一、K_La对高山被孢霉产花生四烯酸的影响（论文文献综述）
凌凤珠[1]（2021）在《柠檬酸转运蛋白和柠檬酸裂解酶对高山被孢霉脂质积累的影响》文中研究指明高山被孢霉（Mortierella alpina）是一株具有较高产脂能力的产油丝状真菌,其总脂中含有丰富的多不饱和脂肪酸,提高其脂质积累效率将有利于增加其工业化应用价值。在氮限制条件下,柠檬酸累积是产油微生物脂质积累启动的重要标志;柠檬酸在线粒体积累后,由线粒体柠檬酸转运蛋白转运至胞质,并在ATP柠檬酸裂解酶（ACL）的作用下裂解成乙酰辅酶A,为脂肪酸合成提供底物。为了使线粒体柠檬酸更高效转化成乙酰辅酶A以促进脂质合成,本文通过过表达柠檬酸转运和裂解过程的关键蛋白（线粒体柠檬酸转运蛋白和ACL）,研究不同蛋白对高山被孢霉生长和产脂的影响程度,并结合基因转录水平、酶活、代谢物水平探究线粒体柠檬酸转运蛋白影响高山被孢霉脂质积累的部分机制。本课题为解析线粒体柠檬酸到乙酰辅酶A的转化过程对脂肪酸合成的影响机制以及为高山被孢霉产脂能力的提高提供理论依据和指导。主要研究结果如下:（1）本文共筛选出4个柠檬酸转运蛋白,包括2个柠檬酸-苹果酸转运蛋白（MaCT1/MaCT2）、1个三羧酸转运蛋白（MaTCT）、1个柠檬酸-酮戊二酸转运蛋白（MaYHM）。MaCT1/MaCT2与其它来源的柠檬酸-苹果酸转运蛋白的同源性在45%～63%之间,MaYHM与其它来源的柠檬酸-酮戊二酸转运蛋白的同源性为57%-62%之间;MaCT1/MaCT2/MaYHM均具备线粒体内膜载体结构特征以及柠檬酸结合位点。MaTCT为一个线粒体载体蛋白,其拥有3层跨膜结构,并与其它来源的三羧酸转运蛋白（TCT）的同源性为60%,但与MaCT1/MaCT2/MaYHM无同源性。（2）在3个编码以柠檬酸/苹果酸为主要底物的柠檬酸转运蛋白的基因（MaCT1/MaCT2/MaTCT）中,MaCT2过表达可显着提高高山被孢霉脂质积累水平,其脂肪酸产量与对照组相比可提高51.6%;MaTCT过表达对其脂质积累水平的提高程度最低,脂肪酸产量最高仅提高23.3%。此外,MaCT1/MaCT2/MaTCT的过表达均未影响高山被孢霉的生长。MaCT2相对转录水平与脂质合成速度对应,96 h的相对转录水平高于168 h。和96 h时相比,168 h的相对转录水平与该时间点的脂肪酸产量相关性更大。（3）柠檬酸-酮戊二酸转运蛋白基因（MaYHM）的过表达显着提高了高山被孢霉的脂质积累水平,脂肪酸产量可提高42.9%。通过分析其168 h的代谢物水平发现,在氮碳源重塑中,MaYHM的过表达促进碳源从4-氨基丁酸（GABA）途径/谷氨酸脱氢酶途径流向TCA循环,并且胞内的α-酮戊二酸含量显着提高,NAD+-IDH酶活与对照组相比降低34.7%。说明过表达MaYHM使更多的碳源经TCA途径被回收,并以柠檬酸的形式流向脂质积累合成途径,从而提高脂质积累水平。（4）从高山被孢霉基因组数据库中筛选出2个编码ATP柠檬酸裂解酶的基因（MaACL1和MaACL2）,过表达MaACL1和MaACL2均促进高山被孢霉的生长和脂质积累,其脂肪酸产量与对照组相比分别可提高59.3%和63.4%,去脂生物量分别可提高9.8%和14.5%,且MaACL1/MaACL2对高山被孢霉脂质积累水平的影响程度大于生长。
武迎春[2]（2021）在《高山被孢霉脂肪酸合成主要NADPH供给基因比较研究》文中进行了进一步梳理脂肪酸在多个领域发挥着非常重要的作用,尤其对于人体健康而言更是不可或缺。目前其主要来源有植物提取、深海鱼油和微生物提取等。植物提取由于生长周期长、造价昂贵且只能生成短链脂肪酸而逐渐被淘汰。深海鱼类更是面临着环境保护、海洋污染等一系列问题。由于高山被孢霉安全性较高、脂肪酸产量较为丰富、多产长链脂肪酸等一系列特征,逐渐成为微生物产油的目的菌株。截止到现在,国内外对高山被孢霉的研究主要集中在菌种的筛选和发酵条件的优化上,对脂肪酸合成过程中关键酶基因调控机制的研究较少。本研究通过构建编码谷氨酸脱氢酶基因GDH（Glutamate dehydrogenase）同源过表达菌株和编码谷氨酰胺合成酶基因GS（Glutamine synthetase）基因沉默菌株,对GDH在脂肪酸合成过程中的作用进行了初步探讨。同时对目前已知的NADPH（Reduced nicotinamide adenine dinucleotide）主要来源基因研究结果,结合GDH基因产还原力分析,对其进行了比较研究。主要结论如下:（1）成功构建了同源过表达菌株Mortierella alpina-GDH1、Mortierella alpina-GDH2。对其性质进行测定主要结果如下:与对照菌株相比,GDH1和GDH2的平均表达水平分别为对照菌株的9.74倍和13.67倍;GDH1过表达菌株中NADPH含量增加了28.5%、GDH2过表达菌株增加了44.6%;过表达GDH1、GDH2菌株中总脂肪酸平均含量较对照菌株分别增加了10.4%、21.5%;GDH1过表达菌株中油酸增加了28.7%,亚麻酸增加了16.7%。GDH2过表达菌株中油酸增加了29.4%,亚麻酸增加了17.0%。综合以上结果表明,过表达GDH促进了脂肪酸合成过程中所需还原力NADPH的产生,同时提高了其脂肪酸含量和不饱和度。（2）应用RNAi（RNA interference）的方法,成功构建了重组高山被孢霉Mortierella alpina-i GS。实验结果如下:与对照菌株相比,Mortierella alpina-i GS菌株中,GS基因的表达量降低了60%左右;Mortierella alpina-i GS中NADPH含量增加了35.7%;总脂肪酸含量增加了19.9%;在一定程度上提高了油酸、亚麻酸含量。综合以上实验结果表明,GS基因对高山被孢霉脂肪酸合成过程有一定的调控作用,这也与过表达GDH基因的结果相吻合。（3）本文综合多篇文献研究,对NADPH主要来源基因产NADPH及脂肪酸能力进行了比较,当NADPH主要来源基因表达量均上调50%时,不同基因过表达菌株的脂肪酸含量、NADPH含量有较大差异。其中GDH2对NADPH含量影响较大,仅次于G6PG2。从另一方面说明了GDH基因可能是被忽视的为脂肪酸合成产NADPH的另一关键限速酶之一,对脂肪酸含量具有非常重要的影响。
吴彪[3]（2020）在《谷氨酸代谢途径对产油真菌脂肪酸积累机制研究》文中研究表明高山被孢霉是一种高产多不饱和脂肪酸（PUFAs）的产油丝状真菌,并已应用于工业化生产花生四烯酸（ARA）。经过近二十年的研究积累,高山被孢霉的PUFAs合成代谢网络已经被逐渐解析,但对高山被孢霉脂肪酸积累的机制还需进一步研究。前人初步确定了高山被孢霉谷氨酸代谢途径中编码1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶的基因（p5cdh）与脂肪酸合成具有很大的相关性,为探究p5cdh基因对高山被孢霉脂肪酸积累机制的影响,本研究通过同源过量表达高山被孢霉中p5cdh基因的方法构建重组菌株,对p5cdh基因与脂肪酸合成的相关性进行了验证;然后基于响应面分析法对重组菌株的发酵培养基进行优化,以期获得重组菌株的最大花生四烯酸产量。本课题主要研究结果如下:1.通过同源过量表达高山被孢霉中编码1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶的基因（p5cdh）从而构建了MA-p5cdh-1、MA-p5cdh-2、MA-p5cdh-3三株重组菌株。与野生型菌株相比较,重组菌株的NADPH水平和脂肪酸含量均显着提高,表明了谷氨酸代谢通路中的p5cdh基因通过提供NADPH的方式以促进高山被孢霉中脂肪酸的合成。2.基于响应面分析法对重组菌株MA-p5cdh-1的发酵培养基进行优化。通过响应面优化试验确定了重组菌株MA-p5cdh-1生产ARA的发酵培养基最佳浓度组合:92.69 g/L葡萄糖,15.41 g/L酵母提取物,2.95 g/L KH2PO4和2.97 g/L Na NO3,并通过验证可知在此条件下ARA的平均产量为9.02 g/L。结果表明ARA的产量比优化前平均提高了27.04%,成功实现了对MA-p5cdh-1发酵培养基的优化。
唐鑫,顾舒婕,常璐璐,赵建新,张灏,陈海琴,陈卫[4]（2020）在《高山被孢霉生长和产脂的影响因素分析》文中研究表明为探究影响高山被孢霉生长和产脂的因素,分析不同初始葡萄糖质量浓度、活化次数、接种量、装液量、发酵时间、菌球打碎时间等条件下高山被孢霉生长和产脂特点。结果表明,初始葡萄糖质量浓度、装液量和发酵时间对菌株生长和产脂的影响最为显着,且初始葡萄糖质量浓度与花生四烯酸的产量呈负相关性。根据不同条件下菌株生长和产脂情况,得到高山被孢霉最佳培养条件为:菌株活化3次,用高速分散机8 000 r/min打碎20 s至均匀状态,按2%～3%（体积分数）接种量接入初始葡萄糖质量浓度为50 g/L、装液量为20%（体积分数）的发酵培养基中,200 r/min、28℃培养8. 5 d。
王顺贤[5]（2020）在《高山被孢霉中CRISPR系统的构建及NADPH供应途径挖掘》文中认为高山被孢霉（Mortierella alpina）是一株高产花生四烯酸的丝状真菌,已被广泛用于工业生产花生四烯酸。目前高山被孢霉的基因组、转录组、脂质组信息已明确,基于上述信息,为进一步解析其产脂积累过程并构建高产脂菌株,单基因与双基因改造手段已不能满足研究需求,而多基因操作系统在高山被孢霉中的构建和应用未有报道。规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）系统是一种功能强大且应用广泛的靶向基因敲除工具。通过诱导型启动子作用下的CRISPR系统对靶向基因如筛选标记进行反复诱导敲除,可以实现凭借单一筛选标记完成对宿主菌的多基因改造。还原力NADPH是产油微生物产脂过程所必需的成分,对脂质积累影响显着。本论文在高山被孢霉中构建了基于CRISPR系统的多基因表达策略,挖掘并筛选NADPH供应途径中的关键酶,并通过该系统实现了NADPH供应关键基因的导入以及筛选标记的二次回收,证明了该系统在高山被孢霉中的成功应用。本论文主要研究内容和实验结果如下:1.高山被孢霉转化效率的提升。为便于大片段、多目的基因高效导入高山被孢霉,本论文从根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的种类（AGL-1、C58C1、EHA105和LBA4404）及高山被孢霉的细胞形态两个方面探索其对高山被孢霉转化方法的影响;其中,在四种根癌农杆菌AGL-1、C58C1、EHA105和LBA4404中,根癌农杆菌AGL-1和EHA105对高山被孢霉的转化效率最高;应用根癌农杆菌AGL-1转化不同细胞形态（新鲜孢子、萌发孢子、液体菌体和固体单菌落）的高山被孢霉,发现萌发孢子作为被转化材料时转化效率最高。2.高山被孢霉中基于组成型启动子的CRISPR系统的构建。为对比CRISPR系统中常用核酸酶Cas9和Cpf1的基因编辑效率,本论文借用优化后的转化方法构建了组成型启动子His550下的CRISPR系统的高山被孢霉重组菌MA-His550-spCas9和MA-His550-LbCpf1,基于学术网站对靶向基因ura5设计sgRNA（针对spCas9）和CrRNA（针对LbCpf1）引导链,在对应的重组菌中进行尿嘧啶ura5基因的靶向敲除,结果显示在高山被孢霉中LbCpf1对靶向基因的敲除效率比spCas9高,被选定用于后续实验。3.高山被孢霉中基于诱导型启动子的CRISPR系统的构建。为操控核酸酶LbCpf1的适时表达以实现尿嘧啶筛选标记的反复回收,本论文首先验证了诱导型启动子cbh1在高山被孢霉中的功能,随后构建了cbh1引导下的靶向敲除筛选标记ura5的重组菌MA-Pchb1-LbCpf1,对其中一株生物量及产脂性状优良的重组菌进行诱导条件优化并获取13株尿嘧啶缺陷型重组菌MA-Pchb1-LbCpf1-ura5-;对上述13株重组菌进行脂肪酸发酵分析,筛选得到1株生物量高且总脂含量与野生型高山被孢霉无显着性差异的尿嘧啶缺陷型重组菌,本论文至此已成功完成高山被孢霉中基于CRISPR系统的多基因表达系统的构建。4.高山被孢霉中NADPH供应途径的挖掘与筛选。为挑选用于多基因表达系统的基因,本论文从还原力NADPH供应角度对多种途径进行挖掘和筛选,首先在高山被孢霉中通过同源过表达和RNA干扰手段探究了3种潜在的NADPH供应途径的作用,发现三磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH,EC 1.2.1.12）途径、NAD激酶（NAD kinase,NADK,EC 2.7.1.23）途径和NADH激酶（NADH kinase,NADHK,EC 2.7.1.86）途径在高山被孢霉的产脂过程中能起到NADPH供应作用;随后,综合考量高山被孢霉中已探究NADPH供应途径对产脂积累的贡献,从6种途径中筛选得到用于后续基因操作的苹果酸酶途径基因me1。5.诱导型启动子引导下的CRISPR系统在高山被孢霉中的初步应用。利用筛选得到的MA-Pchb1-LbCpf1-ura5-重组菌作为出发菌株,借助根癌农杆菌AGL-1,导入苹果酸酶me1基因,得到了3株重组菌MA-Pchb1-LbCpf1-me1;通过摇瓶发酵实验,挑选其中一株产脂性状优良的重组菌进行筛选标记ura5基因的诱导敲除,表型筛选和测序结果表明成功得到了3株尿嘧啶缺陷型重组菌MA-Pchb1-LbCpf1-me1-ura5-,实现了筛选标记的二次回收。本论文借助诱导型启动子引导下的CRISPR系统,在高山被孢霉中实现了基因导入和筛选标记的反复回收,证明了此系统在高山被孢霉中的成功应用。
黄明旺[6]（2019）在《高山被孢霉产EPA发酵工艺优化及其在蛋鸡饲料中的应用》文中进行了进一步梳理二十碳五烯酸（EPA）是一种ω-3多不饱和脂肪酸,具有抗炎、抗癌、抗凝血、降血脂、防心血管疾病等多种生理功能。然而,EPA主要来源于深海鱼油,由于鱼类资源的有限、海洋环境的污染与提取工艺的复杂性,寻找可持续发展的EPA替代来源成为研究热点。其中,微生物油脂受到广泛关注并研究。产油微生物高山被孢霉油脂含量高、多不饱和脂肪酸（PUFAs）种类丰富,是经过FDA安全认证的用于生产花生四烯酸的工业化菌株。课题组前期通过过表达ω-3脂肪酸脱饱和酶PPD17获得重组菌株高山被孢霉CCFM698,实现了常温下将ARA转化为EPA的突破。为了进一步提高菌株的生产能力,本文进行了一系列的发酵工艺优化,并提出了一种基于溶氧与两阶段pH调控高山被孢霉高产EPA的补料发酵工艺。最后,将高山被孢霉作为PUFAs饲料添加剂应用于蛋鸡饲料中,考察其对鸡蛋与蛋鸡组织PUFAs组分的影响。主要研究结果如下:1.在摇瓶发酵基础上,确定了分批发酵的最适碳氮源添加比例为50 g/L葡萄糖与20 g/L豆粕。在7.5 L发酵罐实验中,分别针对发酵罐转速、富氧介质以及富氧空气等影响发酵体系溶氧的因素进行了考察。研究结果表明,发酵罐转速为400 r/min时可以防止剪应力过大对高山被孢霉菌体造成损伤,然而该转速条件无法满足菌体生长与脂质积累过程中的高溶氧需求。因此进一步对溶氧供给进行了研究,结果表明添加富氧介质4%正己烷可以提高发酵体系的溶氧,但正己烷不利于菌体生长与EPA的积累;而采用富氧空气策略维持发酵体系相对溶氧在30%左右可以有效满足溶氧需求,且EPA产量相比优化前提高了1.8倍。因此选择富氧空气策略作为发酵过程中的溶氧调控措施。2.由于富氧空气策略下糖耗速率剧增,分批发酵后期葡萄糖供应不足阻碍了脂质的合成与积累,因此进行了补料工艺研究。补料工艺研究结果表明,残糖反馈补料控制初始葡萄糖含量为30 g/L,通过间歇性补料维持残糖浓度在1030 g/L,使得EPA的产量提高了79.1%。不同pH控制策略研究结果表明,氨水流加法能有效提高高山被孢霉的生物量和产脂水平,且高山被孢霉菌体生长的最适pH为6.0,脂质积累的最适pH为6.5。综上研究提出一种基于溶氧与两阶段pH调控高山被孢霉高产EPA的补料发酵工艺,最终菌体生物量可达41.2 g/L,总脂占菌干重31.6%,EPA产量高达3.5 g/L,该EPA产量为目前在高山被孢霉中的最高产量。3.通过蛋鸡实验研究高山被孢霉作为PUFAs饲料添加剂对鸡蛋与蛋鸡组织PUFAs组分的影响。研究结果表明随着高山被孢霉添加比例的增加,鸡蛋中的ARA、DPA与DHA含量逐步增加,ω-6/ω-3 PUFAs的比值逐渐下降,其中添加2%高山被孢霉在补充期末期时鸡蛋中的ARA、DPA与DHA含量分别提高21.1%、67.9%与68.9%,ω-6/ω-3PUFAs比值下降28.6%。另外,添加高山被孢霉可以显着降低蛋鸡组织的ω-6/ω-3 PUFAs的比值。其中添加2%高山被孢霉在补充期末期时鸡肝、鸡血、鸡胸肉中ω-6/ω-3 PUFAs比值分别下降46.5%、61.4%与73.7%。
曹珺[7]（2019）在《高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶的筛选鉴定及功能探究》文中提出多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）具有多种重要的生物学功能,动、植物中的PUFAs以18碳链长以下的脂肪酸为主,而20碳链长以上的脂肪酸可由某些产油微生物提供。高山被孢霉（Mortierella alpina）是一种脂质含量可达自身干重50%以上的产油丝状真菌,能合成多种高附加值的PUFAs,目前已经是工业化生产花生四烯酸（Arachidonic acid,AA）的主要菌株。二酰甘油酰基转移酶是三酰甘油（Triacylglycerol,TAG）合成途径中的关键限速酶,在不同物种中对其进行遗传改造发现其能显着影响TAG含量和组成。因为高山被孢霉中脂肪酸主要以TAG形式积累且AA含量高达总脂肪酸的30%40%,其二酰甘油酰基转移酶可能在这方面起到重要作用。本课题以高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶为研究对象,筛选高山被孢霉中的二酰甘油酰基转移酶编码基因,在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中异源表达进行功能鉴定,将能增强脂质积累的基因在高山被孢霉中进行过表达,探索其对高山被孢霉脂质积累的影响,为提高单细胞油脂产量和质量提供理论基础。本文主要研究结果如下:1、通过基因同源性比对分析发现高山被孢霉中含有3种二酰甘油酰基转移酶,分别为3个酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶1（DGAT1;命名MaDGAT1A、MaDGAT1B、MaDGAT1C）、2个酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶2（DGAT2;命名MaDGAT2A、MaDGAT2B）和1个磷脂:二酰甘油酰基转移酶（PDAT;命名MaPDAT）。对应6个候选编码基因（Madgat1a、Madgat1b、Madgat1c、Madgat2a、Madgat2b、Mapdat）。2、成功构建在酿酒酵母中分别异源表达Madgat1a、Madgat1b、Madgat1c、Madgat2a、Madgat2b、Mapdat的重组菌,且目的蛋白能正确表达。通过薄层色谱与气相-质谱联用法测定酿酒酵母重组菌中TAG和脂质的脂肪酸组成及含量,发现异源表达MaDGAT1A、MaDGAT1B、MaDGAT2A的酿酒酵母中TAG的含量分别提高7.23、12.09、4.91倍,对应总脂质含量提高了2.37、1.94、1.65倍,而MaDGAT2B、MaDGAT1C和MaPDAT则无显着效果,表明高山被孢霉来源的DGAT类二酰甘油酰基转移酶在提高脂质积累方面有显着作用。3、分析在提高脂质积累方面有显着作用的MaDGAT1A/1B/2A/2B对PUFAs的选择性。通过外加不同浓度（0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L）的AA,发现MaDGAT1类型和MaDGAT2类型均能提高重组菌对AA的催化效率,且MaDGAT1类型作用效果更显着。同时发现外加不同浓度的AA会影响各酿酒酵母重组菌中TAG的积累。另一方面,通过外源添加亚油酸（Linoleic acid,LA,C18:2）和花生四烯酸（AA,C20:4）,探究MaDGAT1A/1B/2A/2B对不同链长PUFAs底物的选择性,发现同时添加C18:2和C20:4可更明显地促进对应蛋白质的催化活性。与对照组相比,异源表达MaDGAT1A/1B/2A/2B对C20:4的催化效率提高倍数均大于对C18:2的,推测高山被孢霉来源的DGAT类二酰甘油酰基转移酶对20碳链长PUFAs的偏好性强于18碳链长PUFAs。4、在高山被孢霉中过表达对提高脂质积累有显着作用的MaDGAT1A/1B/2A/2B,研究结果表明,与对照菌株相比,过表达MaDGAT1B的重组菌可促进高山被孢霉脂质积累,最多使脂质积累量提高18.43%。过表达MaDGAT2A/2B的重组菌能显着提升PUFAs中AA和LA的成分含量,最多使AA和LA含量分别提高22.32%、20.40%,以上结果说明MaDGAT1和MaDGAT2对高山被孢霉脂质和某些特定PUFAs的积累均有一定的促进作用。
孙稳舟[8]（2019）在《响应面优化ARA发酵培养基及高产EPA工程菌构建的初步研究》文中指出多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）是指在其碳骨架上含有一个以上双键的长链脂肪酸,主要分为ω-6和ω-3两个系列。花生四烯酸（Arachidonic acid,ARA）和二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid,EPA）是其中的典型代表。ARA和EPA作为人体必须脂肪酸,在促进脑与神经发育、预防心血管疾病、调节炎症反应等生理活动方面具有重要作用,目前已经广泛应用于食品、医药保健品和化妆品等领域。ARA和EPA传统来源于动物肝脏和深海鱼油中提取,因提取成本高、产量不足而难以满足市场需求。产油微生物高山被孢霉（Mortierella alpina）中,ARA约占细胞总脂40%左右;在ω-3脱氢酶作用下,ARA会转化成EPA,同样具有生产EPA的潜力,因此通过对高山被孢霉的培养条件进行优化以及通过遗传改造等手段来提高ARA和EPA的含量逐渐成为研究热点。本文通过响应面优化培养基提高了 ARA产量,通过外源表达17des脱氢酶提高了 EPA产量,构建了 CRISPR/Cpf1敲除质粒,拟在高山被孢霉G12中建立基因编辑系统。本文首先以实验室筛选出的高山被孢霉G12为研究对象,通过响应面法优化高山被孢霉产ARA发酵培养基。在实验室前期研究和相关文献调研的基础上,使用Plackett-Burman法设计实验从初始培养基中筛选出三个影响ARA产量的主要因素:酵母粉、葡萄糖、玉米浆干粉,然后使用最陡爬坡法确定与ARA产量相关因素的最大响应值;最后用Box-Behnken法设计三因素三水平实验,通过结果分析与后续实验验证得到最优的培养基,其成分为:酵母粉12.6g/L,葡萄糖 75.6g/L,玉米浆干粉 7.1g/L,MgSO4 0.5g/L,KH2PO4 1g/L,CaCl2 0.5g/L,pH6.5。发酵7d,ARA产量达到5.12g/L,相比优化前提高了 27.3%。通过脂肪酸合成代谢通路可知,ARA在ω-3脂肪酸脱氢酶的作用下脱氢形成EPA,然而高山被孢霉ω-3脱氢酶仅在低温（18℃）下诱导表达且表达量有限。本文首先建立了根癌农杆菌C58C1介导的高山被孢霉G12遗传转化方法,构建了含有能在常温下表达的异枝水霉（Saprolegnia diclina）的ω-3型Δ17脱氢酶和萎锈灵抗性基因的双元载体pBIG-CBXB-17des,并成功转化高山被孢霉G12,经发酵验证EPA在总脂中含量可达到2.91%,产量达到0.47g/L。CRISPR/Cpfl是继ZFNs、TALENs后的第三代基因编辑技术,具有操作简便、编辑高效、通用性广等优点,为了研究脂肪酸代谢途径关键酶基因的功能,本文尝试在高山被孢霉G12中建立CRISPR/Cpfl基因编辑系统。以ura5为靶基因,设计sgRNA,构建了含有Cpfl基因和sgRNA的双元载体pBIG-sgRNA-nlsCpfl。试图通过农杆菌介导转化高山被孢霉G12,敲除ura5部分基因片段,得到ura5-营养缺陷型菌株。目前尚没有筛选到转化子,有待继续研究。
刘晓婷,杨瑞琪,卢英华,凌雪萍[9]（2017）在《一株新型花生四烯酸生产菌株高山被孢霉LU166的形态调控及维生素培养优化》文中研究指明以本课题组自主分离并鉴定的一株花生四烯酸（arachidonic acid,ARA）生产菌株,即高山被孢霉（Mortierella alpina）LU166为研究对象,首先利用凹槽摇瓶培养,较为稳定地将菌体形态控制为刺突状小球,这一形态比絮状和大球状更有利于油脂和ARA的积累.在此基础上优化了4种B族维生素(VB1、VB12、生物素和泛酸钙)的添加量,并复合添加优化后的维生素浓度,最终获得的菌体生物量、油脂和ARA产量分别达到24.74,12.66和6.46g/L,相比对照组分别提高了10%,30%和16%.
潘淼[10]（2017）在《高山被孢霉原生质体融合及全合成培养基研究》文中研究指明花生四烯酸（arachidonic acid,简称AA或ARA）在人体许多生理过程中起重要作用。作为一种重要的功能性油脂,在食品、药品、保健品和化妆品等领域的需求正逐步增长,市场前景继续呈扩大趋势。利用高山被孢霉（Mortierella alpina）发酵生产ARA因其ARA含量高、油脂组成合理等特点一直作为工业生产的主要方式。M.alpina是《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》（GB 14880—2012）中生产ARA的指定菌种,对其菌种进行选育是提高ARA产量与品质的关键因素之一。Malpi.的油脂组成直接影响到产品质量,在实际生产过程中发现当二十四碳烷酸（24C,本蜡酸）在总油脂中含量超过8%时,终产品油脂在低温冷藏时析出白色沉淀物。因此,本课题利用自然杂交的育种方法对低24C菌种进行了筛选。将24C及ARA含量均较低的一株野生菌YS-88447与生产用菌株G5进行自然杂交育种,筛选获得一株ZJ-3菌株,其24C含量为3.39%,对比生产菌株（24C含量为9.16%）降低了 170%;其ARA产量为5.21 g/L,对比生产菌株（ARA含量为4.86 g/L）提高了 6.72%。本课题探索并建立了 Fe2+与磁场共同作用诱变M alpina的方法,对G5进行诱变后筛选得到一株油脂含量达44.85%的高产菌株C16,其ARA产量为6.43g/L,24C含量为8.98%。为快速获得高油脂含量、低24C的ARA高产菌株,加速育种过程,本课题利用原生质体融合技术定向筛选优良性状相结合的菌株。将上述获得的优良性状菌株ZJ-3和C16进行原生质体融合,对原生质体制备及再生过程中相关因素进行研究,确定了最佳条件。为提高融合子筛选效率和准确率,本课题首次尝试使用流式细胞分选法并结合双灭活两种方法取得了良好的效果。经过对融合子再生及发酵培养,筛选获得菌株YR-2,其油脂含量达43.18%,24C含量为3.26%,ARA产量达6.32 g/L,并具有良好的遗传稳定性,达到预期目标。本研究为高山被孢霉菌种选育提供了新思路,可促进ARA生产的产能升级与产品品质提升。一直以来,M alpina研究及发酵生产所用氮源原料均为天然培养基（含酵母粉）,其成分复杂、不同批次易存在较大差异,不利于精细实验分析以及工业生产的稳定。因此,使用无机氮源对其进行替换实现全合成培养基发酵具有现实意义。本课题通过分类及单因素缺失实验确定了氨基酸混合物、无机盐以及生长因子的添加量,初步确定了M.apina全合成培养基成分。虽目前获得的ARA产量为天然培养基发酵的70%,但为研究高山被孢霉生长、代谢、遗传育种等提供了有力的支持。将得到的最适氨基酸组合、维生素浓度和无机盐组分补充进天然发酵培养基,实验组较对照组ARA产量提高14.7%,说明氨基酸、维生素和无机盐对M.alpina发酵具有促进作用,为工业生产培养基的优化提供了数据支撑。
二、K_La对高山被孢霉产花生四烯酸的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、K_La对高山被孢霉产花生四烯酸的影响（论文提纲范文）
（1）柠檬酸转运蛋白和柠檬酸裂解酶对高山被孢霉脂质积累的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 产油微生物和高山被孢霉简介 |
| 1.1.1 产油微生物 |
| 1.1.2 高山被孢霉概况 |
| 1.2 胞内柠檬酸对脂质合成的影响 |
| 1.2.1 氮限制条件下的柠檬酸积累现象 |
| 1.2.2 胞质柠檬酸对脂质合成途径的影响 |
| 1.2.3 胞内柠檬酸积累的影响因素 |
| 1.3 柠檬酸转运和裂解关键蛋白在真菌中的研究进展 |
| 1.3.1 线粒体柠檬酸-苹果酸类转运蛋白(CTP) |
| 1.3.2 线粒体柠檬酸-酮戊二酸转运蛋白(YHM) |
| 1.3.3 ATP-柠檬酸裂解酶(ACL) |
| 1.4 立题依据和主要研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要菌株和质粒 |
| 2.1.2 自行构建菌株及载体 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 高山被孢霉柠檬酸转运和裂解关键蛋白的序列比对及筛选 |
| 2.2.2 高山被孢霉柠檬酸转运和裂解关键蛋白基因过表达载体的构建 |
| 2.2.3 根癌农杆菌介导的高山被孢霉重组菌株的构建 |
| 2.2.4 高山被孢霉重组菌株的发酵培养 |
| 2.2.5 高山被孢霉重组菌株的生长和脂肪酸分析 |
| 2.2.6 高山被孢霉重组菌株上清液的残糖量测定 |
| 2.2.7 高山被孢霉重组菌株的实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 高山被孢霉重组菌株异柠檬酸脱氢酶酶活测定 |
| 2.2.9 高山被孢霉重组菌株胞内代谢物分析 |
| 2.2.10 数据处理及分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 线粒体柠檬酸转运蛋白对高山被孢霉脂质积累的影响 |
| 3.1.1 外源性柠檬酸钠对高山被孢霉生长和脂质积累的影响 |
| 3.1.2 高山被孢霉柠檬酸转运蛋白的比对筛选和氨基酸序列分析 |
| 3.1.3 高山被孢霉柠檬酸转运蛋白基因过表达重组菌株的构建 |
| 3.1.4 柠檬酸-苹果酸类转运蛋白对高山被孢霉生长和脂质积累的影响 |
| 3.1.5 柠檬酸-酮戊二酸转运蛋白对高山被孢霉脂质积累的影响及机制探究 |
| 3.2 ATP-柠檬酸裂解酶对高山被孢霉生长和脂质积累的影响 |
| 3.2.1 高山被孢霉MaACL蛋白的序列比对与氨基酸序列分析 |
| 3.2.2 高山被孢霉MaACL基因过表达重组菌株的构建 |
| 3.2.3 过表达MaACL基因对高山被孢霉生长和脂质积累的影响 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录B |
（2）高山被孢霉脂肪酸合成主要NADPH供给基因比较研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 高山被孢霉简介 |
| 1.2 多不饱和脂肪酸简介 |
| 1.3 多不饱和脂肪酸的功能 |
| 1.3.1 预防心血管疾病 |
| 1.3.2 调节免疫 |
| 1.3.3 构成细胞膜 |
| 1.3.4 抗炎作用 |
| 1.3.5 其他作用 |
| 1.4 多不饱和脂肪酸的微生物来源 |
| 1.4.1 产油细菌 |
| 1.4.2 产油真菌 |
| 1.4.3 产油藻类 |
| 1.5 微生物脂肪酸合成过程简介 |
| 1.6 NADPH的主要来源 |
| 1.7 RNAi技术简介 |
| 1.8 研究内容及意义 |
| 1.9 技术路线 |
| 第2章 GDH对高山被孢霉脂肪酸合成的影响 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.1.1 实验所需菌株 |
| 2.1.2 实验材料及试剂 |
| 2.1.3 实验所需仪器和设备 |
| 2.1.4 实验所用引物序列 |
| 2.1.5 实验所需培养基配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 总RNA质量的测定 |
| 2.2.3 反转录 |
| 2.2.4 扩增目的基因 |
| 2.2.5 PCR产物纯化 |
| 2.2.6 提取载体质粒 |
| 2.2.7 目的基因、载体单酶切 |
| 2.2.8 酶切产物纯化 |
| 2.2.9 重组载体构建 |
| 2.2.10 重组载体导入大肠杆菌 |
| 2.2.11 根癌农杆菌感受态的制备 |
| 2.2.12 重组载体导入根癌农杆菌 |
| 2.2.13 根癌农杆菌介导转化高山被孢霉 |
| 2.2.14 基因表达水平的分析 |
| 2.2.15 脂肪酸提取及分析 |
| 2.2.16 NADPH提取及分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 GDH过表达载体的构建 |
| 2.3.2 重组高山被孢霉菌株的筛选与鉴定 |
| 2.3.3 过表达菌株中GDH基因转录水平变化 |
| 2.3.4 过表达菌株中NADPH含量变化 |
| 2.3.5 过表达菌株中脂肪酸含量的变化 |
| 2.3.6 过表达菌株中NADPH主要来源基因表达量变化 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 GS沉默菌株特征及NADPH主要来源基因比较 |
| 3.1 实验材料及设备 |
| 3.1.1 实验所需菌株 |
| 3.1.2 实验材料及试剂 |
| 3.1.3 实验所需仪器和设备 |
| 3.1.4 实验所用引物序列 |
| 3.1.5 实验所需培养基配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 沉默载体的构建 |
| 3.3.2 重组高山被孢霉菌株的筛选与鉴定 |
| 3.3.3 沉默菌株中GS基因转录水平的变化 |
| 3.3.4 沉默菌株中NADPH含量变化 |
| 3.3.5 沉默菌株中脂肪酸含量变化 |
| 3.3.6 沉默菌株中NADPH主要来源基因表达量变化 |
| 3.4 高山被孢霉NADPH主要来源基因的比较 |
| 3.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 攻读硕士学位期间申请的发明专利 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）谷氨酸代谢途径对产油真菌脂肪酸积累机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 脂肪酸概述 |
| 1.2 多不饱和脂肪酸(PUFAs)的功能 |
| 1.2.1 多不饱和脂肪酸对机体的神经系统的功能和作用 |
| 1.2.2 多不饱和脂肪酸对机体细胞膜功能的作用 |
| 1.2.3 多不饱和脂肪酸对机体免疫功能的调节作用 |
| 1.3 花生四烯酸(ARA)的功能及应用 |
| 1.3.1 花生四烯酸的功能 |
| 1.3.2 花生四烯酸的应用 |
| 1.4 微生物脂质合成研究进展 |
| 1.4.1 微生物油脂 |
| 1.4.2 产油微生物 |
| 1.4.2.1 产油细菌 |
| 1.4.2.2 产油酵母 |
| 1.4.2.3 产油藻类 |
| 1.4.2.4 产油丝状真菌 |
| 1.4.3 微生物脂质积累机制 |
| 1.5 高山被孢霉脂质合成的研究进展 |
| 1.5.1 高山被孢霉发酵产脂的研究现状 |
| 1.5.2 高山被孢霉脂质合成途径的研究 |
| 1.6 谷氨酸代谢途径对高山被孢霉肪酸积累机制的研究 |
| 1.7 高山被孢霉产ARA的发酵培养基组成优化 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 1.9 主要研究内容 |
| 第2章 高产花生四烯酸重组菌株的构建及关键基因的验证 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 供试菌株和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 培养基及相关溶液 |
| 2.2.4 主要仪器和设备 |
| 2.2.5 PCR引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 高山被孢霉基因组生物信息学分析 |
| 2.3.2 高山被孢霉总RNA的提取 |
| 2.3.3 p5cdh基因的获取及扩增 |
| 2.3.4 载体p BIG2-ura5s-ITs的构建 |
| 2.3.5 重组质粒p BIG2-ura5s-p5cdh的构建 |
| 2.3.6 重组质粒转化大肠杆菌TOP10感受态 |
| 2.3.7 重组质粒转化根癌农杆菌 |
| 2.3.8 高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的构建 |
| 2.3.9 根癌农杆菌介导转化高山被孢霉 |
| 2.3.10 重组高山被孢霉的鉴定 |
| 2.3.11 p5cdh基因转录水平检测 |
| 2.3.12 1-吡咯琳-5-羧酸脱氢酶活性测定 |
| 2.3.13 NADPH/NADP水平测定 |
| 2.3.14 菌体油脂提取 |
| 2.3.15 发酵罐培养及脂肪酸组成的检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 p5cdh基因coding序列 |
| 2.4.2 1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶表达质粒的构建 |
| 2.4.3 1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶基因对高山被孢霉脂质合成的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于响应面法优化重组菌株MA-p5cdh-1 发酵培养基 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 培养基 |
| 3.3.2 高山被孢霉MA-p5cdh-1 液体种子培养 |
| 3.3.3 高山被孢霉MA-p5cdh-1 发酵培养 |
| 3.3.4 ARA产量分析 |
| 3.3.5 高山被孢霉MA-p5cdh-1 发酵培养基组分的优化 |
| 3.3.5.1 Plackett-Burman设计试验 |
| 3.3.5.2 最陡爬坡试验 |
| 3.3.5.3 Box-Behnken设计试验 |
| 3.3.6 数据统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 Plackett-Burman设计试验结果 |
| 3.4.2 最陡爬坡试验结果 |
| 3.4.3 Box-Behnken设计试验结果 |
| 3.4.4 响应面试验分析 |
| 3.4.5 响应面最优条件验证 |
| 3.5 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和参加科研 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 |
（4）高山被孢霉生长和产脂的影响因素分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 菌株培养 |
| 1.2.2 高山被孢霉生物量及脂肪酸组成和含量测定 |
| 1.2.3 培养基上清液残糖含量测定 |
| 1.2.4 菌体形态观察与记录 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 初始葡萄糖质量浓度对高山被孢霉生长和产脂的影响 |
| 2.2 活化次数对高山被孢霉生长和产脂的影响 |
| 2.3 接种量对高山被孢霉生长和产脂的影响 |
| 2.4 装液量对高山被孢霉生长和产脂的影响 |
| 2.5 发酵时间对高山被孢霉生长和产脂的影响 |
| 2.6 菌球打碎时间对高山被孢霉生长和产脂的影响 |
| 3 结论 |
（5）高山被孢霉中CRISPR系统的构建及NADPH供应途径挖掘（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略符号 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 产油丝状真菌 |
| 1.1.1 产油丝状真菌的种类 |
| 1.1.2 产油丝状真菌的产脂途径 |
| 1.1.3 产油丝状真菌的商业化应用 |
| 1.2 产油丝状真菌的基因操作方法 |
| 1.2.1 产油丝状真菌的转化方法 |
| 1.2.2 产油丝状真菌的多基因表达策略 |
| 1.3 产油丝状真菌的还原力供应途径 |
| 1.3.1 苹果酸酶途径 |
| 1.3.2 磷酸戊糖途径 |
| 1.3.3 异柠檬酸脱氢酶途径 |
| 1.3.4 其它潜在途径 |
| 1.4 高山被孢霉概述 |
| 1.4.1 高山被孢霉简介 |
| 1.4.2 高山被孢霉的基因编辑方法 |
| 1.4.3 高山被孢霉的遗传改造 |
| 1.5 论文的研究目的与意义 |
| 1.6 论文的主要研究内容 |
| 第二章 根癌农杆菌种类和高山被孢霉细胞形态对转化效率的影响 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验菌株与质粒 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 主要试剂及其配制 |
| 2.2.4 主要仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 根癌农杆菌感受态的制备 |
| 2.3.2 验证二元质粒电击转化根癌农杆菌 |
| 2.3.3 高山被孢霉新鲜孢子、萌发孢子、菌丝和固体单菌落的制备 |
| 2.3.4 根癌农杆菌介导质粒转化高山被孢霉 |
| 2.3.5 重组高山被孢霉的基因组验证 |
| 2.3.6 根癌农杆菌致毒因子转录水平测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 不同根癌农杆菌中验证二元质粒的转化 |
| 2.4.2 不同根癌农杆菌种类对高山被孢霉转化效率的影响 |
| 2.4.3 根癌农杆菌的致毒因子对转化效率差异的影响 |
| 2.4.4 不同细胞形态高山被孢霉的制备 |
| 2.4.5 不同高山被孢霉细胞形态对其转化效率的影响 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 高山被孢霉中组成型启动子下CRISPR系统的构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与设备 |
| 3.2.1 实验菌株 |
| 3.2.2 培养基 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 CRISPR系统中相关载体的构建 |
| 3.3.2 根癌农杆菌的电转 |
| 3.3.3 高山被孢霉的根癌农杆菌转化 |
| 3.3.4 高山被孢霉的脂肪酸提取与检测 |
| 3.3.5 高山被孢霉中ura5基因敲除菌株的筛选 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 组成型启动子下SpCas9重组高山被孢霉的构建 |
| 3.4.2 组成型启动子下LbCpf1重组高山被孢霉的构建 |
| 3.4.3 靶向敲除ura5基因的引导链的设计与合成 |
| 3.4.4 高山被孢霉中Sp Cas9与Lb Cpf1 基因敲除效率的比较 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 高山被孢霉中诱导型启动子下CRISPR系统的构建 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与设备 |
| 4.2.1 实验菌株 |
| 4.2.2 培养基 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 主要仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 含诱导型启动子CRISPR系统的二元载体的构建 |
| 4.3.2 根癌农杆菌的电转 |
| 4.3.3 高山被孢霉的根癌农杆菌转化 |
| 4.3.4 高山被孢霉的脂肪酸提取与检测 |
| 4.3.5 高山被孢霉总RNA的提取 |
| 4.3.6 高山被孢霉cDNA库的构建 |
| 4.3.7 高山被孢霉中ura5基因敲除菌株的筛选 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 诱导型启动子cbh1在高山被孢霉中的功能验证 |
| 4.4.2 高山被孢霉中诱导型启动子cbh1下CRISPR系统的构建 |
| 4.4.3 诱导型启动子cbh1的诱导条件优化 |
| 4.4.4 筛选标记尿嘧啶ura5基因的诱导敲除 |
| 4.4.5 尿嘧啶ura5缺陷型菌株的筛选 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 高山被孢霉还原力供应途径的挖掘与筛选 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与设备 |
| 5.2.1 实验菌株 |
| 5.2.2 培养基 |
| 5.2.3 主要仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 高山被孢霉中功能基因的确定 |
| 5.3.2 高山被孢霉总RNA的提取 |
| 5.3.3 高山被孢霉cDNA库的构建 |
| 5.3.4 高山被孢霉中目的基因的获取 |
| 5.3.5 根癌农杆菌中重组二元质粒的构建 |
| 5.3.6 高山被孢霉的根癌农杆菌转化 |
| 5.3.7 高山被孢霉的脂肪酸提取与检测 |
| 5.3.8 高山被孢霉中功能基因的转录水平测定 |
| 5.3.9 高山被孢霉中功能蛋白的酶活性测定 |
| 5.3.10 高山被孢霉中NADP+和NADPH水平测定 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 高山被孢霉中GAPDH、NADK与 NADHK功能基因的确定 |
| 5.4.2 GAPDH、NADK与 NADHK功能基因的转录组数据分析 |
| 5.4.3 GAPDH、NADK与NADHK同源过表达与RNA干扰菌株的构建 |
| 5.4.4 GAPDH在高山被孢霉中的作用 |
| 5.4.5 NADK和 NADHK在高山被孢霉中的作用 |
| 5.4.6 高山被孢霉中还原力供应途径的排序 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 高山被孢霉中诱导型启动子下CRISPR系统的初步应用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与设备 |
| 6.2.1 实验菌株 |
| 6.2.2 培养基 |
| 6.2.3 主要试剂 |
| 6.2.4 主要仪器与设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 高山被孢霉的根癌农杆菌转化 |
| 6.3.2 高山被孢霉的基因组验证 |
| 6.3.3 高山被孢霉的脂肪酸提取与检测 |
| 6.3.4 诱导启动子的诱导 |
| 6.3.5 尿嘧啶ura5基因缺陷型的筛选 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 应用诱导型启动子下的CRISPR系统导入还原力基因me1 |
| 6.4.2 筛选标记的再次回收 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:攻读博士学位期间发表论文及申请专利情况 |
（6）高山被孢霉产EPA发酵工艺优化及其在蛋鸡饲料中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 EPA的来源与微生物油脂概述 |
| 1.1.1 EPA的来源概述 |
| 1.1.2 微生物油脂概述 |
| 1.1.3 高山被孢霉概述 |
| 1.2 高山被孢霉产PUFAs研究进展 |
| 1.2.1 高山被孢霉产EPA的研究进展 |
| 1.2.2 高山被孢霉产PUFAs发酵培养基研究进展 |
| 1.2.3 高山被孢霉产PUFAs发酵工艺研究进展 |
| 1.3 PUFAs在蛋鸡饲料中的应用研究进展 |
| 1.3.1 PUFAs营养强化鸡蛋概述 |
| 1.3.2 不同来源的PUFAs在蛋鸡饲料中的应用研究进展 |
| 1.3.3 高山被孢霉PUFAs在蛋鸡饲料中的应用研究进展 |
| 1.4 立题依据与主要研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株与实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 高山被孢霉CCFM698基础培养与发酵方法 |
| 2.2.2 高山被孢霉CCFM698生理生化参数的测定 |
| 2.2.3 蛋鸡实验方案 |
| 2.3 数据处理与分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 高山被孢霉产EPA分批发酵条件优化 |
| 3.1.1 碳氮源添加比例对高山被孢霉产EPA的影响研究 |
| 3.1.2 发酵罐不同转速对高山被孢霉产EPA的影响研究 |
| 3.1.3 高山被孢霉产EPA不同溶氧供给策略研究 |
| 3.2 高山被孢霉产EPA补料发酵工艺研究 |
| 3.2.1 残糖反馈补料发酵对高山被孢霉产EPA的影响研究 |
| 3.2.2 氨水流加法结合残糖反馈补料对高山被孢霉产EPA的影响研究 |
| 3.2.3 两阶段pH控制结合氨水流加法与残糖反馈补料对高山被孢霉产EPA的影响研究 |
| 3.3 高山被孢霉PUFAs在蛋鸡饲料中的应用 |
| 3.3.1 菌体饲料对蛋鸡鸡蛋PUFAs组分的影响研究 |
| 3.3.2 菌体饲料对蛋鸡鸡肝PUFAs组分的影响研究 |
| 3.3.3 菌体饲料对蛋鸡鸡血PUFAs组分的影响研究 |
| 3.3.4 菌体饲料对蛋鸡鸡胸肉PUFAs组分的影响研究 |
| 主要结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读硕士期间发表的文章 |
（7）高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶的筛选鉴定及功能探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸与微生物油脂概述 |
| 1.1.1 多不饱和脂肪酸 |
| 1.1.2 产油微生物及微生物油脂 |
| 1.1.3 高山被孢霉简介 |
| 1.2 微生物中三酰甘油合成途径 |
| 1.2.1 甘油-3-磷酸途径 |
| 1.2.2 相关酶的功能 |
| 1.3 二酰甘油酰基转移酶的研究背景 |
| 1.3.1 二酰甘油酰基转移酶的结构和分类 |
| 1.3.2 二酰甘油酰基转移酶的功能和应用 |
| 1.3.3 高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶的研究进展 |
| 1.4 立题依据和主要研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制方法 |
| 2.1.5 培养基及其配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 菌株的培养与保藏 |
| 2.2.2 高山被孢霉中目的基因的筛选与生物信息学分析 |
| 2.2.3 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶的克隆及异源表达载体的构建 |
| 2.2.4 PEG/LiAc法构建酿酒酵母重组菌 |
| 2.2.5 酿酒酵母重组菌中异源蛋白表达水平 |
| 2.2.6 外加底物后酿酒酵母转化子中异源蛋白的催化选择性 |
| 2.2.7 酿酒酵母重组菌产脂情况 |
| 2.2.8 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶的克隆及同源过表达载体的构建 |
| 2.2.9 利用根癌农杆菌介导法过表达高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶 |
| 2.2.10 高山被孢霉重组菌株的筛选及验证 |
| 2.2.11 高山被孢霉重组菌生长及产脂情况 |
| 2.2.12 数据处理及分析方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶的筛选和生物学信息分析 |
| 3.1.1 同源性及保守域分析 |
| 3.1.2 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶蛋白结构分析 |
| 3.1.3 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶原始转录水平分析 |
| 3.2 高山被孢霉二酰甘油酰基转移酶功能验证 |
| 3.2.1 酿酒酵母重组菌的构建和筛选验证 |
| 3.2.2 酿酒酵母重组菌中异源蛋白表达水平测定 |
| 3.2.3 酿酒酵母重组菌产脂情况分析 |
| 3.2.4 酿酒酵母重组菌中二酰甘油酰基转移酶催化选择性分析 |
| 3.3 高山被孢霉重组菌株的构建和功能验证 |
| 3.3.1 二元表达载体构建 |
| 3.3.2 高山被孢霉重组菌株的筛选及鉴定 |
| 3.3.3 高山被孢霉重组菌生长和产脂分析 |
| 主要结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ：作者在攻读硕士学位期间发表的文章 |
| 附录 Ⅱ：材料与方法中附表 |
| 附录 Ⅲ：部分气相色谱峰图 |
（8）响应面优化ARA发酵培养基及高产EPA工程菌构建的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 多不饱和脂肪酸ARA和EPA简介 |
| 1.1.1 花生四烯酸ARA简介 |
| 1.1.2 二十碳五烯酸EPA简介 |
| 1.2 高山被孢霉简介 |
| 1.2.1 高山被孢霉生理特性与安全性 |
| 1.2.2 高山被孢霉产ARA和EPA研究概况 |
| 1.3 丝状真菌遗传转化系统 |
| 1.3.1 丝状真菌的遗传转化技术 |
| 1.3.2 高山被孢霉遗传转化技术的研究现状 |
| 1.4 CRISPR/Cpfl系统概述 |
| 1.4.1 CRISPR/Cpfl简介 |
| 1.4.2 CRISPR/Cpfl系统的应用 |
| 1.5 本课题研究的内容和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株与质粒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 培养基与缓冲溶液的配制 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 高山被孢霉的培养与保藏 |
| 2.2.2 培养基优化实验设计 |
| 2.2.3 质粒构建 |
| 2.2.4 根癌农杆菌C58C1介导的高山被孢霉G12遗传转化 |
| 2.2.5 分析测定 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 响应面法优化高山被孢霉产ARA发酵培养基 |
| 3.1.1 Plackett-Burman实验 |
| 3.1.2 最陡爬坡实验 |
| 3.1.3 Box-Behnken响应面优化实验 |
| 3.1.4 响应面分析 |
| 3.1.5 产量验证 |
| 3.2 高山被孢霉表达△17脂肪酸脱氢酶重组菌株的构建 |
| 3.2.1 农杆菌质粒消除 |
| 3.2.2 高山被孢霉对萎锈灵的敏感性实验 |
| 3.2.3 质粒构建 |
| 3.2.4 农杆菌转化高山被孢霉 |
| 3.2.5 发酵验证EPA产量 |
| 3.3 基于CRISPR/Cpfl真菌敲除质粒的构建 |
| 3.3.1 高山被孢霉对5-FOA敏感性实验 |
| 3.3.2 质粒构建 |
| 3.3.3 农杆菌转化高山被孢霉 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（9）一株新型花生四烯酸生产菌株高山被孢霉LU166的形态调控及维生素培养优化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 分析方法 |
| 1.2.1 菌种鉴定 |
| 1.2.2 菌体生物量的测定 |
| 1.2.3 油脂产量的测定 |
| 1.2.4 ARA产量的测定 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 菌株鉴定 |
| 2.1.1 ITS/18SrRNA分析 |
| 2.1.2 系统演化树分析 |
| 2.2 凹槽摇瓶培养对高山被孢霉LU166发酵产ARA的影响 |
| 2.3 B族维生素对高山被孢霉LU166发酵产ARA的影响 |
| 3 结论 |
（10）高山被孢霉原生质体融合及全合成培养基研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 ARA的理化性质、生理功能及来源 |
| 1.1.1 ARA的理化性质 |
| 1.1.2 ARA的生理功能 |
| 1.1.3 ARA的主要来源 |
| 1.2 高山被孢霉发酵法产ARA的研究进展 |
| 1.2.1 高山被孢霉菌种选育 |
| 1.2.2 高山被孢霉发酵调控 |
| 1.3 原生质体融合技术 |
| 1.3.1 原生质体融合技术的优点 |
| 1.3.2 原生质体融合技术的研究进展 |
| 1.3.3 原生质体融合技术的关键步骤 |
| 1.4 本课题研究的意义和主要内容 |
| 1.4.1 本课题研究的意义 |
| 1.4.2 本课题研究的主要内容 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 试剂和仪器 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 缓冲溶液 |
| 2.2 实验研究方法 |
| 2.2.1 高山被孢霉菌种的保藏方法 |
| 2.2.2 生长曲线的绘制 |
| 2.2.3 高山被孢霉平板菌丝及孢子扫描电镜观察 |
| 2.2.4 原生质体制备 |
| 2.2.5 融合子筛选 |
| 2.2.6 ARA高产菌的筛选 |
| 2.2.7 ARA产量检测方法及步骤 |
| 2.2.8 自然杂交育种 |
| 2.2.9 磁场与Fe~(2+)诱变 |
| 第三章 自然杂交与磁场诱变育种 |
| 3.1 自然杂交育种 |
| 3.2 磁场诱变育种 |
| 3.2.1 实验分组设定 |
| 3.2.2 磁场与Fe~(2+)共同作用对高山被孢霉致死率的影响 |
| 3.2.3 Fe~(2+)浓度变化对高山被孢霉孢子致死率的影响 |
| 3.2.4 Fe~(2+)浓度对高山被孢霉孢子正负突变率的影响 |
| 3.2.5 磁场与Fe~(2+)共同诱变筛选高产菌株 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 原生质体融合及融合子筛选 |
| 4.1 原生质体制备过程中多因素的影响研究 |
| 4.1.1 预处理对原生质体制备的影响 |
| 4.1.2 酶种类及浓度的选择 |
| 4.1.3 菌丝培养的最佳时间 |
| 4.1.4 酶解时间的选择 |
| 4.1.5 酶解的最佳温度 |
| 4.1.6 缓冲液对原生质体制备及再生的影响 |
| 4.1.7 高山被孢霉原生质体形态观察 |
| 4.2 双灭活法制备及筛选融合子 |
| 4.2.1 紫外灭活ZJ-3原生质体 |
| 4.2.2 热灭活C16原生质体 |
| 4.2.3 灭活的原生质体融合及再生 |
| 4.3 流式细胞仪法分选融合子 |
| 4.3.1 分选过程及结果 |
| 4.3.2 融合子的再生 |
| 4.4 融合子的产量验证 |
| 4.5 菌株形态观察 |
| 4.5.1 菌株平板形态观察 |
| 4.5.2 菌株液体发酵菌丝形态观察 |
| 4.5.3 菌丝形态及产孢情况的扫描电镜观察 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 高山被孢霉全合成培养基的研究 |
| 5.1 碳源的优化研究 |
| 5.2 用成分已知的氮源代替酵母粉 |
| 5.3 氨基酸的缺失添加实验 |
| 5.4 维生素浓度调整 |
| 5.5 无机盐的选择添加 |
| 5.6 全合成培养基产量验证 |
| 5.7 发酵培养基优化 |
| 5.8 本章小结 |
| 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
四、K_La对高山被孢霉产花生四烯酸的影响（论文参考文献）
- [1]柠檬酸转运蛋白和柠檬酸裂解酶对高山被孢霉脂质积累的影响[D]. 凌凤珠. 江南大学, 2021(01)
- [2]高山被孢霉脂肪酸合成主要NADPH供给基因比较研究[D]. 武迎春. 河北工程大学, 2021(04)
- [3]谷氨酸代谢途径对产油真菌脂肪酸积累机制研究[D]. 吴彪. 河北工程大学, 2020(05)
- [4]高山被孢霉生长和产脂的影响因素分析[J]. 唐鑫,顾舒婕,常璐璐,赵建新,张灏,陈海琴,陈卫. 中国油脂, 2020(07)
- [5]高山被孢霉中CRISPR系统的构建及NADPH供应途径挖掘[D]. 王顺贤. 江南大学, 2020(01)
- [6]高山被孢霉产EPA发酵工艺优化及其在蛋鸡饲料中的应用[D]. 黄明旺. 江南大学, 2019(12)
- [7]高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶的筛选鉴定及功能探究[D]. 曹珺. 江南大学, 2019(12)
- [8]响应面优化ARA发酵培养基及高产EPA工程菌构建的初步研究[D]. 孙稳舟. 中国科学技术大学, 2019(11)
- [9]一株新型花生四烯酸生产菌株高山被孢霉LU166的形态调控及维生素培养优化[J]. 刘晓婷,杨瑞琪,卢英华,凌雪萍. 厦门大学学报(自然科学版), 2017(05)
- [10]高山被孢霉原生质体融合及全合成培养基研究[D]. 潘淼. 中国科学技术大学, 2017(01)