27是RA炎症微环境促进B细胞糖酵解和功能紊乱的关键因子:与健康血清处理组相比,RA患者血清处理后可显着促进B细胞增殖、活化、向浆母细胞和浆细胞分化、抗体产生,同时促进糖酵解相关限速酶表达、葡萄糖摄取能力、乳酸分泌和mTOR信号通路磷酸化;蛋白芯片和ELISA结果显示,RA患者血清中IL-27水平显着升高,并与疾病活动度、自身抗体水平、浆细胞百分比和免疫球蛋白含量呈正相关;在RA患者血清处理的培养体系中加入抗IL-27抗体后,可抑制RA血清引起的B细胞增殖、活化、向浆母细胞和浆细胞分化、抗体产生,同时抑制糖酵解相关限速酶表达、葡萄糖摄取能力、乳酸分泌和mTOR信号通路磷酸化。3.IL-27通过激活mTOR-糖酵解信号通路促进RA患者外周B细胞功能紊乱的研究:与健康对照组相比,RA患者外周B细胞中IL-27受体gp130和WSX-1表达升高,体外重组IL-27刺激可促进RA患者外周B细胞中IL-27受体表达上调;与对照组相比,重组IL-27刺激可促进RA患者外周B细胞增殖、活化、向浆母细胞和浆细胞分化、抗体产生,同时促进糖酵解相关限速酶表达、葡萄糖摄取能力、乳酸分泌和mTOR信号通路磷酸化,在上述培养体系中加入抗IL-27抗体、糖酵解抑制剂或mTOR通路抑制剂后,可明显抑制重组IL-27引起的B细胞功能紊乱、糖酵解以及mTOR信号通路磷酸化。4.CD4+PD-1+Foxp3-T细胞辅助RA患者外周B细胞产生抗体的研究:与健康对照组相比,RA患者外周中CD4+PD-1+Foxp3-T细胞百分比显着上调,同时其数量与患者自身抗体水平、浆细胞百分比和免疫球蛋白水平呈明显正相关。与CD4+PD-1+Foxp3+T细胞相比,RA患者CD4+PD-1+Foxp3-T细胞表面ICOS、HLA-DR、CD40L和CD38表达明显升高,其分泌细胞因子IFN-?、IL-4、IL-6、IL-10和IL-21能力显着增强;RA患者CD4+PD-1+Foxp3-T细胞Ki67表达明显升高,其表面不表达CD25、部分表达CXCR5;与CD4+PD-1+CD25+T细胞相比,CD4+PD-1+CD25-T细胞可显着促进B细胞向浆母细胞和浆细胞分化,并促进其产生免疫球蛋白Ig M;与未处理的CD4+T细胞相比,加入anti-IL-6R抗体后可抑制RA患者CD4+T细胞中CD4+PD-1+Foxp3-T细胞百分比、活化和分泌细胞因子,而加入anti-TNFR2抗体和anti-IL-1?R抗体则无此作用。结论:RA患者外周B细胞mTOR-糖酵解信号通路增强促进其功能紊乱,血清中IL-27是介导此过程的关键因子;RA患者外周中的CD4+PD-1+Foxp3-T细胞数量增多,并可通过辅助B细胞产生抗体参与RA发病。
张禹[5]（2020）在《调节性B细胞在原发性胆汁性胆管炎免疫机制中的作用》文中提出背景和目的调节性B细胞（regulatory B cells,Breg）是近些年发现的具有免疫负调节功能的B细胞亚群,现已发现Breg在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化等多种自身免疫疾病中存在数量及功能异常,提示Breg在这些疾病的致病及发展过程中可能起到重要作用。PBC为典型的自身免疫性疾病,但免疫调节治疗如B细胞清除在PBC却未取得预期的疗效,另外B细胞清除在PBC动物模型中的试验结果也进一步提示除浆细胞外调节性B细胞在PBC致病及发展过程中也起到了重要作用,目前国内外缺乏PBC调节性B细胞功能状态的研究,因此本课题拟探究调节性B细胞在原发性胆汁性胆管炎免疫机制中的作用。方法收集PBC患者及健康对照外周血,分离PBMC,流式细胞技术测定CD19+CD24hiCD38hi（过渡 Breg）、CD19+CD27+CD24hi（记忆 Breg）、CD19+CD27intCD38+（浆母样Breg）占CD19+B细胞比例,同时测定各Breg表面分子CD80、CD86、CD40、IL21r表达情况。利用Leukocyte Activation Cocktail体外刺激孵育5小时后测定各Breg产IL10表达水平,加入IL21更改刺激条件,探究IL21对Breg产IL10的影响。结果1.本研究共纳入PBC患者23例,其中女性21例,男性2例,平均年龄为55±12.09岁,中位病程为24个月,纳入年龄、性别相匹配健康对照39例。2.PBC患者外周血记忆Breg占CD19+B细胞比例较健康对照组显着降低（9.57±5.97 VS 15.67±7.42 P<0.01）,而过渡Breg占CD19+B细胞比例较健康对照组显着升高（5.90±3.2 VS 4.43±1.56 P=0.02）,PBC患者与健康对照浆母样Breg占CD19+B比例无显着差异（1.50±1.13 VS 1.61±0.91 P=0.71）,PBC患者成熟B细胞占C D19+B细胞比例较健康对照组显着升高（42.65±9.29 VS 37.09±7.22 P=0.02）。3.过渡Breg占CD19+B细胞的比例与TBA呈显着正相关（r=0.57,p=0.01）,与Ig G呈显着正相关（r=0.61,p=0.01）,与IgA呈显着正相关（r=0.66,p=0.00）,与ESR呈显着正相关（r=0.61,p=0.02）。记忆Breg占CD19+B细胞比例与IgG、IgA、ESR成负相关,但是无显着性（r=-0.24,p=0.33;r=-0.36,p=0.13;r=-0.51,p=0.05）。4.PBC患者CD80在过渡Breg、CD19+B细胞表达比例较健康对照显着降低（1.31±1.26 VS 4.59±3.79 P=0.006,5.56±4.43 VS 9.78±5.95 P=0.046）。PBC 患者 CD86在浆母样Breg表达比例较健康对照显着升高（36.55±23.31 VS 14.65±14.06 p=0.007）。PBC患者CD40在过渡Breg表达比例较健康对照显着升高（5.13±4.96 VS 1.55±1.67 p=0.023）,PBC患者CD40在记忆Breg细胞表面表达平均荧光强度较健康对照显着升高（68.01±22.06 VS 50.48±15.49 P=0.036）。PBC 患者 IL21r 在过渡 Br eg表达平均荧光强度较健康对照显着降低（218.00±67.00 VS 290.00±76.00 p=0.033）。5.记忆 Breg IL10 表达水平显着高于过渡 Breg（19.60±3.79 VS 11.62±1.97 p=0.000）。在相同条件下PBC各Breg产IL10水平较健康对照无显着差异。6.AC+21组浆母样Breg产IL10B细胞比例较AC组显着增加（21.80±9.02 VS 19.34±3.82 p=0.008）,AC+21组过渡Breg、浆母样Breg产IL10的平均荧光强度较A C 组显着增加（150.80+23.30 VS 116.80+11.88 p=0.046,261.20+108.72 VS 200.40+51.66 p=0.002）。结论PBC患者外周血Breg 比例功能存在紊乱,过渡Breg 比例显着升高,而记忆Br eg比例显着减少,且过渡Breg与记忆Breg比例呈显着负相关。Breg水平与IgG、ESR、TBA有一定的相关性。Breg比例与CD80、CD86表达水平有一定相关性。P BC患者各Breg亚群表达IL10水平与健康对照相比无明显差异。IL21能提高Breg IL10表达水平,而PBC患者Breg IL21受体表达水平降低参与了 PBC Breg功能紊乱。
邓磊[6]（2020）在《造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究》文中研究说明背景:微嵌合是指个体内一小部分细胞或DNA来自于另一个体的现象。微嵌合与移植耐受、慢性GVHD、自身免疫病等免疫过程有关,研究造血干细胞微嵌合形成的过程及其对受者T细胞免疫功能的影响具有重要意义。树突状细胞（DCs）是最重要的抗原提呈细胞之一,是T细胞活化的桥梁。修饰后的工程化树突状细胞能够增强对T细胞的调节作用,Mo S2纳米薄片（MSNs）由于优异的物理和化学性质,已应用于生物成像探针、生物传感器、光热治疗剂、药物载体和组织工程支架等方面。利用其作为佐剂来修饰树突状细胞是一个非常吸引人的研究课题。机体内的抗肿瘤免疫反应主要通过激活T细胞来杀死肿瘤细胞。原发性皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）是最常见的皮肤淋巴瘤,晚期皮肤T细胞淋巴瘤的5年生存率仍不到25%。早期阻止皮肤T细胞淋巴瘤的进展,将避免疾病晚期的高死亡率。方法:1. 为了研究造血干细胞输注产生的微嵌合过程及其对受者免疫功能的影响,我们将G-CSF动员后的C57脾细胞输注给不接受预处理的CB6F1可形成微嵌合。通过多色流式技术标记小鼠不同细胞亚群及供受细胞H-2抗原的不同,我们可以比较不同细胞亚群微嵌合形成的异同。通过小动物活体成像系统及C57BL/6-Tg（Fluc+/-）小鼠我们可以在活体内完整观察供者细胞在受者体内分布及扩增形成微嵌合的过程。多色流式技术使我们进一步可以检测微嵌合形成过程中供受者T细胞活化的状态及骨髓干祖细胞扩增的情况。通过流式分选细胞然后进行RNA-Seq,我们可以掌握微嵌合前后受者T细胞RNA的表达情况。2.我们使用了分别为100-250纳米（S-MSNs）和400-500纳米（L-MSNs）的少层状Mo S2薄片（MSNs）来修饰DCs。骨髓培养的DCs暴露在不同剂量（0、8、16、32、64、128μg/ml）MSNs中48h后,检测其表面标志、细胞因子分泌。应用小动物活体成像系统体内追踪DCs的归巢,通过流式检测其对局部淋巴结T细胞的活化作用。3.我们在-2天于C57BL/6小鼠接种EG7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞,于0天经尾静脉输注G-CSF动员后Balb/c小鼠脾细胞。分别在第0天和第7天将共孵育的DCs注入小鼠右侧脚垫中,并在第7天和第14天取小鼠尾静脉血通过多色流式技术检测嵌合。在第14天通过流式和细胞计数检测外周血及腘窝淋巴结T细胞的增殖活化。于第7天、10天、14天用游标卡尺测量并计算小鼠肿瘤体积。结果:1. DCI-6E7组在输细胞后+1天供者细胞植入为1.76±0.49%,+4天供者细胞嵌合到达最高2±0.54%,在7-14天其嵌合波动于1.2-1.9%,未见明显下降。但是14-21天其嵌合迅速降至0.18%,而后持续下降。DCI-6E7组小鼠细胞输注后体重逐渐上升,小鼠饮食、毛色、体态均未见明显异常,外周血白细胞仅仅是轻微下降而后恢复,但是血小板和血红蛋白却无明显变化。DCI-6E7组受鼠在1-14天时T、B细胞及其他亚群仅形成低比例供者嵌合（1.1%～4.5%）;+14天各细胞亚群嵌合均开始快速下降,至+28天,流式细胞术仅检测到极少量供者嵌合。6×107组CD3+,CD11b+,B220+细胞比例仅有轻度变化,分别波动于31.1-47.8%,25.6%-36%,8.6%-24.3%。CD4/CD8波动于1.5-3.2,持续>1。DCI-6E7组荧光强度在0-12小时上下波动,于+1天减弱,而1-5天无明显变化,并于第5-7天升高,随后持续下降,供者细胞荧光信号6×107组主要集中于淋巴结和脾脏。DCI-6E7组供者来源活化T细胞在输注后4-7天有不同程度扩增,而后逐渐下降。受者来源T细胞活化相关标志则在细胞输注后7-21天有剧烈扩增,而后逐渐下降。输细胞后+10天相对于输细胞前受者CD4+细胞差异基因明显上调的基因数目多余下调的基因数目,受者CD8+细胞差异基因明显下调的基因数目多余上调的基因数目。他们参与多种生物学过程和细胞组分以及分子学功能,涉及调节多种信号通路（包括免疫与炎症反应、自身免疫性疾病、感染性疾病等）。其中有许多基因参与免疫与炎症反应,他们通过调节TH1/TH2、TH17细胞的分化或直接通过细胞间的粘附通路调节炎症反应。2. 所有剂量（0-128μg/ml）不同大小的MSNs均不影响DCs的活性。128μg/ml的S-MSNs和L-MSNs处理的DCs其CD40、CD80、CD86和CCR7的表达显着升高。IL-12p70的分泌保持不变,而IL-1β减少分泌,TNF-α的分泌在某种程度上与MSNs治疗的剂量有关。只有128μg/ml的L-MSNs处理的DCs显着观察到增加的IL-6。MSNs处理显着促进了个体局部淋巴结和血液循环中DCs的体内外运动和体内归巢能力。DCs归巢能力增强的原因细胞是因为受ROS升高调节的细胞骨架的重排。经MSNs修饰的DCs接种到小鼠中,CD4+和CD8+T细胞的增殖和活化更为明显（以CD107a、CD69和ICOS的高表达为特征）。MSNs的处理并没有影响LPS诱导的DC激活、归巢和T细胞启动。3. OVA和MSNs的细胞毒性并不高,OVA单独不能促进DCs的成熟,而和MSNs共培养可以促进DC成熟,其特征是CD40,CD80和CD86的升高,增强IL-6的分泌。外周血造血干细胞输注可以在肿瘤小鼠体内产生供者细胞微嵌合,随着时间的延长有下降的趋势。外周血造血干细胞输注可以刺激肿瘤小鼠外周血B细胞和T细胞的扩增。特别是刺激了CD4+细胞、CD8+细胞中CD107a、CD69、ICOS活化标志细胞的大量扩增。DCs免疫可以刺激小鼠局部淋巴结中B细胞和T细胞的扩增,Mo S2修饰后可以进一步放大这种效果。特别是刺激了CD4+细胞,CD8+细胞中CD107a、CD69、ICOS活化标志细胞的大量扩增。对小鼠进行OVA-DCs免疫治疗可以抑制小鼠肿瘤的生长,而加上Mo S2修饰的DCs可以进一步抑制小鼠肿瘤生长。单独输注外周血造血干细胞也可以抑制肿瘤的生长。联合外周血造血干细胞输注和Mo S2-OVA-DCs免疫对肿瘤细胞的抑制效果最好。结论:1.通过活体成像,我们观察到供者细胞在受者体内形成微嵌合的过程。造血干细胞输注形成微嵌合与传统大嵌合相比仅轻度降低血象、无GVHD,激活了受者T细胞,并且可以刺激受者骨髓造血干祖细胞的扩增,调节受者免疫功能与炎症反应。这些结果为研究微嵌合的形成及其在抗肿瘤、自身免疫性疾病及促造血中的作用提供了基础。2.在DC的工程化修饰中,在相对高剂量（128μg/ml）时,MSNs可以提高DCs的体外成熟和淋巴结归巢,并大幅度提高DCs的活化能力,引起更强的CD4+和CD8+T细胞免疫反应。此外,ROS诱导的细胞骨架排列参与了MSNs修饰的DCs运动能力的提高。作为第一个系统研究MSNs对DC修饰的工作,我们的发现为修饰DC提供了新的方法,同时为MSNs作为免疫调节佐剂提供了支持证据。3. 造血干细胞微嵌合和二硫化钼纳米薄片修饰的DCs均具有一定抑制肿瘤的作用,联合二者可以发挥更强的抑制肿瘤生长的作用。发挥这一作用的途径可能是通过激活受者外周血及局部淋巴结T细胞的活化和扩增。
朱青青[7]（2020）在《系统性红斑狼疮患者外周血CD19+B细胞PD-1/PD-Ls分子表达特点及临床意义的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus,SLE）是一种累及全身的慢性自身免疫性疾病。异常活跃的B细胞参与SLE发病的几乎所有阶段。PD-1（Programmed Cell Death-1,CD279）是属于CD28/CTLA-4家族的抑制性受体。PD-1与其配体PD-L1或PD-L2相互作用产生的抑制信号有助于维持免疫耐受。B细胞表面PD-1/PD-Ls表达水平可能在SLE发病机制中起着重要作用。目的:本研究旨在探索CD19+B细胞和CD19+CD20-B细胞上PD-1/PD-Ls的表达情况,并探讨其在SLE疾病发生发展中的可能作用。方法:1.应用流式细胞仪检测SLE患者和健康对照（HC）外周血中CD19+B细胞表面PD-1/PD-Ls的表达情况,并与临床和实验室参数作相关性统计分析。应用磁珠分选技术分选SLE患者和健康对照（HC）外周血中CD19+B细胞并加入CPG或IFN-γ培养,测定不同时间段表面PD-1、PD-L1、PD-L2的表达情况。应用酶联免疫吸附试验检测SLE患者和健康对照（HC）血浆中可溶性PD-1、PD-L1、PD-L2的水平,并与临床和实验室参数作相关性统计分析。2.应用流式细胞仪检测SLE患者和健康对照（HC）外周血中CD19+CD20+/-B细胞以及其上PD-1、PD-L1、PD-L2、CD80、CD86的表达情况,并与临床和实验室参数作相关性统计分析。应用磁珠分选技术分选SLE患者和健康对照（HC）外周血中CD19+CD20+B细胞和CD19+CD20-B细胞并加入刺激剂培养,检测其细胞增殖和不同时间段分泌抗双链DNA（ds-DNA）和免疫球蛋白-G（IgG）情况。结果:1.SLE患者外周血CD19+B细胞表面PD-1、PD-L1、PD-L2的表达水平高于HC组;SLE患者活动组CD19+PD-1-PD-L1+B细胞和CD19+PD-L1+PD-L2-B细胞的频率显着高于稳定组和HC组,并且与部分疾病活动指标显着相关。在CPG或IFN-γ的刺激培养下,SLE患者CD19+B细胞表面PD-L1和PD-L2表达频率显着上调。SLE患者血浆中可溶性PD-L1和PD-L2的水平高于HC组;SLE患者可溶性PD-L1活动组高于稳定组,狼疮肾炎组高于非狼疮肾炎组,并且与SLEDAI评分显着相关。2.SLE患者活动组外周血CD19+CD20-B细胞频率显着高于SLE患者稳定组和HC组;在SLE患者中,CD19+CD20-B细胞表面PD-1、PD-L1、PD-L2和CD86的表达水平明显高于CD19+CD20+B细胞,并且与部分疾病活动指标显着相关。SLE患者CD19+CD20-B细胞ds-DNA和IgG的分泌量高于HC组CD19+CD20+/-B细胞分泌量,并且SLE患者CD19+CD20-B细胞具有一定的分裂增殖能力。结论:研究表明SLE患者外周血B细胞表面PD-1/PD-Ls的异常表达和血浆可溶性PD-L1的异常水平以及CPG或IFN-γ刺激的B细胞表面PD-L1、PD-L2表达上调,均提示可能与SLE疾病的发生发展和活动有关。SLE患者外周血CD20-B细胞和其表面PD-1、PD-L1、PD-L2和CD86的异常表达以及CD20-B细胞具有增殖和分泌自身抗体的能力,均提示CD20-B细胞可能是活化的B细胞,并且可能是CD20靶向治疗疗效不理想的原因。
徐淑琴[8]（2020）在《SP-A通过树突细胞调控Tfh细胞分化参与缓解哮喘气道炎症反应》文中研究说明哮喘是一种常见的呼吸道炎症性疾病,以气道高反应性为主要特征,各个年龄阶段的人群都可累及。对哮喘的治疗和管理不仅给家庭造成了较重的经济负担,也消耗了大量的社会医疗资源。哮喘的发病机制非常复杂,嗜酸性粒和中性粒细胞的浸润、淋巴细胞的异常活化以及产生针对过敏原特异性的Ig E抗体等都参与了哮喘的发生。尽管近年来对哮喘的研究取得了较大的进展,但目前哮喘的临床治疗仍高度依赖糖皮质激素、β2受体激动剂等药物,这些药物不仅存在毒副作用,而且对难治性或重症哮喘患者的治疗仍难取得较好成果。因此,寻找新的药物、更为有效地干预哮喘的发生仍任重道远。肺泡表面活性蛋白A（Surfactant protein A,SP-A）是由Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的一种蛋白,隶属凝集素家族。多项研究证实,SP-A不仅降低肺泡表面张力的作用,还具有免疫防御、炎症反应调节的作用,与哮喘的发生密切相关。滤泡辅助T细胞（T follicular helper cells,Tfh）是近年来新明确的一群CD4+T细胞,特征性的表达趋化因子受体CXCR5,在辅助B细胞完成体细胞高频突变、抗体类转换及抗体亲和力的成熟过程中发挥重要作用。既往研究提示,Tfh细胞的异常活化与哮喘的发生密切相关,但其参与哮喘气道炎症反应调控的具体调节机制仍未明。因此在本研究中,我们拟在体内外探究SP-A干预哮喘的发病机制是否通过调控Tfh细胞的方式来实现,以及探究SP-A参与Tfh细胞调控的具体机制,并在哮喘患者和健康对照者中分析循环Tfh细胞及其亚群的分布,以期为临床医生和科研工作者对哮喘治疗药物和靶点的选择上提供参考。第一部分:SP-A调控Tfh亚群组成缓解哮喘气道炎症6-8周的雌性野生型（Wide type,WT）及SP-A基因敲除(Sp-a-/-)型C57BL/6J小鼠利用鸡卵白蛋白（OVA）和氢氧化铝免疫构建哮喘模型,并分别设立磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline,PBS）处理的对照组。肺组织苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色用于观察小鼠肺组织病理改变;酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）用于检测支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中Ig E和Ig A抗体以及IL-4、IL-6、IL-17细胞因子的改变;流式细胞术用于分析小鼠脾和纵隔淋巴结Tfh细胞及其亚群的比例;体外细胞培养实验用于观察WT和Sp-a-/-小鼠Tfh细胞对B细胞的辅助能力。我们的研究发现,OVA激发后小鼠肺组织内有大量炎症细胞浸润及粘液渗出,且Sp-a-/-小鼠较野生小鼠表现更为严重。另外,无论是WT小鼠还是Sp-a-/-小鼠,OVA激发后小鼠BALF中Ig E的水平明显增高,Sp-a-/-小鼠较WT小鼠的Ig E水平明显增高且Ig A水平降低,这些结果提示,SP-A在哮喘的过程中具有保护作用。进一步对Tfh亚群进行分析,Tfh亚群组成在哮喘模型的WT和Sp-a-/-小鼠中存在不同,表现为Sp-a-/-小鼠IL-4+Tfh细胞比例高于WT小鼠,相反IFN-γ+Tfh细胞比例降低,其中IL-4+Tfh比例与肺泡灌洗液中Ig E水平呈显着正相关,而IFN-γ+Tfh比例与肺泡灌洗液中Ig E水平呈显着负相关。脾脏中IFN-γ+Tfh/IL-4+Tfh的比值在Sp-a-/-小鼠的显着低于WT小鼠,且与肺泡灌洗液中Ig E水平呈负相关。T-B细胞共培养实验发现,Sp-a-/-小鼠脾脏来源Tfh细胞具有更强的辅助B细胞合成Ig E抗体的能力。这些结果表明,异常的Tfh细胞亚群分布与哮喘的发生相关,SP-A可能通过稳定Tfh细胞亚群的分布,从而缓解哮喘气道炎症反应。第二部分:重组小鼠SP-A在体外经树突细胞调控Tfh细胞的分化我们首先利用重组pc DNA3.1?/His A-SP-A质粒转染中国仓鼠卵巢癌（Chinese hamster ovary cell,CHO）细胞系在体外构建SP-A的稳定表达体系,并获取纯化的SP-A。而后将磁珠分选获取纯化的骨髓来源的树突状细胞（Bone marrow derived dendritic cells,BMDC）以及初始型T细胞进行共培养,在培养体系中额外添加SP-A,培养5天后通过流式细胞术的方法检测Tfh细胞亚群的比例,观察SP-A在体外对Tfh细胞分化的影响。再以SP-A直接处理BMDC,24小时后利用流式细胞术检测细胞表面CD80/CD86的表达,观察SP-A在体外对BMDC细胞的影响。通过实时荧光定量PCR的方法检测WT和Sp-a-/-哮喘小鼠DC中IL-6、IL-4等细胞因子的表达水平,观察SP-A对DC细胞因子表达水平的影响。我们发现,SP-A的处理显着下调BMDC与初始（naive）T细胞共培养体系中IFN-γ+Tfh/IL-4+Tfh的比值,但对单独naive T细胞培养体系中该比值没有影响。这一结果提示,SP-A在体外对Tfh细胞亚群分化的影响依赖BMDC细胞的存在。我们进一步探究SP-A对BMDC细胞的影响,我们发现SP-A的处理显着下调脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）激活的BMDC细胞表面共刺激分子CD86的表达水平,提示SP-A可以抑制BMDC的活化。进一步比较WT和Sp-a-/-哮喘小鼠来源的DC细胞因子的相对表达水平,我们发现较WT小鼠相比,Sp-a-/-哮喘小鼠来源的DC表达更高的IL-6,这一与小鼠Tfh细胞分化密切相关的细胞因子。这些结果表明,SP-A通过抑制树突细胞的活化和影响相关细胞因子的表达,参与Tfh细胞分化的调控,稳定Tfh细胞亚群的分布。第三部分:哮喘患者外周血Tfh细胞及其亚群分布检测我们总共纳入21例哮喘患者和19例性别年龄相匹配的健康对照者,通过流式细胞术的方法,分析哮喘患者和健康对照者外周血Tfh细胞及其亚群的变化。我们发现,尽管哮喘患者与健康对照者外周血CD4+CD45RA-CXCR5+细胞比例没有统计学差异,但是其亚群的组成发生变化。其中Tfh2细胞在哮喘患者外周血中显着高于健康对照者,而Tfh1细胞比例和Tfh17细胞比例在健康对照者和哮喘患者外周血中没有显着差异。后续对哮喘患者和健康对照者血清Ig E抗体进行分析,结果显示,血清Ig E抗体升高组中Tfh2细胞的比例显着上调。这些结果提示了,Tfh细胞亚群分布异常尤其Tfh2细胞异常活化可能通过影响Ig E抗体的合成参与哮喘的发生,这为哮喘的治疗提供新的潜在靶点,但对于Tfh2细胞如何参与哮喘的发病机制仍需进一步研究。
宋晨成[9]（2019）在《干扰素α诱导T细胞分化致角质形成细胞凋亡的实验研究》文中研究表明口腔扁平苔藓（oral lichen planus,OLP）是一种T淋巴细胞介导的慢性炎症性疾病,其发病机制目前仍不明确。OLP是一种较为典型的T细胞免疫性疾病,根据其组织病理学特点,学术界普遍认为黏膜固有层带状浸润的T淋巴细胞,是造成上皮角质形成细胞（keratinocyte,KC）病理性死亡的主要原因,但是影响T细胞分化并导致其攻击KC的始动性的上游诱导机制,目前并不明确。本课题组前期研究显示,OLP损害组织中干扰素（Interferon,IFN）α含量增高,与OLP疾病的发生发展正相关,可能是导致疾病发生的早期免疫应答事件。那么,IFN-α是否能够促进KC和T细胞之间的免疫应答?这种免疫应答的机制是否基于T细胞的诱导分化,并产生相关的效应分子,最终导致KC的凋亡?解释这些问题将是揭示IFN-α在OLP中的致病性作用机制的重要基础。本研究即拟使用IFN-α分别刺激KC、T细胞以及两者的共培养体系,（1）检测并评价IFN-α对KC活性的影响,以及促进KC表达T细胞免疫相关分子的能力;（2）检测IFN-α促进T细胞亚群向Th1表型分化的功能效应;（3）同时检测其对KC-T淋巴细胞共培养体系的影响,以初步评价IFN-α在OLP中的作用机制,为解释OLP中诱导T细胞分化和效应的免疫应答机制提供依据。目的:（1）评价IFN-α对KC表达T淋巴细胞免疫相关分子的影响,包括KC表面的抗原提呈分子（HLA-I、HLA-II类分子）和共刺激分子（CD40、CD80、CD86）以及其分泌的T淋巴细胞趋化因子（CXCL10）;并评价IFN-α对KC活力的影响。（2）检测评价IFN-α诱导T淋巴细胞向Th1方向分化的能力;以及IFN-α刺激后,培养上清中T淋巴细胞来源的促凋亡相关细胞因子的变化。（3）建立T淋巴细胞和KC的共培养模型,直接观察IFN-α诱导外周血T淋巴细胞向Th1型方向极化并诱导KC凋亡的能力。方法:（1）采用IFN-α（1000U/mL）处理人永生化口腔角质形成细胞（Human oral keratinocytes,HOK细胞）和人永生化表皮细胞（HaCaT细胞）,以PBS作为阴性对照组,应用流式细胞术定量分析KC表面HLA-I类分子、HLA-DR、CD40、CD80、CD86表达水平;以ELISA法检测细胞上清中CXCL10水平;以流式细胞术和Western技术检测HOK细胞凋亡的比例和凋亡相关分子变化（2）采用IFN-α（1000U/mL）处理分离自正常人外周血的总T淋巴细胞,以PBS组作为阴性对照,采用流式细胞术检测T淋巴细胞中Th1亚群占CD4+T淋巴细胞的比例;ELISA法检测凋亡相关分子（TNF、FasL、IFN-γ）的变化;（3）建立T淋巴细胞和KC的共培养（混合培养和Transwell培养）体系,以IFN-α刺激共培养体系,以PBS作为阴性对照,观察并评价IFN-α在共培养体系中诱导T细胞分化并致KC凋亡的影响。（4）在C3H小鼠皮下注射IFN-α（10000U/mL）,每2天一次,持续2周后,处死小鼠获得组织样本,以HE染色和CD3免疫组织化学染色,在体内初步评价IFN-α诱发T淋巴细胞在上皮下非特异性浸润的能力。结果:（1）IFN-α提高HOK细胞中HLA-I+细胞的比例（刺激前:18.15%±0.64%,刺激后:53.58%±0.99%）和平均荧光强度（刺激前:1410.00±16.52,刺激后:1663.00±8.75）,提高HaCaT细胞中HLA-I+细胞的比例（刺激前:38.67%±6.85%,刺激后:72.62%±2.81%）,但荧光强度未明显增高;IFN-α提高HOK细胞中CD40+细胞的比例（刺激前:1.15%±0.13%,刺激后:7.07%±0.31%）和荧光强度（刺激前:1255±112,刺激后:1331±13）,提高HaCaT细胞中CD40+细胞的比例（刺激前:13.51%±1.65%,刺激后:33.77±1.47）,但荧光强度未明显增高;IFN-α不能提高HOK和HaCaT细胞表达MHC-II类分子和CD80、CD86分子。与PBS组相比（24h:5.63±0.50 pg/mL;48h:109.60±6.48 pg/mL）,IFN-α可以明显提高HOK细胞分泌CXCL10（24h:6.30±0.25 pg/mL;48h:217.60±7.14pg/mL）;与PBS组相比（5.99%±0.74%）,IFN-α处理HOK细胞后48h,细胞凋亡比例（10.49%±0.77%）明显增高。IFN-α可在刺激6h及之后引起HOK细胞内STAT1/Caspase3表达,但未引起其明显激活;（2）IFN-α诱导人外周血分离的总T淋巴细胞中CD4+T淋巴细胞比例明显增高（诱导前:75.93%±0.39%;诱导后:78.48%±0.33%）,并诱导总T淋巴细胞分泌IFN-γ（PBS组:11.05±3.504 pg/mL,刺激组:341.90±84.37 pg/mL）而抑制其分泌TNF-α（PBS组:26.76±1.41 pg/mL,刺激组:3.16±0.95 pg/mL）;（3）在48h时,IFN-α可诱导总T淋巴细胞和HOK细胞共培养体系中促凋亡细胞因子（IFN-γ（PBS组:2.09±0.22pg/mL;共培养体系:10.85±1.67 pg/mL）、TNF-α（PBS组:0.03±0.007 pg/mL;共培养体系:0.99±0.08pg/mL）、FasL（PBS组:0.39±0.16 pg/mL;共培养体系:8.10±0.17 pg/mL））显着增加,并导致共培养体系中的HOK细胞大量凋亡（PBS组:2.20%±0.12%;共培养体系:17.98%±1.50%）;（4）C3H小鼠皮下持续注射IFN-α共计14天后,HE染色见到皮下大量淋巴细胞浸润;CD3免疫组织化学染色观察到T淋巴细胞也存在显着增高。结论:（1）IFN-α能够提高KC表面MHC-I类分子和CD40分子的表达,且IFN-α可以独立诱导KC凋亡;（2）IFN-α可能诱导OLP损害中T淋巴细胞向Th1型细胞分化,形成Th1型免疫格局;（3）IFN-α可以促进共培养体系中的T淋巴细胞分泌IFN-γ、TNF-α和FasL,可通过T淋巴细胞诱导KC大量凋亡;（4）C3H小鼠皮下注射IFN-α可导致皮下T淋巴细胞非特异性浸润。
赵曼君[10]（2019）在《miR-150调控自身免疫性溶血性贫血/Evans综合征患者B细胞的研究》文中进行了进一步梳理自身免疫性溶血性贫血（Autoimmune Hemolytic Anemia,AIHA）是一类B淋巴细胞功能亢进,产生并分泌针对红细胞的自身抗体,导致红细胞的寿命缩短、破坏增多的自身免疫性疾病[1]。若患者体内同时存在血小板的自身抗体,引发免疫性血小板减少症（Immune thrombocytopenia,ITP）,则被称为Evans综合征（Evans syndrome）。B淋巴细胞的功能异常在AIHA的发生过程中起到至关重要的作用,然而其免疫异常及具体致病机制尚不明确。微小RNA（micro RNA,miRNA）是一类长度约为1822nt非编码小RNA,其可以通过与信使RNA（messenger RNA,mRNA）3’末端的非翻译区（UTR）结合,抑制其翻译过程,在转录后水平调控基因的表达[2]。机体中约1/3的mRNA翻译过程受到miRNA的调控[3]。越来越多的证据表明,miRNA对于免疫细胞的分化发育及机体免疫系统的调节起到关键的作用[4]。既往研究表明,AIHA/Evans综合征患者体内CD5+B淋巴细胞数目增多,细胞表面活化分子CD80和CD86的表达水平上调,且胞浆内分泌的细胞因子白介素（Interleukin,IL）10的水平较正常对照明显升高[5]。AIHA/Evans综合征患者体内CD19+B淋巴细胞中,miR-150的表达水平下降,c-Myb基因的表达水平升高,且二者均与患者疾病严重程度（溶血指标,免疫指标）具有明显相关性,推测c-Myb可能为miR-150的作用靶点[6]。本篇论文在前期研究的基础上,通过质粒构建表达载体及细胞转染的方法,对AIHA/Evans综合征患者及健康对照外周血CD19+B淋巴细胞miR-150的表达水平进行调节,采用流式细胞术检测AIHA/Evans综合征患者及健康对照外周血CD19+B淋巴细胞在转染前后,CD5+B细胞的数目,细胞表面活化分子CD80和CD86的表达水平及胞浆内分泌的细胞因子IL-10的水平;探索miR-150对B淋巴细胞活性和分泌功能的调控机制。同时通过qRT-PCR的方法对转染后miR-150和c-Myb基因的表达水平进行检测,分析两者表达趋势变化,进一步验证c-Myb基因是miR-150的作用靶点。最后通过免疫磁珠法分选AIHA/Evans综合征患者、健康对照组和CLL对照外周血CD19+B淋巴细胞,TRIzol法提取RNA,并通过Small RNA文库构建和BGISEQ-500高通量测序技术对B淋巴细胞miRNA表达谱进行分析,筛选出与健康对照组和CLL对照组比对差异表达的miRNA,为疾病发病机制的后续研究提供思路。故本研究分为三个方面进行:第一部分miR-150对AIHA/Evans综合征患者体内B淋巴细胞活性和分泌功能的调控目的:探究miR-150对AIHA/Evans综合征患者体内B淋巴细胞活性和分泌功能的调控机制方法:选取溶血发作组患者8例,缓解组7例,健康对照组5例。提取外周血单个核细胞,免疫磁珠法分选、纯化各组外周血CD19+B淋巴细胞。采用流式细胞术检测患者及健康对照外周血CD19+B淋巴细胞转染前CD5+B细胞的数目,细胞表面活化分子CD80和CD86的表达水平及胞浆内分泌的细胞因子IL-10的水平。构建miR-150干扰质粒及空白对照质粒,通过lipofectamine 3000脂质体方法进行转染,37℃5%CO2条件下培养72小时后收集细胞。流式细胞术检测患者及健康对照外周血CD19+B淋巴细胞转染后CD5+B细胞的数目,细胞表面活化分子CD80和CD86的表达水平及胞浆内细胞因子IL-10的分泌水平。结果:1 AIHA/Evans综合征患者溶血发作组外周血CD5+CD19+B细胞占CD19+B细胞的比例（17.53±10.73%）较缓解组（6.15±2.30%,P<0.05）和健康对照组（7.03±2.14%,P>0.05）明显升高;后两组外周血CD5+CD19+B细胞占CD19+B细胞的比例无统计学差异。2 AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5+CD19+B细胞表面CD80的表达水平（29.11±10.97%）高于缓解组（11.34±5.89%,P<0.01）和健康对照组（9.45±9.08%,P<0.05）;后两组CD5+B淋巴细胞表面CD80的表达水平无明显统计学差异。AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5+CD19+B细胞表面CD86表达水平（32.23±10.64%）高于缓解组（12.3±5.94%,P<0.01）和健康对照组（13.32±7.51%,P<0.01）;缓解组与健康对照组间无明显统计学差异。AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD5-CD19+B细胞表面CD80的表达水平（17.92±8.95%,21.02±10.73%,19.54±6.50%）无统计学差异。AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD5-CD19+B细胞表面CD86的表达水平（21.34±4.24%,15.18±7.40%,22.12±7.86%）无统计学差异。3 AIHA/Evans综合征患者溶血发作组外周血CD5+CD19+B淋巴细胞内IL-10的表达水平（21.56±3.42%）高于缓解组（8.19±3.66%,P<0.01）和健康对照组（7.54±3.67%,P<0.01）;缓解组及健康对照组间无明显统计学差异。AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD5-CD19+B细胞表面IL-10的表达水平（3.19±1.06%,2.64±1.10%,3.62±0.79%）低于CD5+CD19+B细胞,且三组之间无统计学差异。4转入hsa-miR-150-5p inhibition干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5+CD19+B细胞占CD19+B细胞的比例（22.21±5.70%）较转染前（17.53±10.73%）升高,但两者间无统计学差异;缓解组外周血CD5+CD19+B细胞占CD19+B细胞的比例（11.66±1.62%）较转染前（6.15±2.30%,P<0.01）升高。健康对照组外周血CD5+CD19+B细胞占CD19+B细胞的比例（13.56±1.27%）较转染前（7.03±2.14%,P<0.01）升高。转染干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5+CD19+B细胞占CD19+B细胞的比例（22.21±5.70%）高于缓解组（11.66±1.62%,P<0.01）和健康对照（13.56±1.27%,P<0.05）,后两组间无明显统计学差异。5转染hsa-miR-150-5p inhibition干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组患者和健康对照外周血CD5+CD19+B细胞表面CD80的表达水平较转染前无统计学差异。转染后AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5+CD19+B细胞表面CD80的表达水平（34.21±8.69%）高于缓解组（10.64±3.05%,P<0.01）和健康对照组（11.73±2.45%,P<0.01）,后两组无明显统计学差异。转染hsa-miR-150-5p inhibition干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组患者、缓解组和健康对照组外周血CD5+CD19+B细胞表面CD86的表达水平较转染前无统计学差异。转染干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组患者外周血CD5+CD19+B细胞表面CD86的表达水平（27.17±8.72%）高于缓解组（13.11±4.19%,P<0.01）,与健康对照组间无统计差异（16.59±4.43%,P>0.05）转染hsa-miR-150-5p inhibition干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD5-CD19+B细胞表面CD80、86的表达水平与转染前比较无统计学差异;且三组之间无统计学差异。6转染hsa-miR-150-5p inhibition干扰质粒后,AIHA/Evans综合征患者溶血发作组、缓解组及健康对照外周血CD5+CD19+B淋巴细胞内IL-10的表达水平（27.29±5.13%,21.01±4.50%,19.05±3.54%）较转染前升高（21.56±3.42%,8.19±3.66%,7.54±3.67%）,且三组具有统计学差异（P<0.05）。转染干扰质粒后,AIHA/Evans综合征患者溶血发作组CD5+CD19+B淋巴细胞内IL-10的表达水平高于缓解组（21.01±4.50%,P<0.05）和健康对照组（19.05±3.54%,P<0.05）,后两组无统计学差异。转染干扰质粒后,AIHA/Evans综合征溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD5-CD19+B细胞内IL-10的表达水平与转染前比较无统计学意义;且低于转染后CD5+CD19+B细胞内IL-10的表达水平。7转入空白质粒后,AIHA/Evans综合征患者及健康对照外周血CD5+CD19+B淋巴细胞比例,B淋巴细胞表面活化分子CD80和CD86表达水平及胞浆内IL-10的表达均与转染前无统计学差异。结论:AIHA/Evans综合征患者外周血CD19+B淋巴细胞中miR-150的表达水平下降,会导致CD5+细胞数目增加,胞浆内IL-10的分泌水平升高。第二部分AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞中c-Myb基因为miR-150作用靶点目的:验证AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞中c-Myb基因为miR-150作用靶点方法:选取溶血发作组患者10例,缓解组13例,健康对照9例。分离外周血单个核细胞、免疫磁珠法分选及纯化各组患者外周血CD19+B淋巴细胞。构建hsa-miR-150高表达质粒及干扰质粒,通过lipofectamine 3000脂质体方法进行转染,37℃5%CO2条件下培养72小时后收集细胞,TRIzol法提取核酸,并通过qRT-PCR对各组转染后miR-150及c-Myb的基因表达水平进行检测。分析两者表达趋势变化情况。结果:1转入hsa-miR-150高表达质粒后,溶血发作组外周血CD19+B淋巴细胞miR-150的表达水平（0.64±0.21）较转染前（0.36±0.49）水平升高;缓解组外周血CD19+B淋巴细胞miR-150的表达水平（1.63±0.70）较转染前升高（0.76±0.73）,但均无明显统计学差异（P>0.05）;健康对照组外周血CD19+B淋巴细胞miR-150的表达水平（2.67±1.55）较转染前升高（1.24±0.73,P<0.05）。转入高表达质粒后,溶血发作组miR-150表达水平（0.64±0.21）低于缓解组（1.63±0.70,P<0.05）和健康对照组（2.67±1.55,P<0.01）,缓解组和健康对照组转染后miR-150表达水平无明显统计学差异。2转入hsa-miR-150干扰质粒后,溶血发作组外周血CD19+B淋巴细胞miR-150的表达水平（0.10±0.04）较转染前（0.36±0.49,P<0.05）水平下降;缓解组外周血CD19+B淋巴细胞miR-150的表达水平（0.40±0.24）较转染前下降（0.76±0.73）,但无明显统计学差异（P>0.05）;健康对照组外周血CD19+B淋巴细胞miR-150的表达水平（0.50±0.16）较转染前下降（1.24±0.73,P<0.05）。转入干扰质粒后,溶血发作组miR-150表达水平（0.10±0.04）低于缓解组（0.40±0.24,P>0.05）及健康对照组（0.50±0.16,P<0.05）,缓解组和健康对照组转染后miR-150表达水平无明显统计学差异。3转入hsa-miR-150高表达质粒后,溶血发作组外周血CD19+B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（1.69±0.47）较转染前明显下降（17.65±14.91,P<0.01）;缓解组外周血CD19+B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（0.54±0.83）较转染前明显下降（9.23±8.22,P<0.01）;健康对照组外周血CD19+B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（0.49±0.44）低于转染前（3.93±6.37,P<0.05）。转入高表达质粒后,溶血发作组,缓解组和健康对照组间c-Myb基因的表达水平无统计学差异。4转入hsa-miR-150干扰质粒后,溶血发作组外周血CD19+B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（12.30±2.49）低于转染前（17.65±14.91）,两者间无明显统计学差异;缓解组外周血CD19+B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（10.52±2.81）较转染前（9.23±8.22）升高,两者间无明显统计学差异;健康对照组外周血CD19+B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（7.52±1.16）较转染前（3.93±6.37,P<0.05）升高。转入干扰质粒后,溶血发作组外周血CD19+B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平（12.3±2.49）高于健康对照组（7.52±1.16,P<0.05）,溶血发作组与缓解组,缓解组与健康对照组间c-Myb基因表达水平无明显统计学差异。5在转染hsa-miR-150高表达质粒及干扰质粒后,溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD19+B淋巴细胞c-Myb基因mRNA的表达水平与miR-150的表达水平呈负相关（r=-0.8788,P<0.01;r=-0.6206,P=0.0136;r=-0.6606,P=0.0194）。结论:在B淋巴细胞中c-Myb基因为miR-150作用靶点,AIHA/Evans综合征患者体内B淋巴细胞miR-150表达水平下调导致c-Myb基因表达水平升高,可能参与疾病的发生发展。第三部分AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞miRNA表达谱的分析目的:对AIHA/Evans综合征患者外周血CD19+B淋巴细胞miRNA表达谱进行分析。方法:选取AIHA/Evans综合征患者4例,同期健康对照组4例,CLL对照4例。分离外周血单个核细胞,免疫磁珠法分选及纯化各组外周血CD19+B淋巴细胞。TRIzol法提取RNA,并通过Small RNA文库构建和BGISEQ-500高通量测序技术对B淋巴细胞miRNA表达谱进行分析,分别筛选出与健康对照组和CLL对照组比对差异表达的miRNA。结果:与健康对照组比较,AIHA/Evans组RNA样本中,有178个miRNA表达上调,143个miRNA表达下调,差异表达基因FDR≤0.001具有统计学差异。与CLL组比较,AIHA/Evans组RNA样本中,有148个miRNA表达上调,186个miRNA表达下调,差异表达基因FDR≤0.001具有统计学差异。结论:AIHA/Evans综合征患者外周血CD19+B淋巴细胞miRNA表达谱与健康对照组和CLL组比较有较大差异,miRNA表达谱及差异表达分析结果为疾病发病机制的后续研究探讨提供思路。
二、系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞CD80和CD86的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞CD80和CD86的表达（论文提纲范文）
（1）DC源lncRNA在急性冠脉综合征中的差异性表达及其调控机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 不同类型ACS病人moDC的形态及其功能具有差异 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 不同类型ACS病人moDC源 DElncRNA的筛选及生信分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 DElncRNA CCL15-CCL14在moDC中的作用及机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 lncRNA 在树突状细胞中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 调节性B细胞概述 |
| 1.2 调节性B细胞与肿瘤 |
| 1.3 肿瘤微环境中调节性B细胞的来源 |
| 1.4 乳酸对肿瘤微环境免疫反应的影响 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 调节性B细胞生物学特性 |
| 2.1.1 调节性B细胞分类及分子标志 |
| 2.1.2 调节性B细胞抑制功能机制 |
| 2.1.3 调节性B细胞的起源及分化 |
| 2.2 调节性B细胞在自身免疫性疾病、感染和肿瘤中的作用 |
| 2.2.1 Breg细胞在自身免疫性疾病中的作用 |
| 2.2.2 Breg细胞在感染性疾病中的作用 |
| 2.2.3 Breg细胞在肿瘤中的作用 |
| 2.3 ROS在B细胞中作为信号分子的作用 |
| 2.3.1 ROS在B细胞中的产生和降解 |
| 2.3.2 ROS调节B细胞的成熟、活化和增殖 |
| 2.3.3 ROS影响B细胞功能 |
| 2.4 乳酸促进肿瘤发生发展机制 |
| 2.4.1 乳酸的来源与代谢 |
| 2.4.2 乳酸在肿瘤发生发展中的作用 |
| 2.4.3 乳酸/GPR81 信号通路对肿瘤的影响 |
| 2.4.4 乳酸作为肿瘤治疗靶点 |
| 第3章 乳酸诱导小鼠B细胞分化为Breg样细胞的分子机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 磁珠分选B6 小鼠B220~+B细胞 |
| 3.3.2 磁珠分选CD8~+T细胞 |
| 3.3.3 磁珠分选CD4~+T细胞 |
| 3.3.4 磁珠分选B6 小鼠na(?)ve CD4~+T细胞 |
| 3.3.5 CFSE染色 |
| 3.3.6 乳酸培养小鼠B220 细胞抑制功能实验 |
| 3.3.7 CFSE法检测细胞增殖 |
| 3.3.8 慢病毒CRISPR/Cas9 技术构建LDHA基因敲除D121 细胞混合克隆稳定株 |
| 3.3.9 小鼠肺腺癌模型的构建 |
| 3.3.10 小鼠肿瘤组织消化 |
| 3.3.11 肿瘤组织B淋巴细胞分选 |
| 3.3.12 组织染色 |
| 3.3.13 流式分析 |
| 3.3.14 qRT-PCR检测 |
| 3.3.15 Western blot |
| 3.3.16 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 乳酸诱导B细胞具有CD25~+CD81~+Breg样细胞的表型 |
| 3.4.2 乳酸诱导的Breg样细胞具有免疫抑制功能 |
| 3.4.3 乳酸诱导的Breg样细胞不能诱导Treg细胞分化及CD4~+T细胞凋亡 |
| 3.4.4 乳酸诱导的Breg样细胞抑制T细胞增殖机制研究 |
| 3.4.5 乳酸激活B细胞表面GPR81 受体诱导ROS表达 |
| 3.4.6 乳酸激活B细胞内PPARα诱导ROS表达 |
| 3.4.7 乳酸通过结合GPR81 受体激活PPARα诱导ROS产生 |
| 3.4.8 降低肿瘤内乳酸浓度对B细胞及其他免疫细胞比例及功能的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和仪器 |
| 4.2.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 |
| 4.3.2 磁珠分选人外周血CD3~+T/CD19~+B细胞 |
| 4.3.3 乳酸培养人CD19~+B细胞抑制功能试验 |
| 4.3.4 流式检测 |
| 4.3.5 qRT-PCR检测 |
| 4.3.6 人肺腺癌组织及癌旁组织免疫荧光染色 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 肺腺癌患者外周血乳酸含量及Breg细胞比率 |
| 4.4.2 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.4.3 人肺腺癌组织及癌旁组织内乳酸对 B 细胞 ROS 表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）一、糖代谢对原发性干燥综合征B细胞功能影响的研究 二、原发性干燥综合征外周血单核细胞DNA甲基化分析（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 糖代谢对原发性干燥综合征B细胞功能影响的研究 |
| 一. 研究背景 |
| 二. 实验材料与方法 |
| 三. 实验结果 |
| 3.1 磁珠分选B细胞纯度检测及B细胞的活化 |
| 3.2 pSS外周血CD19+B细胞存在代谢异常 |
| 3.3 抑制代谢糖酵解通路对B细胞活化的影响 |
| 3.4 抑制氧化磷酸化通路对B细胞活化的影响 |
| 3.5 抑制糖酵解对B细胞增殖的影响 |
| 3.6 抑制氧化磷酸化途径对B细胞的增殖的影响 |
| 3.7 抑制代谢通路对B细胞分化的影响 |
| 3.8 抑制代谢通路对B细胞分泌免疫球蛋白功能的影响 |
| 3.9 B细胞mRNA高通量测序结果及代谢相关通路富集 |
| 四.讨论 |
| 五.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 原发性干燥综合征外周血单核细胞DNA甲基化分析 |
| 一. 研究背景 |
| 二. 实验材料与方法 |
| 三. 结果 |
| 3.1 一般资料 |
| 3.2 DNA提取后的质量检测 |
| 3.3 pSS患者和健康对照外周血单核细胞差异甲基化位点 |
| 3.4 pSS患者和健康对照者外周血单核细胞差异甲基化区域 |
| 3.5 差异甲基化位点和差异甲基化区域注释基因的GO分析 |
| 3.6 差异甲基化位点和差异甲基化区域注释基因的KEGG分析 |
| 3.7 单核细胞与T淋巴细胞、B淋巴细胞及唾液腺甲基化差异的比较 |
| 3.8 单核细胞DNA甲基化与pSS患者临床特征分析 |
| 四. 讨论 |
| 五. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 原发性干燥综合征发病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）类风湿关节炎患者外周B细胞功能紊乱的糖代谢机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 类风湿关节炎患者外周B细胞功能紊乱的能量代谢机制研究 |
| 1.类风湿关节炎患者外周B细胞mTOR-糖酵解信号通路增强促进其功能紊乱的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 1.RA患者外周B细胞功能紊乱 |
| 2.RA患者外周B细胞糖酵解增强 |
| 3.抑制糖酵解改善RA患者外周B细胞功能紊乱 |
| 4.RA患者外周B细胞mTOR信号通路异常活化 |
| 5.RA患者外周B细胞mTOR通路异常激活增强糖酵解促进其免疫功能紊乱 |
| 6.RA患者外周B细胞脂肪酸氧化对其免疫功能紊乱无影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 2.IL-27是RA炎症微环境促进B细胞糖酵解和功能紊乱的关键因子 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 1.RA患者血清促进B细胞功能紊乱 |
| 2.RA患者血清增强B细胞糖酵解 |
| 3.RA患者血清诱导B细胞mTOR信号通路激活 |
| 4.RA患者血清中IL-27水平升高 |
| 5.RA患者血清中IL-27水平与疾病活动度和自身抗体水平呈正相关 |
| 6.RA患者血清中IL-27水平与浆细胞百分比和免疫球蛋白水平呈正相关 |
| 7.阻断IL-27 抑制RA患者血清对B细胞功能紊乱的促进作用 |
| 8.阻断IL-27抑制RA血清引起的B细胞糖酵解增强 |
| 9.阻断IL-27抑制RA患者血清引起的B细胞mTOR信号通路激活 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 3.IL-27通过激活mTOR-糖酵解信号通路促进RA患者外周B细胞功能紊乱的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 1.RA患者外周B细胞表面IL-27受体表达升高 |
| 2.IL-27促进RA患者B细胞功能紊乱 |
| 3.IL-27通过促进糖酵解介导RA患者B细胞功能紊乱 |
| 4.IL-27通过激活mTOR信号通路促进RA患者B细胞功能紊乱 |
| 5.IL-27通过激活mTOR信号通路诱导RA患者B细胞糖酵解增强 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CD4~+PD-1~+Foxp3~-T细胞辅助RA患者外周B细胞产生抗体的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 1.RA患者外周CD4~+PD-1~+T细胞增多并与自身抗体水平呈正相关 |
| 2.RA患者外周CD4~+PD-1~+Foxp3~-T细胞增多并与自身抗体水平、浆细胞百分比和免疫球蛋白水平呈正相关 |
| 3.RA患者外周CD4~+PD-1~+Foxp3~-T细胞增殖和活化异常 |
| 4.RA患者外周CD4~+PD-1~+Foxp3~-T细胞高表达与B细胞产生抗体相关细胞因子 |
| 5.RA患者外周CD4~+PD-1~+Foxp3~-T细胞辅助B细胞产生抗体 |
| 6.生物制剂治疗抑制RA患者外周CD4~+PD-1~+Foxp3~-T细胞产生 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 B细胞代谢的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间已发表和撰写的学术论文 |
| 致谢 |
（5）调节性B细胞在原发性胆汁性胆管炎免疫机制中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 主要仪器和试剂 |
| 3 试验方法 |
| 4 统计学分析 |
| 5 技术路线图 |
| 结果 |
| 1 PBC患者基本情况 |
| 2 PBC与健康对照外周血Breg比例分析 |
| 3 Breg细胞表面CD80、CD86、BAFF-R、IL21R、CD40表达情况 |
| 4 IL10在PBC患者与正常人及不同调节性B细胞亚群的表达情况 |
| 5 临床相关分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文综述 |
| 参考文献 |
| 附录: 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（6）造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 异体造血干细胞输注形成微嵌合并刺激受者外周血T细胞的活化 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 第二章 工程化DCs促进受者局部淋巴结T细胞活化 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 第三章 外周血造血干细胞联合工程化DC抑制肿瘤生长 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述:米托蒽醌和柔红霉素在AML诱导化疗中的系统性综述和meta分析 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（7）系统性红斑狼疮患者外周血CD19+B细胞PD-1/PD-Ls分子表达特点及临床意义的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录A 英文缩略词表 |
| 附录B 常用试剂配制 |
| 附录C 病人资料 |
| 附录D 个人简历 |
| 附录E 综述 |
| 参考文献 |
（8）SP-A通过树突细胞调控Tfh细胞分化参与缓解哮喘气道炎症反应（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 肺泡表面活性蛋白A调控Tfh分化缓解哮喘气道炎症 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 3.1 小鼠基因型鉴定 |
| 3.2 OVA介导的Sp-a~(-/-)小鼠气道炎症反应 |
| 3.3 不同小鼠 BALF中炎症细胞计数 |
| 3.4 各组小鼠BALF中相关细胞因子的水平 |
| 3.5 不同处理的小鼠 BALF 中 IgA 和 IgE 抗体的水平 |
| 3.6 各组小鼠脾脏和纵隔淋巴结中 Tfh 细胞及其亚群改变 |
| 3.7 Tfh亚群组成与 BALF中 IgE 抗体的关系 |
| 3.8 异常Tfh 细胞对 B 细胞抗体分泌的辅助作用 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:重组小鼠SP-A在体外通过树突细胞参与Tfh细胞分化的调控 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 3.1 pcDNA3.1~(TM)/His A-SP-A 重组体的构建 |
| 3.2 PAGE凝胶电泳鉴定SP-A |
| 3.3 SP-A对 Tfh 细胞分化的作用 |
| 3.4 SP-A调控BMDC表面CD80/86 的表达水平 |
| 3.5 SPA 对 DC 细胞因子表达水平的影响 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 第三部分:哮喘患者外周血 Tfh 细胞及其亚群的改变 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 3.1 哮喘患者基本信息 |
| 3.2 哮喘患者和健康对照者CD4~+CD45RA~-CXCR5~+细胞比例 |
| 3.3 哮喘患者和健康对照者Tfh细胞亚群分布 |
| 3.4 哮喘患者和健康对照者血清Ig E抗体水平的变化 |
| 3.5 血清Ig E升高组和正常组Tfh细胞及其亚群的变化 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 学术成果 |
（9）干扰素α诱导T细胞分化致角质形成细胞凋亡的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语及符号说明 |
| 前言 |
| 实验室常规试剂与仪器说明 |
| 第一部分 IFN-α诱导KC表达抗原提呈分子、共刺激分子和趋化因子并诱导其凋亡的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 IFN-α诱导T淋巴细胞向Th1 方向分化并分泌促凋亡相关细胞因子的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 IFN-α联合T淋巴细胞诱导KC凋亡的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 小鼠皮下注射IFN-α导致非特异性T淋巴细胞浸润的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 全文讨论 |
| 全文参考文献 |
| 硕士期间研究成果 |
| 致谢 |
（10）miR-150调控自身免疫性溶血性贫血/Evans综合征患者B细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、miR-150对AIHA/Evans综合征患者体内B淋巴细胞活性和分泌功能的调控 |
| 1.1 研究对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.1.3 方法 |
| 1.1.4 统计学处理 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 转染前AIHA/Evans综合征患者及健康对照外周血CD5+B淋巴细胞比例及细胞表面活化分子表达情况 |
| 1.2.2 转染前AIHA/Evans综合征患者及健康对照外周血CD5+B淋巴细胞胞浆内IL-10 水平 |
| 1.2.3 转染has-miR-150-5p-inhibition干扰质粒后AIHA/Evans综合征患者及健康对照外周血CD5+B淋巴细胞比例及细胞表面活化分子表达情况 |
| 1.2.4 转染has-miR-150-5p-inhibition质粒后AIHA/Evans综合征患者及健康对照外周血CD5+B淋巴细胞胞浆内IL-10 水平 |
| 1.2.5 转染空白质粒后,AIHA/Evans综合征患者及健康对照外周血CD5+B淋巴细胞比例,活化分子表达情况及胞浆内IL-10 的分泌水平 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞中c-Myb基因为miR-150 的作用靶点 |
| 2.1 研究对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.1.4 统计学处理 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 流式细胞术检测各组CD19+B淋巴细胞纯度 |
| 2.2.2 hsa-miR-150 高表达质粒及干扰质粒转染后AIHA/Evans综合征患者溶血发作组、缓解组及健康对照组CD19+B淋巴细胞miR-150 的表达水平 |
| 2.2.3 hsa-miR-150 高表达质粒及干扰质粒转染后AIHA/Evans综合征患者溶血发作组、缓解组及健康对照组CD19+B淋巴细胞c-Myb基因的表达水平 |
| 2.2.4 AIHA/Evans综合征患者溶血发作组、缓解组及健康对照组外周血CD19+B淋巴细胞c-Myb基因mRNA表达水平与miR-150 表达水平的相关性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、AIHA/Evans综合征患者B淋巴细胞微小RNA表达谱的分析 |
| 3.1 研究对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.1.4 统计学处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 总RNA的质量分析 |
| 3.2.2 Small RNA文库的定量分析及分类注释 |
| 3.2.3 小RNA表达定量及差异miRNA筛选 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 调节性B细胞特性及治疗应用进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞CD80和CD86的表达（论文参考文献）
- [1]DC源lncRNA在急性冠脉综合征中的差异性表达及其调控机制[D]. 柯昌浩. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制[D]. 林杉. 吉林大学, 2021(01)
- [3]一、糖代谢对原发性干燥综合征B细胞功能影响的研究 二、原发性干燥综合征外周血单核细胞DNA甲基化分析[D]. 罗璇. 北京协和医学院, 2021(02)
- [4]类风湿关节炎患者外周B细胞功能紊乱的糖代谢机制研究[D]. 汤亚微. 大连医科大学, 2021(01)
- [5]调节性B细胞在原发性胆汁性胆管炎免疫机制中的作用[D]. 张禹. 北京协和医学院, 2020(05)
- [6]造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究[D]. 邓磊. 军事科学院, 2020(01)
- [7]系统性红斑狼疮患者外周血CD19+B细胞PD-1/PD-Ls分子表达特点及临床意义的研究[D]. 朱青青. 蚌埠医学院, 2020(01)
- [8]SP-A通过树突细胞调控Tfh细胞分化参与缓解哮喘气道炎症反应[D]. 徐淑琴. 上海交通大学, 2020(01)
- [9]干扰素α诱导T细胞分化致角质形成细胞凋亡的实验研究[D]. 宋晨成. 上海交通大学, 2019(06)
- [10]miR-150调控自身免疫性溶血性贫血/Evans综合征患者B细胞的研究[D]. 赵曼君. 天津医科大学, 2019(02)