一、橡胶树炭疽病病原菌变异的初步研究（论文文献综述）
郭艳春[1]（2020）在《黄麻炭疽菌代表性菌株分离鉴定及应用核心种质的构建》文中指出黄麻,为锦葵科（Malvaceae）黄麻属（Corchorus）一年生草本植物,是世界上最重要的韧皮部纤维作物之一。炭疽病会严重影响黄麻纤维的产量和品质,明确炭疽病病原菌致病力并构建一批优异的应用核心种质是促进黄麻遗传育种、挖掘优异基因和提高生产利用的必要途径。本研究对中国黄麻主产区采集得到的黄麻炭疽病病原菌样本进行分离鉴定和致病力测定;对黄麻抗病种质资源进行了抗性评价,并构建了一批黄麻应用核心种质;最后通过SSR荧光标记毛细管电泳技术构建了黄麻应用核心种质的DNA分子身份证。主要结果如下:1.在实验室前期分离鉴定我国黄麻主产区炭疽病病原菌92个菌株的基础上,进一步分离纯化,结合形态学特征鉴定,从中选取11个代表性病原菌菌株,对r DNA-ITS和LSU区域进行基因序列分析。系统进化树显示,菌株ZZ4、GX19等10个菌株为胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）,菌株CS3为黑线炭疽菌（Colletotrichum dematium）。从分子水平上证实中国黄麻主产区近年炭疽病发生的病原菌类型主要有胶孢炭疽菌和黑线炭疽菌。2.为了明确这11个代表性炭疽病病原菌的致病力,以福黄麻3号和福农5号为材料,分别在福州市和三明市两地进行人工接种的致病力测定。根据病斑大小,可将炭疽菌11个代表性菌株的致病力划分为强、中、弱3个类型。其中,菌株GX19的致病力较强,在福州地区病斑大小分别为11.70±2.79 mm、16.40±5.82 mm,在三明地区病斑大小分别为13.00±1.56 mm、13.40±2.32 mm。而黑线炭疽菌菌株CS3在福州和三明两地的病斑较小,说明胶孢炭疽菌和黑线炭疽菌间致病力也存在差异,黑线炭疽菌的致病力可能比胶孢炭疽菌弱。3.利用强致病力菌株GX19对300份黄麻种质资源进行抗性鉴定,可划分为高抗、抗、中抗、中感、感和高感6个类型。其中爱店野生种、巴麻72-1、广巴矮等40份种质表现为高抗,占总数的13.33%。在300份黄麻种质资源的2016-2018年农艺性状统计基础上,结合2019年对农艺性状进一步鉴定和抗性种质的筛选,本研究筛选出纤维产量高、纤维品质好、抗逆、生育期适宜、适宜机械化等优异的应用核心种质,加上4份骨干亲本,按特性可分为16个应用型,剔除不同组内同一种质,共58份品种。构建的黄麻应用核心种质可促进黄麻遗传育种和挖掘优异基因。4.为了便于黄麻应用核心种质的鉴定、保护和智能化管理,本研究采用SSR荧光标记毛细管电泳技术分析了12对荧光核心引物的多态性,共检测出140个多态性位点。将毛细管电泳得到的分子量数据以数字+英文字母方式编码,选取12对荧光核心引物的组合,成功构建出58份应用核心种质的字符串、条形码和二维码等三种形式的DNA分子身份证。以上结果可为促进黄麻种质资源的高效利用及快速分子鉴定提供科学依据。
郑行恺[2]（2019）在《海南省橡胶树炭疽病监测及其防治药剂施用技术研究》文中研究表明天然橡胶是四大工业原料中唯一的可再生资源,由炭疽病菌侵染引起的橡胶树炭疽病是当前我国橡胶生产上最为严重的两大叶部病害之一。本研究通过对海南省主栽橡胶树品种（系）炭疽病发生流行情况进行联合调查与监测;对36份核心橡胶种质进行抗炭疽病评价;对海南新发炭疽病菌进行鉴定和抗药性评价;熟化橡胶苗圃炭疽病无人机防治技术,得出以下主要研究结果:本研究联合海南天然橡胶产业集团股份有限公司对PR107、RRIM600和热研7-33-97等现有的主栽品种进行炭疽病疫情调查发现,PR107和RRIM600种植面积最大,分别占51.06%（153万亩）和43.39%（130万亩）,各主栽品种均受炭疽病危害;在对橡胶树炭疽病的随机踏查和固定监测中发现,实生苗、嫁接苗、增殖苗、幼龄树和成龄胶园炭疽病全年均可发生,3-4月为盛发期。炭疽病代表性菌株 HCgGX1649（Colletotrichu gloeosporioides）HCaYNJP162（Colletotrichumacutatum）接种36份核心橡胶种质的抗炭疽病评价发现,GT1、PB86、热研7-20-59、文昌193、文昌7-35-11和针选1号6个品种（系）综合抗性水平为中抗（MR）,文昌11、热研7-33-97和云研77-2等24个品种（系）为感病（S）,PR107、RRIM600和大丰99等6个品种（系）为中感（MS）。田间采集炭疽病样264份,获得炭疽病分离物140份,形态观察、致病性测定和多基因系统发育分析发现分离自琼中县阳江农场苗圃橡胶树叶片上的菌株HCkHNQZ1736为喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii）,这是首次在海南省橡胶树上发现该类病菌。生物学特性测定发现,该菌株最适生长温度为28℃,致死温度为35℃;最适生长pH为6;光暗交替利于菌落生长;果胶、蛋白胨分别为最适碳源和氮源。致病力评价发现其对PR107、RRIM600、热研7-33-97和大丰95四个主推品种均有较强致病力。以分离自云南保山的喀斯特炭疽病菌MeCkYN1705为对照,对菌株HCkHNQZ1736开展杀菌剂敏感性评价。结果表明菌株HCkHNQZ1736和MeCkYN1705对甾醇脱甲基抑制剂类（DMIs）杀菌剂咪鲜胺锰盐不具抗药性,EC50分别为0.0784 μg/mL和0.0775μg/mL。HCkHNQZ1736对苯并咪唑类杀菌剂多菌灵表现出高抗药性,EC50达1107.2654μg/mL,而 MeCkYN1705 的 EC50仅为 0.0554 μg/ml。克隆了菌株 HCkHNQZ1736的tub2基因,序列分析发现其所编码的第198个氨基酸位点由谷氨酸（Glu-E）突变为丙氨酸（Ala-A）,推测该氨基酸位点突变是导致该菌株产生多菌灵抗性的原因。对中国热带农业科学院环境与植物保护研究所研发的橡胶树炭疽病防治新型药剂“保叶清”微乳剂开展无人机在PR107橡胶树嫁接苗圃的飞防试验。防效评价结果表明,飞行高于树冠2米,未添加飞防助剂“热飞”,3%和4%的“保叶清”微乳剂校正防效分别为46.33%和55.91%;飞行高于树冠1米,添加1%飞防助剂“热飞”,两种浓度微乳剂的校正防效分别为67.42%和73.27%;飞行高于树冠2米,添加1%飞防助剂“热飞”,两种浓度的校正防效分别为71.27%和80.07%。调查发现该药剂对橡胶树长势和环境无不良影响,表明其可用于田间橡胶树炭疽病的防治工作。
顾红杰[3]（2019）在《海南菠萝蜜真菌病害调查、病原鉴定及3种病原真菌生物学特性与室内药剂筛选》文中研究说明菠萝蜜（Artocarpusheterophyllus Lam.）,英文名Jackfruit,是我国热带地区重要的经济水果。近年来由于市场需求日益增长,海南菠萝蜜生产在各级政府的大力支持下发展迅速,目前全省种植面积已达9万余亩。2017年1月至2018年5月对海南地区开展菠萝蜜真菌病原分布和危害程度的调查,并进行了菠萝蜜炭疽病、菠萝蜜果腐病、菠萝蜜叶斑病的病原分离与鉴定、生物学特性研究和室内药剂筛选,结果如下:1、菠萝蜜真菌性病害的病原调查海南菠萝蜜真菌病害中以炭疽病和花果软腐病最为严重,炭疽病在海南各个市县的菠萝蜜种植园中均有发生,主要危害老叶和果实,其发病率范围从20%至78%,不同的果园发病严重程度差别较大,病情指数范围再5-67之间;花果软腐病在各个果园均有发生,其中海口和儋州的菠萝蜜果园发病最严重;瓜笄霉果腐病所有果园均有发生,发病率最高可达40%;果腐病在三亚和保亭地区发病比较严重,其中三亚南田农场发病率高达35%,保亭新星农场雄花发病率在80%以上;叶斑病在保亭和儋州两个地区发病比较严重,爆发期可使菠萝蜜下层叶片全部感病,尤其是在每年的一月份病害爆发比较严重。2、菠萝蜜炭疽病研究以病原菌形态学特征为基础,结合ITS、GAPDH、ACT、CHS-1和TUB2序列的多基因联合系统发育分析,首次分离并确定海南菠萝蜜炭疽病菌株分别为Colletotrichum siamense、Colletotrichum arxii、Colletotrichum pseudomajus。对分离频率最多的暹罗刺盘孢（C siamense）进行生物学特性研究,结果显示:该菌在PDA上平均生长速率为1.38cm/d,最适培养基为菠萝蜜叶片煎汁培养基,菌丝致死温度为58℃10 min,生长最适温度范围为25-30℃,最适pH值范围为6.0-9.0,可溶性淀粉为最理想碳源,酵母浸粉和牛肉浸膏为最理想氮源,完全黑暗最利于菌丝生长。13种杀菌剂对暹罗刺盘孢（C.siamense）室内抑菌效果由强到弱排序为:20%苯甲·咪鲜胺>50%咪鲜胺锰盐>50%多菌灵>50%多·锰锌>300 g/L苯甲·丙环唑>250 g/L吡唑醚菌酯>10%苯醚甲环唑>50%甲基硫菌灵>325 g/L苯甲·嘧菌酯>25%溴菌腈>560 g/L嘧菌·百菌清>400 g/L嘧霉胺>500 g/L异菌脲。其中20%苯甲·咪鲜胺的 ECs0 值为 0.0460 mg/L。3、菠萝蜜果腐病研究以形态学特征为基础,结合病原菌的ITS序列和EF1-α序列,联合两基因建立系统发育分析,将菠萝蜜果腐病的病原菌鉴定为可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）,该菌引起的菠萝蜜果腐病在国内首次发现。对可可毛色二孢菌（L.theobromae）进行生物学特性研究,结果显示:该菌在PDA上平均生长速率为3.03 cm/12 h,最适培养基为菠萝蜜幼果煎汁培养基和PSA培养基,菌丝致死温度为53℃10 min,最适温度范围为28-35℃,最适范围为5.0-8.0,果糖为的最理想碳源,其次是葡萄糖、蔗糖和半乳糖,酵母浸粉为最理想氮源,完全黑暗最利于菌丝生长。12种杀菌剂对该菌室内抑菌效果由强到弱排序为:500g/L异菌脲>50%多·锰锌>50%多菌灵>300 g/L苯甲·丙环唑>50%甲基硫菌灵>20%苯甲·咪鲜胺>50%咪鲜胺锰盐>250 g/L吡唑醚菌酯>10%苯醚甲环唑>400 g/L嘧霉胺>325 g/L苯甲·嘧菌酯>25%溴菌腈。其中500 g/L异菌脲的EC50值为0.0880 mg/L。4、叶斑病研究结合病原菌的形态学特征与ITS序列建立基因系统发育分析,将叶斑病的病原菌鉴定为弯孢霉（Curvularia petersonii）,该菌引起的菠萝蜜叶斑病在国内首次发现。对弯孢霉（C.peteraonii）进行生物学特性研究,结果显示:菌丝在PDA上平均生长速率为1.24 cm/d,最适培养基为菠萝蜜叶片煎汁培养基和燕麦琼脂培养基,菌丝致死温度为58℃10 min,最适生长温度范围为28-35℃,最适pH值范围为6.0-10.0,麦芽糖和可溶性淀粉为最理想碳源,蛋白胨、牛肉浸膏和酵母浸粉为最理想氮源,硫酸铵、硝酸铵和硝酸钠抑制菌丝生长,完全光照最利于菌丝生长。11种杀菌剂对该菌室内抑菌效果由强到弱排序为:20%苯甲·咪鲜胺>50%咪鲜胺锰盐>300 g/L苯甲·丙环唑>250 g/L吡唑醚菌酯>325 g/L苯甲·嘧菌酯>400 g/L嘧霉胺>10%苯醚甲环唑>500 g/L异菌脲>560 g/L嘧菌·百菌清>25%溴菌腈>50%多·锰锌。其中20%苯甲·咪鲜胺的EC50值为0.3918 mg/L。
李书缘[4]（2019）在《巴西橡胶树LFG基因在抑制真菌侵染中的负调控功能研究》文中研究指明天然橡胶广泛应用于工业、农业、国防、交通运输、机械制造和医疗卫生等各个方面,具有重要的经济意义和战略意义;植物病原真菌-白粉菌、炭疽菌及疫霉等均会危害巴西橡胶树,这些病原真菌会造成天然橡胶的严重减产并造成重大的经济损失,且现阶段针对橡胶树的抗病育种工作的研究相对滞后。本工作初步探索橡胶树LFG基因在病原真菌侵染中的功能,以期为橡胶树抗病育种工作提供理论依据和技术铺垫。主要研究结果如下:在橡胶树基因库中鉴定了 1 1个LFG同源蛋白,通过与AtLFG基因的比对选择同源性最高的两个基因分别称为:HbLFG1和HbLFG2。克隆两个基因并进行相关生物信息学的分析,分析结果表明两个基因编码的蛋白都有7个跨膜结构域且都不含有信号肽,都含有一个BI-1-like superfamily保守结构域,但两个蛋白的3个保守模序中有5处位点存在差异。测定在橡胶树白粉菌侵染橡胶树叶片0h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h时HbLFG1和HbLFG2基因的表达量,结果表明,前24 h内随时间的增加两个基因的表达量均上升,但HbLFG1比HbLFG2基因的表达量的上调更明显;测定橡胶树白粉菌侵染后不同感病等级的橡胶树叶片中HbLFG1和HbLFG2基因的表达量,结果表明,随等级的增加,两个基因的表达量呈现一个先升后降的趋势,HbLFG1比HbLFG2基因的表达量上调更明显,结果表明HbLFG1和HbLFG2基因可能参与了橡胶树对白粉菌侵染的应答调控,并且HbLFG1可能比HbLFG2在响应病原菌侵染中的作用更加显着。为确定HbLFG基因是否对病原菌的侵染具有调控作用,利用CRISPR/Cas9技术在拟南芥野生型中敲除AtLFG,获得可稳定遗传的突变体,再对拟南芥LFG缺失突变体瞬时表达HbLFG1基因（△AtLFG/HHbLFG1）,用辣椒疫霉和橡胶树胶孢炭疽菌在拟南芥野生型、AtLFG缺失突变体和△AtLFG/HHbLFG1植株上进行致病力测定。我们把致病力结果分为1级、2级、3级三个等级,分别为:病原菌未侵染、病原菌菌丝侵入受阻且短小、病原菌形成网状侵入菌丝;测定结果显示辣椒疫霉和橡胶树胶孢炭疽的50处侵染位点中,拟南芥野生型中菌丝侵入率占92%和96%;LFG缺失突变体中菌丝侵入率下降至32%和30%:△AtLFG/HHbLFG1中菌丝侵入率又上升到70%和78%;结果表明AtLFG基因对植物抗侵染性具有负调控的作用,HbLFG1基因具有和AtLFG基因类似的作用,HbLFG1也是负调控基因。综上,本研究初步证明来自橡胶树的HbLFG1基因在对真菌病害的抗病性中可能担当重要角色,对橡胶树抗病育种提供重要借鉴意义。
张晓东[5]（2018）在《橡胶树原生质体PTI检测体系的建立以及橡胶树抗病相关CDPK基因家族的克隆和功能鉴定》文中研究表明天然橡胶因为其优良的特性,被广泛用于工业、国防、交通、民生、医药、卫生等领域,是一种重要的工业原料和战略资源,然而橡胶树病害的发生严重影响了天然橡胶的产量。因此,如何找出一条合适的途径来有效的解决橡胶树病害,减少天然橡胶的损失,意义重大。现阶段,由于橡胶树遗传转化体系的不成熟,很大程度上限制了橡胶树功能基因组学工作的深入开展,导致橡胶树分子病理学研究的严重滞后。目前橡胶树病害防治方法主要以化学防治为主,成本高、污染大,容易产生抗药性,需要建立新的橡胶树病害防治策略。随着生物技术被广泛利用,人们提出了橡胶树基因工程抗病育种的新思路。基于此,本研究以巴西橡胶树7-33-97品种为试验材料,利用橡胶树叶片原生质体瞬时表达系统,建立了橡胶树先天免疫反应的检测体系,为橡胶树病理学研究提供技术基础。同时,为了筛选有效的橡胶树抗病关键基因用于抗病基因工程育种,我们利用基于转录组的基因差异表达分析方法,对其中的钙依赖型蛋白激酶（calcium-dependentprotein kinase,CDPK）基因家族进行了克隆和功能分析,主要实验结果如下:1.利用原生质体瞬时表达系统研究橡胶树先天免疫反应的结果:（1）通过半定量（RT-PCR）技术和双荧光素酶报告系统检测发现,植物先天免疫反应诱导物flg22和chitin能够改变橡胶树防卫反应相关基因的表达:flg22处理后,HbPR1、HbPR5基因表达明显上调;chitin处理后,HbPR5基因表达明显上调,HbPR1基因表达无变化,而两种PAMPs处理后对HbMAPK3和HbMAPK6基因表达并无影响。这些结果说明HbPR1、HbPR5基因参与了橡胶树PTI免疫途径,但参与的具体信号途径并不相同。（2）flg22和chitin影响橡胶树体细胞中MAPKs的活性激活:flg22能诱导橡胶树细胞内MAPK发生自我磷酸化,但没有检测到chitin对橡胶树细胞内MAPKs自我磷酸化。说明flg22能够通过自我磷酸化作用激活MAPKs的活性。（3）flg22和chitin均能引起橡胶树原生质体细胞内活性氧的积累。（4）flg22和chitin对橡胶树抗氧化酶系统的影响:flg22和chitin均能诱导细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）以及过氧化氢酶（CAT）活性的升高。说明这三种抗氧化酶参与了橡胶树的PTI反应。2.转录组差异基因表达分析筛选橡胶树抗病相关基因的结果:通过RNA-seq技术对SA处理前后橡胶树叶片中基因差异表达谱进行了分析。整体来看,在组装获得的44477个Unigenes中,SA处理能够诱导8125个Unigene的表达发生显着变化,其中上调表达的基因比下调基因要多。此外,为了了解这些差异表达基因（DEGs）的可能生物学功能,我们依据KEGG数据库对这些基因进行了Pathway显着性富集分析。结果显示,在前10个显着富集的pathway中,与植物抗病性直接相关的有次生代谢生物合成途径（biosynthesis of secondary metabolites）,植物激素信号转导途径（plant hormone signal transduction）和植物-病原互作途径（plant-pathogen interaction）。进一步对植物-病原互作途径进行分析,发现相应的DEGs主要参与以下抗病相关反应:（1）与ROS的产生调控的组分,包括上调的APX,CDPKs,CaMCML,NOS和下调的NADPH氧化酶等。（2）参与PTI信号传递途径的组分,包括FLS2,BAK1,MEKK1,MKK1/2,MEKK4/5,WRKY35/33,WRKY22/29等,这些基因均为上调表达,表明SA处理激活了植物的PTI。（3）参与ETI信号传递途径的组分,包括RPM1,RPS2,PBS1,RPS5,MIN7,JAZ等。根据以上分析结果,我们选取了 CDPK基因家族作为进一步研究的候选基因。3.橡胶树CDPK基因家族的克隆和表达分析结果:（1）本研究通过生物信息学分析获得了 31个橡胶树CDPK基因家族成员,分别命名为HbCDPK1-31,其中获得克隆的有28个,HbCDPK19、HbCDPK21和HbCDPK30未能扩增出cDNA全长。（2）将测序正确的28个HbCDPK基因进行进化树分析发现,HbCDPK基因家族可分为四个 Subgroups,我们将HbCDPK5、9、10、15、17、20、22、27、28、31统一划分为 Subgroup Ⅰ,HbCDPK1、6、8、11、12、14、16、23 统一划分为 SubgroupⅡ,HbCDPK2、3、4、7、13、18、24、26、29统一划分为 Subgroup Ⅲ,而 SubgroupⅣ只包含HbCDPK25。（3）不同病原菌（炭疽病菌和白粉病菌）接种橡胶树叶片后,利用qPCR技术检测HbCDPK基因家族的应答反应,数据表明,炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）接种后,HbCDPK1、4、8、13、11、15、18、20、29 表达上调,HbCDPK6、13、24表达下调,其余基因的表达量无明显变化;而在白粉病菌（Odium heveae Steinm）接种后,HbCDPK2、3、6、7、10、14、22、23、26 表达上调,HbCDPK18、29表达下调,其余基因的表达量无明显变化。（4）不同激素信号分子（SA、JA、ET、ABA、GA）刺激处理橡胶树叶片后,利用qPCR技术检测HbCDPK基因家族的应答反应,数据表明,在对SA的应答中,HbCDPK1、2、7、9、15、20、23、26、28、31 表达上调 HbCDPK4、14、24、29表达有所下调,而其余基因表达量无明显变化;在对JA的应答中,HbCDPK1、6、8、12、15、18、23、27、29表达上调,HbCDPK2、10、17、25表达下调,其余基因表达量无明显变化;在对ET的应答中,HbCDPK24表达上调,而HbCDPK25在6h表达上调随后表达明显下调,其余基因表达量无明显变化;在对ABA的应答中,HbCDPK3、5、8、12、16、18、20、22表达上调,HbCDPK14、25、31 表达下调,其余基因表达量无明显变化;在对GA的应答中,HbCDPK10、14、17、20、27表达上调,HbCDPK3、24表达下调,其余基因表达量无明显变化。这些结果说明橡胶树不同的CDPK基因家族成员可能通过不同的信号转导途径去发挥不同的作用,但不同成员之间存在信号转导的交叉和重叠。（5）利用橡胶树原生质体瞬时表达系统对已经获得克隆的28个HbCDPK蛋白进行了亚细胞定位分析,通过激光共聚焦显微镜观察蛋白亚细胞定位情况,结果显示,HbCDPK1、6、8、9、12、16、18、23、25、27 蛋白定位于细胞膜上;HbCDPK2、3、4、5、7、10、11、13、14、15、17、20、22、24、26、28、29、31 蛋白定位于细胞质或细胞器中,但具体是定位于哪一细胞组分还需进一步鉴定。（6）利用橡胶树原生质体瞬时表达系统检测了 28个HbCDPK基因过表达后原生质体细胞内活性氧的积累情况,结果表明,HbCDPK3、8、9、10、15、18、20、23、26、29的表达能够明显引起引起橡胶树细胞内活性氧的积累。4.HbCDPK1 的功能分析结果:（1）测序结果表明,HbCDPK15基因编码区长度为1686bp,是一个完整性的开放性阅读框,编码561个氨基酸的多肽。HbCDPK15蛋白分子量为62.8 KD,等电点为5.62,含有STKcCAMK结构域和四个EF-hand钙离子结合结构域。通过同源性比对发现HbCDPK15与拟南芥中AtCPK6的同源性最高。（2）为了了解HbCDPK15的生物学功能,我们构建了HbCDPK15转拟南芥cpk6突变体的植株35s:HbCDPK15/cpk6。通过灰霉病菌（Botrytiscinerea）、链格孢菌（Alternaria alternata）以及Pseudomonou springae vs tomato.DC3000 接种实验,我们发现,拟南芥cpk6对灰霉菌的抗性明显低于野生型Col-0和35s:HbCDPK15/cpk6对灰霉菌的抗性与Co1-0相当,说明HbCDPK15能够互补拟南芥CPK6在对灰霉病菌抗性中的作用。三者对链格孢菌（Alternaria altenata）和Pseudomonous springae vs tomato.DC3000的抗性无明显差异。同时我们发现,在盐胁迫下,35s:HbCDPK15/cpk6的种子萌发率与Col-0相当,但明显高于cpk6植株的种子,三者的幼苗根长无明显区别,说明HbCDPK15可能只参与了盐胁迫下种子的萌发过程,并与盐胁迫下植株的生长关系不大;ABA处理和低温胁迫下,Col-0,cpk6 和35s:HbCDPK15/cpk6的萌发和幼苗生长没有表现明显差异,说明HbCDPK15与ABA和低温胁迫没有明显相关性,这与ABA处理下HbCDPK15的表达模式一致。（3）Co-IP实验结果表明,HbCDPK15可以与HbRboh D发生互作,说明HbCDPK15可能通过激活HbRboh D来促进细胞内活性氧的积累。
张骕[6]（2018）在《豇豆拮抗内生细菌的筛选、鉴定及抗菌活性的测定》文中研究指明为明确从海南多个地方采集的由豇豆叶片分离出的20株生防内生菌的生理生化性质及其潜在生防价值。本实验利用形态学、平板对峙、PCR技术、生物信息学等方法对20株生防细菌进行鉴定研究。首先,经过革兰氏染色得知其中2、16、19号三株菌为革兰氏阴性菌株,其余为阳性菌;通过解淀粉测定得知,2、16、19三株菌株没有形成不变色透明圈,无解淀粉功能,其余中间形成明显的透明圈,有解淀粉功能;经过V-P测定,发现1、2、11、15、16、18号共6株菌株呈阴性,其余呈阳性;在MR甲基红测定中,1、6、7、10、11号共5株菌株测定呈阳性,其余呈阴性;由氧化酶测定可知2、16、17、19号4株菌株氧化酶测定为阳性,其余为阴性;由接触酶测定得知20株细菌均为阳性。之后提取所有菌株16srDNA,并测序然后上传比对,结果显示,20株内生细菌有3株为假单胞菌属细菌（Pseudomonasspp.）,17株为芽孢杆菌属细菌（Bacillus）,其中,12株可能为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、5株最相似结果为解淀粉芽孢杆菌（Bacilus amyloliquefaciens）。在之后的平板对峙试验中,以4株病原真菌为靶标病菌,测定20株生防菌对病原真菌的抑制效果,20株生防细菌对4株供试的植物病原真菌均产生了拮抗作用,其抑菌率为29.58%-80.28%,其中抑菌率最高的是18号菌株枯草芽孢杆菌对真菌B橡胶炭疽病菌（C.gloeosporioides）,抑菌率为80.28%效果最差的为是2号细菌对真菌A芒果炭疽病菌（C.gloeosporioides）,抑菌率为29.58%。不同菌株之间抑制效果差异较大,部分菌株具有良好的抑制效果,我们测定其中生防效果相对较好的7号菌株正丁醇粗提物的最小抑菌浓度（MIC）。接下来,我们通过pcr技术对20株菌中与细菌抑菌活性相关的两个基因sfp和lpa进行了检测,发现全部17株芽孢杆菌属的细菌都有着两个基因,之后又进行了基因序列分析和蛋白结构的预测,为后续生防机理的深入探究和生物药剂的开发奠定了一定的理论基础。
吴华[7]（2018）在《中国区橡胶树白粉菌分类进化与遗传多样性研究》文中认为橡胶树白粉病是橡胶树一种重要的叶部病害,它是世界各地植胶区最重要的病害之一。橡胶树白粉病的病原菌初次被定名为Oidium heveae,近来一些研究认为应该将其重新分类至Erysiphe、Golovinomyces或Podosphaera。目前还没有中国区橡胶树白粉菌的确切分类及遗传多样性的研究,为此,我们开展了对中国橡胶树主要种植区橡胶树白粉菌较为系统的调查与研究,我们更进一步分析了橡胶树白粉病叶际微生物群落结构和多样性,以期为更好理解白粉菌生物进化以及建立白粉病生态防控新策略提供科学的参考依据。本研究采用形态学结合分子鉴定的方式以及筛选DNA条形码2种方法进行了分类研究,并采用单倍型鉴定、DNA条形码多基因序列分析、RFLP-PCR和ISSR-PCR分子标记体系对橡胶树白粉菌进行了遗传多样性研究,同时采用高通量测序技术对不同地区感染白粉菌的橡胶树叶际微生物群落结构和多样性进行调查。具体研究结果如下:1.2013-2017年,在中国主要植胶区海南、云南和广东不同生态区划（地区）的18个采样点定时采集了 57份橡胶树白粉菌样品,利用光学显微镜和扫描电子显微镜进行显微形态观察、致病性鉴定、分子鉴定和单倍型鉴定。供试菌株采自不同地理位置、不同寄主品种、不同寄主物候期,它们在分生孢子大小上存在差异,但它们的基因型是相似的,分子系统发育分析显示所有供试菌株与Erys quercicola处于同一进化分支;ITS与28S多序列比对分析显示了不同菌株间碱基的缺失与突变;单倍型分析表明,中国区橡胶树白粉菌与其他几个国家或地区的橡胶树白粉菌之间亲缘关系很近,并且有非常丰富的单倍型多样性。结果表明,供试的中国区橡胶树白粉病病原菌均属于Erysiphe quercicola。2.以橡胶树白粉菌和其他寄主植物上的白粉菌为材料,设计并筛选DNA条形码备选基因引物,初步评价出7个DNA条形码备选片段ITS、28S、18S、Rpb4、TUB、2、GAPDH及CUT。对7个DNA条形码备选片段从扩增成功率和测序成功率、序列变异特征、种内种间遗传距离以及NJ树重建等几个方面进行了系统的评价。结果表明,ITS、28S、Rpb4和CUT序列对白粉菌属部分种具有较强的物种鉴别力,适宜作为白粉菌属（橡胶树白粉菌）快速分类鉴定的DNA条形码,并利用多基因序列对橡胶树白粉菌的起源进行了分析,推测它起源于约4800万年前。3.构建了 RFLP分子标记体系,对海南和云南不同地区筛选出的18个橡胶树白粉菌纯化菌株进行IGS和28S序列扩增,应用限制性内切酶Aus I、Msp I、Hinp1 I对扩增产物进行酶切,电泳后产生多样性丰富的带型图谱,成为菌株特有的DNA指纹。数据分析显示各菌株之间的遗传相似系数变化幅度为0.54-0.88,以遗传相似系数0.67为阈值,将供试菌株分为4个类群:HN-401、HN-402聚为第Ⅰ类;HN-403、HN-504、HN-204、HO-73、YN-201、YN-206、YN-202、YN-203 聚为第 Ⅱ类;HN-404、HN-405、HN-408、HN-501、YN-205、HN-506、HN-507 聚为第 Ⅲ类;HN-502单独为第Ⅳ类。初步确定不同地区的橡胶树白粉菌的遗传多样性与寄主品种、寄主物候期及菌株的地理来源无明显的直接关系。4.构建了 ISSR分子标记体系,对海南和云南不同地区4个橡胶树白粉菌种群的15个纯化菌株进行遗传多样性及亲缘关系分析。21条ISSR引物中成功筛选出8条扩增条带清晰、稳定且多态性好的引物,15个菌株共扩增出145个位点,平均每条引物扩增位点18.1个,多态性比率达到100%。4个种群的Nei’基因多样性指数为0.1629-0.1944,Shannon指数为0.2447-0.3402,种群之间产生了较大的遗传变异（Gst=0.3194,Nm=1.0655）。AMOVA分子差异分析表明海南和云南橡胶树白粉菌种群内遗传分化程度高,种群间和种群内的遗传变异分别为15%和85%。种群间的遗传相似系数为0.7739-0.9381,以0.90作为最低遗传相似系数,将4个种群分为3大类:HN-2和YN-1为一类,YN-2为一类,HN-1为一类。橡胶树白粉菌遗传多样性较高,种群间亲缘关系与地理位置和环境因素不直接相关。5.采集海南儋州（DZ）、白沙（BS）、万宁（WN）和五指山（WZS）地区橡胶树白粉病3级发病叶片及健康叶片（0级）作为对照,利用高通量测序技术分析了不同地区橡胶树白粉病叶际细菌的群落结构和多样性。在门级水平,4个地区优势门均为:Cyanobacteria（蓝细菌门）、Proteobacteria（变形菌门）、Actinobacteria（放线菌门）。在属级水平,BS优势属为 Cyanobacteria、Mitochondria和Rhodococcus（红球菌属）,DZ 优势属为 Cyanobacteria、Mitochondria和Curtobacteriu m（短小杆菌属）,WN 优势属为 Cyanobacteria、Pseudomonas（假单胞菌属）和Pantoea（泛菌属）;WZS优势属为 Cyanobacteria、Pantoea和Acidobacteria（酸杆菌门）,其中Cyanobacteria是4个地区共有的优势属。同个地区3级发病叶片与健康叶片的属级群落组成变化不大,只是相对丰度有差异;而不同地区之间的属级群落组成与相对丰度却有显着差异。白粉菌对叶际细菌群落结构影响不大,但对各群落的相对丰度有影响。6.采集海南儋州（DZ）、白沙（BS）、万宁（WN）和五指山（WZS）地区橡胶树白粉病3级发病叶片及健康叶片（0级）作为对照,利用高通量测序技术分析了不同地区橡胶树白粉病叶际真菌的群落结构和多样性。在门级水平,4个地区优势门均为:Ascomycota（子囊菌门）、Fungiunclassified（未知菌）和 Basidiomycota（担子菌门）。在属级水平,4个地区的优势属均包括Erysiphe（白粉菌属）、Cladosporium（枝孢霉属）和Fungiunclassified。在属级水平上,不同地区的真菌群落组成与相对丰度差异显着;而同一地区3级发病叶片与健康叶片属级群落组成相似,但相对丰度有差异。白粉菌对叶际真菌群落结构影响不大,但对各群落相对丰度有影响。
苏慧君[8]（2017）在《橡胶树炭疽菌候选效应蛋白基因Cg4LysM的分离鉴定和初步功能分析》文中指出效应蛋白是病原真菌的主要致病因子之一。目前关于胶孢炭疽病菌LysM型效应蛋白的研究十分有限,本研究在前期研究的基础上克隆了橡胶树胶孢炭疽病菌的一个LysM型效应蛋白编码基因,命名为Cg4LysM,对其功能进行了初步的研究,得到以下结果:本研究通过RT-PCR技术扩增了Cg4LysM基因的cDNA全长序列,测序表明,该基因含1983个碱基对,编码一个660个氨基酸的多肽,由297个极性残基、208个疏水基残基、8个强碱性残基和59个强酸性残基。生物信息学分析结果显示,该蛋白含有4个保守的LysM结构域,,不含任何跨膜结构域,推测为胞外分泌蛋白。同源性比较分析结果发现,该蛋白与草莓胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5）、高粱炭疽病菌（Colletotrichum sublineola）、石膏样小孢子菌（Microsporum gypseum CBS）的LysM蛋白同源,同源性分别为97%、59%、55%。为了研究Cg4LysM基因的功能,我们通过同源重组的方法构建了Cg4LysM基因的敲除突变体（徐文晶等,2015;郭立佳等,2014;）,命名为△Cg4LysM。对△Cg4LysM突变体的表型进行分析,得出以下结果:（1）与野生型菌株相比,△Cg4LysM的菌落形态和孢子形态没有明显变化,但菌落的生长速率降低,孢子产量下降;（2）△Cg4LysM对蔗糖的利用增强;（3）△CgLysM对橡胶树叶片的致病性减弱,但对寄主细胞的机械穿透力没有变化。以上结果表明,胶孢炭疽病菌Cg4LysM基因不仅参与病原真菌的生长发育和能量代谢过程,而且与病菌的致病性相关,但与真菌的机械穿透力无关。
周雪敏[9]（2016）在《橡胶树茎杆溃疡病病原鉴定与防治药剂的室内筛选》文中研究说明橡胶树（Heve a brasiliensis）是我国热带地区重要的经济作物和战略性工业原料作物。2014-2016年,在海南省儋州、白沙、乐东、保亭、昌江和屯昌等地橡胶树上新发生一种茎杆病害。该病害可引起胶树爆皮流胶、回枯,甚至死亡;病情蔓延迅速、爆发性强。本文作者在对该新发病害进行病情调查基础上,采集病样、分离和鉴定该病病原菌,对其进行生物学特性测定及分子检测,及防治药剂室内筛选和大田防效评价,获得以下主要研究结果:2014-2016年,先后5次对我国海南23个植胶农场进行了病害调查,其中有21个农场发现有该病的为害。先后采集样品79份。通过组织分离法对典型病样进行病原分离,获得分离物63个。分离物按形态观察可分为4类:茄类镰刀菌（Fusarium solani）尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、层出镰刀菌（F.proliferatum）和木贼镰刀菌（F.equiseti）,其中F.solani分离率最高为66.6%。通过菌饼离体和活体针刺、菌块皮接和孢子悬浮液活体针刺等4种接种方法进行致病性测定,发现茄类镰刀菌致病力最强,能导致接种部位产生与田间症状一致的病症,并可从接种罗病组织上分离到相同致病菌。结合致病菌rDNA-ITS和延伸因子EF-1a序列分析,鉴定主要致病菌为茄类镰刀菌（Fusarium solani）。同时,依据茄类镰刀菌及其它9种镰刀菌ITS序列,设计一对特异引物（QL-1F/QL-1R）进行病样分子验证。特异引物QL-1F/QL-1R能从田间病样、接种发病组织和茄类镰刀菌基因组DNA上扩增到一条423 bp的特异片段,结合ITS1/ITS4引物扩增,可提高该分子检测的灵敏度。代表性茄类镰刀菌HHNBS01菌株基础生物学特性测定结果发现,该菌菌丝最适培养条件为:PDA培养基、30℃、pH 6、蔗糖为C源和硝酸钾为N源;产孢最适条件为:Czapek培养基、15℃、pH6、完全黑暗、D-木糖为C源和草酸铵为N源;分生孢子在30℃、pH 7、完全光照、葡萄糖或麦芽糖为C源、草酸铵为N源时萌发率最高。F.solani菌丝和分生孢子致死温度均为60 ℃,10 min。13种杀菌剂的室内毒力测定结果表明,咯菌腈对该病菌菌丝生长机制效果最好,ECs0为0.0804 mg/L,其次是多菌灵、咪鲜胺锰盐和氟硅唑。多菌灵和咪鲜胺锰盐有效成分配比为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4的混配剂对菌丝生长的抑制均有增效作用,其中1:4配比下增效最好,SR为2.8885。筛选出来的单剂或复配药剂经推荐给生产部门使用,防效良好。
汪倩[10]（2015）在《橡胶树胶孢炭疽病菌两个候选效应蛋白基因CgBASP2和CgCFEM3的分离鉴定和功能分析》文中研究说明橡胶树炭疽病是橡胶园区的重要真菌病害之一,主要由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起,可以侵染橡胶的叶片、叶柄等,对橡胶产量造成了严重的影响。效应蛋白是病原真菌的主要致病因子之一,但关于胶孢炭疽菌效应蛋白的研究十分有限。在前期的研究中,本实验室对橡胶树胶孢炭疽病菌进行了基因组序列测定并对其分泌蛋白组进行了预测。本研究在此基础上,选择其中两个编号为GME3318g和GME12162g的候选效应蛋白基因进行分离鉴定和功能分析,取得以下主要结果：1.通过RT-PCR的方法克隆了编号为GME3318g基因的开放阅读框。生物信息学分析结果表明,该基因的开放阅读框为300bp,编码100个氨基酸多肽,氨基端有一段18个氨基酸的信号肽,不含有任何保守结构域,但含有6个半胱氨酸残基,与Biotrophy-Associated Secreted Protein2高度同源,因此将该基因命名为CgBASP2。氨基酸序列比对结果表明,CgBASP2与草莓胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5）、西瓜炭疽菌（Colletotrichum orbiculare MAFF）、玉米炭疽菌（Colletotrichum graminicola）-.菜豆炭疽菌（Colletotrichum higginsiaum）和稻瘟菌（Magnaporthe oryzae70-15）的BASP2同源,同源性分别为100%、90%、87%、87%和67%。为了研究CgBASP2基因的功能,通过同源重组技术构建了橡胶树胶孢炭疽病菌CgBASP2基因的敲除突变株ΔCgBASP2。分析发现,与野生型菌株相比该ΔCgBASP2突变株生长缓慢、气生菌丝减少、无分生孢子,对麦芽糖和半乳糖利用率较高。致病性分析表明,ACgBASP2突变株丧失了对橡胶树叶片的致病性。进一步分析表明,该敲除突变株菌丝的机械穿透力丧失,纤维素酶和果胶酶活力、对氧化胁迫的耐受力均明显低于野生型菌株,这些可能是造成该突变株致病力丧失的部分原因。此外,ΔCgBASP2突变株在菌丝体尖端没有过氧化物的积累,除过氧化物以外其它活性氧的分布与野生型不同,主要集中于菌丝体的囊泡中。以上结果表明,CgBASP2基因是调节胶孢炭疽病菌菌丝生长、孢子发育和致病性的重要因子。2.通过RT-PCR的方法克隆了编号为GME12162g的候选效应蛋白基因。生物信息学分析结果表明,该基因的开放阅读框为384bp,编码127个氨基酸多肽,含有一段27个氨基酸的信号肽,8个半胱氨酸残基和一个CFEM超家族保守结构域,因此将其命名为CgCFEM3.氨基酸序列对比结果表明,CgCFEM3草莓胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Nara gc5）)、西瓜炭疽菌（Colletotrichum orbiculare MAFF）、玉米炭疽菌（Colletotrichum graminicola）和菜豆炭疽菌（Colletotrichum higginsiaum）的CFEM3同源,同源性分别为100%、85%、80%和80%。通过检测表达CgCFEM3-GUS融合蛋白培养液中的GUS活性,证明CgCFEM3为胞外分泌蛋白。生化分析表明CgCFEM3在橡胶树细胞中能够被糖基化修饰。为了研究CgCFEM3基因的功能,通过同源重组技术构建了橡胶树胶孢炭疽病菌CgCFEM3基因敲除突变株ΔCgCFEM3。对ΔCgCFEM3突变株进行分析发现,该突变株气生菌丝和分生孢子的产量均明显少于野生型株系,对麦芽糖、蔗糖和葡萄糖的利用效率明显高于野生型菌株。致病性分析结果表明,ΔCgCFEM3突变株对橡胶树叶片的致病性显着减弱,菌丝体的机械穿透力丧失。菌丝体中活性氧水平检测结果表明,在过氧化物水平和分布上,ΔCgCFEM3突变株和野生型没有明显差异,但ΔCgCFEM3突变株中其它种类活性氧水平高于野生型。以上结果初步表明,CgCFEM3基因编码一个胞外分泌效应蛋白,不仅参与胶孢炭疽病菌菌丝和分生孢子产量调控,而且在胶孢炭疽病菌的致病性中具有重要作用。
二、橡胶树炭疽病病原菌变异的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、橡胶树炭疽病病原菌变异的初步研究（论文提纲范文）
（1）黄麻炭疽菌代表性菌株分离鉴定及应用核心种质的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 文献综述 |
| 1.1 黄麻概述 |
| 1.2 黄麻炭疽病研究概况 |
| 1.2.1 黄麻的主要病害 |
| 1.2.2 黄麻炭疽病的发病特征 |
| 1.2.3 黄麻炭疽病病原菌分类及其鉴定 |
| 1.2.4 黄麻炭疽病的防治方法 |
| 1.3 黄麻种质资源研究进展 |
| 1.4 分子标记及其在指纹图谱中的应用 |
| 1.4.1 分子标记类型 |
| 1.4.2 利用SSR分子标记构建作物DNA分子身份证 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 2 黄麻炭疽病病原菌分离鉴定及代表性菌株致病力测定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 供试菌株 |
| 2.2.2 实验试剂及设备 |
| 2.2.3 培养基 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 黄麻炭疽病的田间病害症状观察与病斑采集 |
| 2.3.2 黄麻炭疽病病原菌的分离与纯化 |
| 2.3.3 黄麻炭疽病病原菌的分子生物学鉴定 |
| 2.3.4 代表性炭疽病病原菌的柯赫氏法则 |
| 2.3.5 代表性炭疽病病原菌的致病力测定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 黄麻炭疽病的田间病害症状 |
| 2.4.2 黄麻炭疽病病原菌r DNA-ITS、LSU序列分析 |
| 2.4.3 黄麻炭疽病病原菌11个代表性菌株的柯赫氏法则 |
| 2.4.4 黄麻炭疽菌11个代表性菌株致病力测定 |
| 2.5 讨论 |
| 3 黄麻种质抗性鉴定及应用核心种质的构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 强致病力菌株GX19田间接种黄麻种质资源 |
| 3.3.2 黄麻应用核心种质的性状考察 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 黄麻种质资源性状基本统计分析 |
| 3.4.2 黄麻抗炭疽病种质筛选 |
| 3.4.3 黄麻应用核心种质的构建 |
| 3.5 讨论 |
| 4 黄麻应用核心种质SSR荧光标记分子身份证 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 供试材料 |
| 4.2.2 实验试剂及设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 DNA的提取 |
| 4.3.2 SSR荧光标记 |
| 4.3.3 荧光核心引物筛选及数据处理 |
| 4.3.4 DNA分子身份证构建 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 黄麻SSR荧光核心引物的确定 |
| 4.4.2 基于荧光SSR的应用核心种质遗传多样性 |
| 4.4.3 应用核心种质DNA分子身份证编码及构建 |
| 4.5 讨论 |
| 5 研究结论与展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（2）海南省橡胶树炭疽病监测及其防治药剂施用技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 天然橡胶产业及其重要叶部病害 |
| 1.2 橡胶树炭疽病及其研究进展 |
| 1.2.1 橡胶树炭疽病的发生与分布 |
| 1.2.2 橡胶树炭疽病的侵染和流行 |
| 1.2.3 橡胶树炭疽菌病原学及其致病机理 |
| 1.2.4 橡胶炭疽病的防治 |
| 1.3 植物炭疽病菌抗药性及其研究进展 |
| 1.3.1 传统的保护性杀菌剂 |
| 1.3.2 苯并咪唑类 |
| 1.3.3 甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂(DMIs) |
| 1.3.4 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂 |
| 1.4 本研究目的与意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 植物材料和样地 |
| 2.1.3 供试培养基 |
| 2.1.4 主要试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 海南省橡胶树炭疽病疫情监测与重要品种(系)室内抗病性评价 |
| 2.2.2 海南省橡胶树新发炭疽病病原菌鉴定及基础生物学特性分析 |
| 2.2.3 喀斯特炭疽菌药剂敏感性测定及抗药性相关基因分析 |
| 2.2.4 橡胶树炭疽病防治药剂“保叶清”微乳剂无人机施用技术熟化 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 海南省橡胶树炭疽病疫情分析 |
| 3.1.1 海南省橡胶树主栽区与主栽品种概况 |
| 3.1.2 炭疽病疫情踏查与监测结果 |
| 3.2 橡胶树重要品种(系)室内抗病性 |
| 3.3 海南省橡胶树新发炭疽病病原菌鉴定及其基础生物学特性 |
| 3.3.1 菌株分离与致病性测定 |
| 3.3.2 形态鉴定结果 |
| 3.3.3 系统发育分析 |
| 3.3.4 基础生物学特性 |
| 3.3.5 致病力测定结果 |
| 3.4 喀斯特炭疽菌药剂敏感性 |
| 3.5 HCkHNQZ1736多菌灵抗药性遗传稳定性及tub2基因突变与抗药性关系 |
| 3.6 橡胶树炭疽病防治药剂“保叶清”微乳剂无人机施用防效分析 |
| 3.6.1 病情与防效统计结果 |
| 3.6.2 防效影响因素分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 海南主栽橡胶品种及其炭疽病疫情联合调查与监测及室内抗病性评价 |
| 4.2 海南省橡胶树新发炭疽病病原鉴定 |
| 4.3 喀斯特炭疽HCkHNQZ1736菌株对苯并咪唑类杀菌剂多菌灵的抗药性 |
| 4.4 橡胶苗圃炭疽病无人机飞防药剂及施用技术 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文及获得的成果 |
| 致谢 |
（3）海南菠萝蜜真菌病害调查、病原鉴定及3种病原真菌生物学特性与室内药剂筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 菠萝蜜概述 |
| 1.2 海南菠萝蜜产业发展现状 |
| 1.3 菠萝蜜病害国内外研究现状 |
| 1.4 炭疽病研究进展 |
| 1.5 可可毛色二孢研究进展 |
| 1.6 弯孢霉研究进展 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 1.8 本研究的技术路线 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试植物样本材料 |
| 2.1.2 供试菌株 |
| 2.1.3 室内毒力测定供试药剂 |
| 2.1.4 供试培养基 |
| 2.1.5 供试药品及试剂 |
| 2.1.6 主要实验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菠萝蜜病害调查和病害样本采集 |
| 2.2.2 病害分级标准及其计算标准 |
| 2.2.3 真菌病原菌的分离纯化 |
| 2.2.4 病原真菌致病性测定 |
| 2.2.5 病原真菌形态学鉴定 |
| 2.2.6 病原真菌分子生物学鉴定 |
| 2.2.7 病原真菌生物学特性研究 |
| 2.2.8 室内毒力测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 海南菠萝蜜真菌性病害调查结果 |
| 3.2 菠萝蜜瓜笄霉果腐病 |
| 3.2.1 田间发病情况 |
| 3.2.2 菠萝蜜瓜笄霉果腐病病原菌 |
| 3.3 菠萝蜜花果软腐病 |
| 3.3.1 田间发病情况 |
| 3.3.2 菠萝蜜花果软腐病病原菌 |
| 3.4 菠萝蜜炭疽病 |
| 3.4.1 田间发病情况 |
| 3.4.2 菠萝蜜炭疸病病原菌致病性测定 |
| 3.4.3 菠萝蜜炭疽病病病原菌形态特征 |
| 3.4.4 菠萝蜜炭疽病多基因系统学分析 |
| 3.4.5 菠萝蜜炭疽病病原菌生物学特性研究 |
| 3.4.6 不同杀菌剂对菠萝蜜炭疽病病原菌室内毒力测定结果 |
| 3.5 菠萝蜜果腐病 |
| 3.5.1 田间发病情况 |
| 3.5.2 菠萝蜜果腐病病原菌致病性测定 |
| 3.5.3 菠萝蜜果腐病病原菌形态学鉴定 |
| 3.5.4 菠萝蜜果腐病病原菌分子鉴定 |
| 3.5.5 菠萝蜜果腐病病原菌生物学特性研究 |
| 3.5.6 不同杀菌剂对菠萝蜜果腐病病原菌室内毒力测定结果 |
| 3.6 菠萝蜜叶斑病 |
| 3.6.1 田间发病情况 |
| 3.6.2 菠萝蜜叶斑病病原菌致病性测定 |
| 3.6.3 菠萝蜜叶斑病病原菌形态学鉴定 |
| 3.6.4 菠萝蜜叶斑病病原菌分子鉴定 |
| 3.6.5 菠萝蜜叶斑病病原菌生物学特性研究 |
| 3.6.6 不同杀菌剂对菠萝蜜叶斑病病原菌室内毒力测定结果 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 菠萝蜜病害病原分离培养和鉴定结论与讨论 |
| 4.1.1 菠萝蜜瓜笄霉果腐病病原分离培养和鉴定 |
| 4.1.2 菠萝蜜花果软腐病病原分离培养和鉴定 |
| 4.1.3 菠萝蜜炭疽病病原分离培养和鉴定 |
| 4.1.4 菠萝蜜果腐病分离培养和鉴定 |
| 4.1.5 菠萝蜜叶斑病分离培养和鉴定 |
| 4.2 菠萝蜜病原菌生物学特性研究结论与讨论 |
| 4.2.1 菠萝蜜炭疽病病原菌生物学特性 |
| 4.2.2 菠萝蜜果腐病病原菌生物学特性研究 |
| 4.2.3 菠萝蜜叶斑病病原菌生物学特性研究 |
| 4.3 杀菌剂对菠萝蜜病原真菌的室内毒力测定结论与讨论 |
| 4.3.1 菠萝蜜炭疽病室内毒力测定 |
| 4.3.2 菠萝蜜果腐病室内毒力测定 |
| 4.3.3 菠萝蜜叶斑病室内毒力测定 |
| 参考文献 |
| 附录一 项目资助和作者简介 |
| 附录二 药剂筛选相关图片 |
| 致谢 |
（4）巴西橡胶树LFG基因在抑制真菌侵染中的负调控功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 负抗病基因的研究进展 |
| 1.1.1 LFG基因的研究进展 |
| 1.1.2 MLO基因的研究进展 |
| 1.2 CRISPR/Cas9技术 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9基本结构及原理特点 |
| 1.2.2 CRISPR技术历史进展 |
| 1.2.3 CRISPR的应用及存在问题 |
| 1.3 橡胶树及橡胶抗病育种 |
| 1.3.1 橡胶及橡胶树的介绍及作用 |
| 1.3.2 我国橡胶树存在的现有问题及措施 |
| 1.3.3 我国橡胶树抗病育种的进展 |
| 1.4 拟南芥及主要病原菌 |
| 1.4.1 拟南芥的选用 |
| 1.4.2 拟南芥主要病原菌 |
| 2 本研究的目的及意义 |
| 3 研究内容 |
| 4 供试材料 |
| 4.1 病原菌菌株 |
| 4.2 植物材料 |
| 4.3 实验仪器 |
| 4.4 实验试剂 |
| 4.5 实验材料配制 |
| 5 实验方法 |
| 5.1 橡胶HbLFG1和HbLFG2的克隆及表达分析 |
| 5.1.1 橡胶树叶片总RNA的提取 |
| 5.1.2 橡胶树叶片RNA的反转录 |
| 5.1.3 HbLFG1和HbLFG2基因的PCR扩增 |
| 5.1.4 PCR产物回收及测序 |
| 5.1.5 生物信息学软件分析 |
| 5.1.6 构建HbLFG1和HbLFG2基因系统发育树分析 |
| 5.1.7 白粉菌侵染时间对HbLFG1和HbLFG2基因的实时荧光定量 |
| 5.1.8 不同病害级数对HbLFG1和HbLFG2基因的实时荧光定量 |
| 5.2 拟南芥突变体的构建 |
| 5.2.1 靶标基因的设计 |
| 5.2.2 基因修饰载体pRD285的构建 |
| 5.2.3 基因修饰载体pRDLFG的构建 |
| 5.2.4 农杆菌EHA105感受态细胞转化及保存 |
| 5.2.5 拟南芥的培养和种子的收取保存 |
| 5.2.6 农杆菌的花序侵染法转化拟南芥 |
| 5.2.7 拟南芥种子消毒灭菌处理及培养: |
| 5.2.8 筛选拟南芥植株的验证 |
| 5.3 突变体LFG拟南芥的回补 |
| 5.3.1 HbLFG1基因表达载体的构建 |
| 5.3.2 农杆菌介导的HbLFG1表达载体的瞬时表达 |
| 5.4 LFG缺失突变体和△AtLFG/HbLFG1的病原菌致病力测定 |
| 5.4.1 辣椒疫霉游动孢子囊的诱导及悬浮液的配置 |
| 5.4.2 接种方法 |
| 5.4.3 病原菌镜检染色 |
| 6 实验结果 |
| 6.1 橡胶HbLFG1和HbLFG2的克隆及表达分析 |
| 6.1.1 橡胶HbLFG1和HbLFG2的基因克隆 |
| 6.1.2 橡胶HbLFG1和HbLFG2的生物信息学分析 |
| 6.1.3 构建HbLFG1和HbLFG2基因系统发育树 |
| 6.1.4 白粉菌侵染时间对HbLFG1和HbLFG2基因的实时荧光定量分析 |
| 6.1.5 不同病害级数对橡胶HbLFG1和HbLFG2基因的实时荧光定量分析 |
| 6.2 拟南芥突变体的构建及感病分析 |
| 6.2.1 AtLFG基因修饰载体pRDLFG的构建 |
| 6.2.2 农杆菌介导转化和筛选 |
| 6.2.3 基因修饰载体转化拟南芥及转化子的筛选验证 |
| 6.3 突变体LFG拟南芥的回补 |
| 6.3.1 HbLFG1基因表达载体的构建 |
| 6.4 LFG缺失突变体和△AtLFG/HbLFG11的病原菌致病力测定 |
| 6.4.1 辣椒疫霉侵染状况 |
| 6.4.2 橡胶树胶孢炭疽菌侵染状况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 1 实验PCR引物 |
| 2 HbLFG同源蛋白 |
| 3 HbLFG1基因的cDNA序列 |
| 4 HbLFG2基因的cDNA序列 |
| 5 野生型AtLFG基因的cDNA序列 |
| 6 个人简介 |
| 致谢 |
（5）橡胶树原生质体PTI检测体系的建立以及橡胶树抗病相关CDPK基因家族的克隆和功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 巴西橡胶树及其病害的防治 |
| 1.2 植物抗病机制 |
| 1.3 激素信号转导途径与植物抗病性 |
| 1.4 活性氧与植物抗病性 |
| 1.4.1 活性氧概述 |
| 1.4.2 活性氧在植物体内产生的机制 |
| 1.4.3 植物体内的活性氧酶促脱毒系统 |
| 1.4.4 活性氧在植物抗性中的作用 |
| 1.5 钙离子信号与植物抗病性 |
| 1.5.1 植物细胞中的钙离子信号 |
| 1.5.2 钙离子信号转导途径在植物抗病中的作用 |
| 1.5.3 钙离子信号“接收器” |
| 1.6 钙依赖蛋白激酶(CDPK)研究进展 |
| 1.6.1 钙依赖性蛋白激酶的结构和活性 |
| 1.6.2 钙依赖性蛋白激酶的表达和定位 |
| 1.6.3 钙依赖性蛋白激酶的生物学功能 |
| 1.7 原生质体瞬时表达系统 |
| 1.8 本研究的目的及意义 |
| 1.9 技术路线 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 药品与试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 橡胶树叶片原生质体的提取 |
| 2.2.2 橡胶树原生质体转化 |
| 2.2.3 橡胶树原生质体总RNA的提取(LiCl沉淀法) |
| 2.2.4 反转录 |
| 2.2.5 RT-PCR检测flg22和chitin处理后橡胶树抗病相关基因的表达 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告系统检测分析 |
| 2.2.7 原生质体细胞内活性氧检测 |
| 2.2.8 原生质体细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性的检测(氮蓝四唑光化还原法) |
| 2.2.9 原生质体细胞内过氧化物酶(POD)活性测定(愈创木酚法) |
| 2.2.10 原生质体细胞内过氧化氢酶(CAT)活性测定 |
| 2.2.11 橡胶树原生质体总蛋白的提取 |
| 2.2.12 western-blot |
| 2.2.13 MAPK激酶活性检测 |
| 2.2.14 RT-PCR扩增HbCDPK基因家族 |
| 2.2.15 HbCDPK基因家族相关载体的构建 |
| 2.2.16 大提质粒 |
| 2.2.17 HbCDPK的亚细胞定位 |
| 2.2.18 胶胞炭疽菌(C.gloeosporiodes)接种橡胶树叶片 |
| 2.2.19 白粉病菌(O.heveae steinm)接种橡胶树叶片 |
| 2.2.20 不同外源激素处理橡胶树叶片 |
| 2.2.21 qPCR检测HbCDPK基因家族对不同病原菌以及激素处理的应答 |
| 2.2.22 HbCDPK对活性氧积累的影响 |
| 2.2.23 免疫共沉淀(Co-IP)分析 |
| 2.2.24 农杆菌转化拟南芥 |
| 2.2.25 灰霉病菌(B.cinerea)接种拟南芥叶片 |
| 2.2.26 链格孢菌(A.alternaria)接种拟南芥叶片 |
| 2.2.27 Pst.DC3000接种拟南芥叶片 |
| 2.2.28 拟南芥种子的萌发和幼苗生长实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 利用橡胶树原生质体瞬时表达系统研究橡胶树先天免疫反应 |
| 3.1.1 flg22和chitin对橡胶树防卫反应相关基因表达的影响 |
| 3.1.2 双荧光素酶报告系统检测flg22和chitin对橡胶树PR基因表达的影响 |
| 3.1.3 flg22和chitin处理橡胶树原生质体对HbMAPKs磷酸化的影响 |
| 3.1.4 flg22和chitin处理对橡胶树原生质体活性氧水平的影响 |
| 3.1.5 flg22和chitin处理橡胶树原生质体对细胞内抗氧化酶活性的影响 |
| 3.2 橡胶树抗病相关基因的筛选和分离 |
| 3.2.1 差异表达基因(DEGs)的筛选 |
| 3.2.2 差异表达基因的GO功能分析 |
| 3.2.3 差异表达基因的KEGG分析 |
| 3.3 橡胶树CDPK基因家族的克隆鉴定及表达分析 |
| 3.3.1 橡胶树叶片总RNA的提取 |
| 3.3.2 HbCDPK基因家族的克隆 |
| 3.3.3 HbCDPK基因家族进化树分析 |
| 3.3.4 qPCR检测橡胶树CDPK基因对不同病原菌接种的应答 |
| 3.3.5 qPCR检测橡胶树CDPK基因对不同激素处理的应答 |
| 3.3.6 HbCDPK基因家族在橡胶树中的亚细胞定位 |
| 3.3.7 HbCDPK对橡胶树细胞内活性氧水平的影响 |
| 3.4 橡胶树HbCDPK15基因的功能研究 |
| 3.4.1 HbCDPK15的生物信息学分析 |
| 3.4.2 转HbCDPK15基因拟南芥株系的获得和功能性分析 |
| 3.4.3 HbCDPK15与HbRboh D互作的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 利用橡胶树原生质体瞬时表达系统研究橡胶树先天免疫反应 |
| 4.2 橡胶树抗病相关CDPK基因家族的克隆及功能鉴定 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）豇豆拮抗内生细菌的筛选、鉴定及抗菌活性的测定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 豇豆 |
| 1.1.1 豇豆简介 |
| 1.1.2 海南豇豆的种植情况 |
| 1.2 生物防治 |
| 1.2.1 生物防治的定义 |
| 1.2.2 生物防治的意义 |
| 1.2.3 植物病害的生物防治 |
| 1.3 生防菌防治植物病害的现状和种类 |
| 1.3.1 生防菌防治植物病害的现状 |
| 1.3.2 生防菌的种类 |
| 1.4 目前主要用于防治植物病害的生防细菌及其作用 |
| 1.4.1 假单胞菌属 |
| 1.4.2 芽孢杆菌属 |
| 1.5 传统的分类鉴定和分子生物学分类鉴定 |
| 1.5.1 传统的微生物分类鉴定 |
| 1.5.2 分子生物学分类鉴定 |
| 1.6 生防菌的非核糖体途径作用机制 |
| 1.6.1 脂肽类抑菌物质 |
| 1.7 本文研究的内容与意义 |
| 1.7.1 本文研究的内容 |
| 1.7.2 本文研究的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株的采集与分离纯化 |
| 2.1.2 供试真菌 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 试剂及仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 内生细菌的鉴定 |
| 2.2.2 内生菌的16s rDNA鉴定 |
| 2.2.3 20株内生细菌对4种病原真菌抑菌作用测定 |
| 2.2.4 第7号菌株正丁醇粗提物的提取以及其最小抑菌浓度(MIC)的测定 |
| 2.2.5 lpa和sfp基因的克隆 |
| 2.2.6 数据统计及分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 生理生化测定结果 |
| 3.1.1 革兰氏染色 |
| 3.1.2 V-P测定和MR测定 |
| 3.1.3 淀粉水解 |
| 3.1.4 氧化酶测定 |
| 3.1.5 接触酶测定 |
| 3.2 20株植物内生菌的分子鉴定结果 |
| 3.2.1 DNA的提取 |
| 3.2.2 DNA的PCR扩增以及PCR产物电泳及回收 |
| 3.2.3 转化子的菌落PCR检测 |
| 3.2.4 测序结果的分析 |
| 3.3 20株内生细菌的抑菌作用测定结果 |
| 3.3.1 20株内生菌sfp基因lpa基因的鉴定和多重序列比对 |
| 3.3.2 sfp和lpa基因的开放阅读框 |
| 3.3.3 sfp和lpa基因功能预测 |
| 3.3.4 信号肽切割位点位点的分析 |
| 3.3.5 sfp基因与lpa基因二级结构和三级结构预测 |
| 3.3.6 第7号菌株正丁醇粗提物最小抑菌浓度测定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（7）中国区橡胶树白粉菌分类进化与遗传多样性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 橡胶树白粉病的发生与为害 |
| 1.1.1 橡胶树白粉病的为害 |
| 1.1.2 橡胶树白粉菌的侵染特点及其发病症状 |
| 1.1.3 橡胶树白粉菌的生物学特性 |
| 1.1.4 橡胶树白粉病的传播途径和发病条件 |
| 1.1.5 橡胶树白粉病的防治 |
| 1.2 橡胶树白粉菌分类学研究现状 |
| 1.2.1 白粉菌传统属级分类概述 |
| 1.2.2 白粉菌新属级分类系统 |
| 1.2.3 橡胶树白粉菌的属级分类概述 |
| 1.2.4 国内外白粉菌无性型研究现状 |
| 1.2.5 核酸序列分析在植物病原真菌中的应用 |
| 1.2.6 核糖体DNA的结构及特点 |
| 1.2.7 rDNA序列分析在白粉菌中的应用 |
| 1.3 病原真菌DNA条形码的研究 |
| 1.3.1 病原真菌DNA条形码研究的意义 |
| 1.3.2 条形码技术与传统分类鉴定方法的比较 |
| 1.3.3 DNA条形码的基本流程 |
| 1.3.4 DNA条形码的标准序列要求 |
| 1.3.5 DNA条形码技术在病原真菌分类鉴定中的应用 |
| 1.3.6 DNA条形码技术的前景与展望 |
| 1.4 基于分子标记技术的白粉菌遗传多样性概述 |
| 1.4.1 限制性片段长度多态性(RFLP) |
| 1.4.2 随机扩增多态性(RAPD) |
| 1.4.3 扩增片段长度多态性(AFLP) |
| 1.4.4 简单序列重复(SSR) |
| 1.4.5 简单序列重复区间(ISSR) |
| 1.5 叶际微生物的研究进展 |
| 1.5.1 叶际微生物的生存环境 |
| 1.5.2 叶际微生物的群落组成 |
| 1.5.3 叶际微生物的生态功能 |
| 1.5.4 叶际微生物与外界的互作 |
| 1.6 本研究目的及意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 供试繁殖寄主 |
| 2.1.3 实验仪器和设备 |
| 2.1.4 化学试剂和药品 |
| 2.1.5 供试培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 橡胶树白粉菌发病症状及显微形态观察 |
| 2.2.2 橡胶树白粉菌的致病性鉴定 |
| 2.2.3 橡胶树白粉菌的分离纯化和扩繁 |
| 2.2.4 白粉菌基因组DNA的提取 |
| 2.2.5 DNA纯度检测 |
| 2.2.6 ITS-rDNA及28S-rDNA的PCR扩增 |
| 2.2.7 PCR扩增产物的纯化 |
| 2.2.8 PCR纯化产物的克隆转化 |
| 2.2.9 菌液PCR检测和测序 |
| 2.2.10 序列同源性分析及系统发育分析 |
| 2.2.11 单倍型鉴定 |
| 2.2.12 聚类分析与环境因子的关系 |
| 2.2.13 白粉菌属DNA条形码备选基因的引物设计与筛选 |
| 2.2.14 DNA条形码备选基因的克隆与测序 |
| 2.2.15 DNA条形码备选基因评价与序列分析 |
| 2.2.16 橡胶树白粉菌IGS与28S的PCR扩增 |
| 2.2.17 IGS与28S扩增产物的限制性酶切 |
| 2.2.18 IGS-RFLP与28S-RFLP酶切产物检测 |
| 2.2.19 IGS-RFLP与28S-RFLP数据分析 |
| 2.2.20 橡胶树白粉菌ISSR引物筛选 |
| 2.2.21 橡胶树白粉菌ISSR反应体系的优化 |
| 2.2.22 橡胶树白粉菌ISSR各引物退火温度的优化 |
| 2.2.23 橡胶树白粉菌ISSR-PCR反应程序 |
| 2.2.24 橡胶树白粉菌ISSR数据分析 |
| 2.2.25 橡胶树白粉病叶际微生物DNA提取 |
| 2.2.26 叶际微生物16S与ITS的扩增与测序 |
| 2.2.27 序列数据处理与统计分析 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 橡胶树白粉菌的发病症状及显微形态观察 |
| 3.1.1 橡胶树白粉菌发病症状 |
| 3.1.2 橡胶树白粉菌显微形态观察 |
| 3.1.3 橡胶树白粉菌分生孢子大小统计 |
| 3.2 橡胶树白粉菌的致病性鉴定 |
| 3.3 橡胶树白粉菌rDNA序列分析 |
| 3.3.1 橡胶树白粉菌ITS-rDNA序列分析 |
| 3.3.2 橡胶树白粉菌28S-rDNA序列分析 |
| 3.4 橡胶树白粉菌分子鉴定 |
| 3.5 橡胶树白粉菌rDNA序列的同源性与遗传距离 |
| 3.6 橡胶树白粉菌rDNA系统发育分析 |
| 3.7 rDNA片段的单倍型分析 |
| 3.8 橡胶树白粉菌聚类分析与环境因子的关系 |
| 3.9 备选DNA条形码片段的筛选与评价 |
| 3.10 备选DNA片段的GC含量分析 |
| 3.11 备选DNA片段的条形码分析 |
| 3.12 备选DNA片段的变异特征 |
| 3.13 备选条形码片段的鉴定分析 |
| 3.14 备选片段的同源性与遗传距离 |
| 3.15 备选条形码片段的系统发育分析 |
| 3.16 橡胶树白粉菌多基因系统进化与起源分析 |
| 3.17 RFLP与ISSR分析橡胶树白粉菌DNA的选取 |
| 3.18 橡胶树白粉菌IGS与28S的PCR扩增 |
| 3.19 IGS与28S扩增产物的限制性酶切 |
| 3.20 IGS-RFLP与28S-RFLP聚类分析 |
| 3.21 群体基因型划分与外界环境的相关性 |
| 3.22 橡胶树白粉菌ISSR引物的筛选 |
| 3.23 橡胶树白粉菌ISSR扩增及多态性分析 |
| 3.24 橡胶树白粉菌菌株ISSR聚类分析 |
| 3.25 橡胶树白粉菌菌株主成分分析 |
| 3.26 橡胶树白粉菌种群的遗传多样性 |
| 3.27 橡胶树白粉菌种群的遗传分化 |
| 3.28 橡胶树白粉菌种群的聚类分析 |
| 3.29 橡胶树白粉病叶际细菌群落基本组成和结构 |
| 3.30 橡胶树白粉病叶际细菌的多样性指数分析 |
| 3.31 不同地区样品的PCA分析与NMDS分析 |
| 3.32 不同地区样品叶际细菌类群LEfSe分析 |
| 3.33 OTUs聚类与环境因子相关性分析 |
| 3.34 橡胶树白粉病叶际真菌群落基本组成和结构 |
| 3.35 橡胶树白粉病叶际真菌群的多样性指数分析 |
| 3.36 不同地区样品叶际真菌类群LEfSe分析 |
| 3.37 不同地区样品叶际真菌样本层次聚类树 |
| 3.38 OTUs聚类与环境因子相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 橡胶树白粉菌的分类鉴定 |
| 4.2 白粉菌属DNA条形码筛选与评价 |
| 4.3 橡胶树白粉菌遗传多样性分析 |
| 4.4 橡胶树白粉病叶际微生物群落结构和多样性 |
| 5 结论 |
| 5.1 本研究主要结论 |
| 5.2 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）橡胶树炭疽菌候选效应蛋白基因Cg4LysM的分离鉴定和初步功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 橡胶树简介 |
| 1.2 橡胶树炭疽病 |
| 1.2.1 炭疽病发生情况 |
| 1.2.2 病原学 |
| 1.2.3 生物学特性 |
| 1.3 炭疽菌的侵染 |
| 1.4 真菌效应蛋白的研究进展 |
| 1.4.1 真菌效应蛋白的定义及特点 |
| 1.4.2 真菌效应蛋白的研究进展 |
| 1.5 LysM效应蛋白的研究进展 |
| 1.5.1 LysM型效应蛋白的结构 |
| 1.5.2 LysM效应蛋白的研究进展 |
| 1.6 基因敲除技术的研究进展 |
| 1.7 本研究的目的意义 |
| 1.8 本研究的技术路线 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 植物材料和菌株 |
| 2.2 药品和试剂 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 培养基和试剂配方 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 橡胶树炭疽病菌基因组DNA和总RNA的提取 |
| 3.1.1 基因组DNA提取 |
| 3.1.2 橡胶炭疽病菌总RNA提取 |
| 3.2 Cg4LsyM基因RT-PCR扩增 |
| 3.3 基因序列生物信息学分析 |
| 3.4 Cg4LsyM基因敲除载体的构建 |
| 3.4.1 Cg4LsyM基因上下游同源臂片段的获得 |
| 3.4.2 pCB1532质粒DNA的线性化及回收 |
| 3.4.3 同源臂上游片段与线性化pCB1532质粒酶连和转化 |
| 3.4.4 同源臂下游片段与线性化pCB1532-A质粒酶连和转化 |
| 3.5 pCB1532-ToxA-Cg4LysM-GUS载体的构建 |
| 3.6 敲除载体转化橡胶树炭疽病菌原生质体 |
| 3.6.1 橡胶树胶胞炭疽病菌原生质体的制备(何芬,2014) |
| 3.6.2 敲除载体转化原生质体(汪倩,2015) |
| 3.7 橡胶胶孢炭疽菌Cg4LsyM敲除转化子的鉴定 |
| 3.8 Cg4LsyM敲除转化子表型的观察 |
| 3.8.1 转化子菌落表型的观察和菌落直径的测量 |
| 3.8.2 转化子孢子计数和菌丝的观察 |
| 3.8.3 玻璃纸穿透力分析 |
| 3.8.4 转化子碳源利用分析 |
| 3.9 △Cg4LsyM的致病力分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 候选基因Cg4LysM的扩增 |
| 4.2 橡胶树胶孢炭疽病菌Cg4LysM基因生物信息学分析 |
| 4.3 Cg4LysM基因的敲除载体构建 |
| 4.4 △Cg4LysM敲除突变体的获得 |
| 4.4.1 抗性转化子的获得 |
| 4.4.2 △Cg4LysM敲除突变体的分子鉴定 |
| 4.5 △Cg4LysM敲除突变体菌株的表型观察 |
| 4.5.1 Cg4LysM基因对菌丝生长的影响 |
| 4.5.2 Cg4LysM基因对胶孢炭疽病菌产胞的影响 |
| 4.5.3 △Cg4LysM对碳源的利用 |
| 4.5.4 △Cg4LysM的玻璃纸机械穿透力分析 |
| 4.6 △Cg4LysM对橡胶树叶片的致病性分析 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）橡胶树茎杆溃疡病病原鉴定与防治药剂的室内筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 橡胶树概述 |
| 1.2 橡胶树主要病害及其研究进展 |
| 1.2.1 橡胶树叶部病害 |
| 1.2.2 橡胶树茎杆病害 |
| 1.2.3 橡胶树根部病害 |
| 1.3 镰刀菌侵染引起的茎杆溃疡病(流胶病)研究现状 |
| 1.3.1 镰刀菌引起的茎杆溃疡病 |
| 1.3.2 镰刀菌引起的流胶病 |
| 1.3.3 分子生物学在分子检测方面的应用 |
| 1.3.4 镰刀菌引起的茎杆溃疡病(流胶病)的防治措施 |
| 1.3.5 橡胶树茎杆溃疡病研究现状 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 1.5 主要技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试植物样品 |
| 2.1.2 供试菌株 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 供试杀菌剂 |
| 2.1.5 试剂和仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 橡胶树茎杆溃疡病病原鉴定 |
| 2.2.2 橡胶树茎杆溃疡病防治药剂的室内筛选 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 橡胶树茎杆溃疡病病原鉴定 |
| 3.1.1 病情调查与病样采集 |
| 3.1.2 病原菌分离与纯化 |
| 3.1.3 4类镰刀菌形态学特征 |
| 3.1.4 致病性测定 |
| 3.1.5 分子鉴定 |
| 3.1.6 生物学特性测定 |
| 3.1.7 田间病样检测 |
| 3.2 橡胶树茎杆溃疡病防治药剂筛选 |
| 3.2.1 单剂药剂毒力测定 |
| 3.2.2 两两药剂混配联合毒力测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 橡胶树茎杆溃疡病主要致病菌鉴定 |
| 4.2 橡胶树茎杆溃疡病病原菌生物学特性 |
| 4.3 橡胶树茎杆溃疡病病样分子诊断 |
| 4.4 橡胶树茎杆溃疡病防治药剂筛选 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（10）橡胶树胶孢炭疽病菌两个候选效应蛋白基因CgBASP2和CgCFEM3的分离鉴定和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 橡胶树病害 |
| 1.2 橡胶树炭疽病 |
| 1.2.1 炭疽病发生情况 |
| 1.2.2 病原学 |
| 1.3 炭疽菌的致病机理研究 |
| 1.4 真菌效应蛋白的研究进展 |
| 1.5 BASP(Biotrophy-associated Secreted Proteins)效应蛋白 |
| 1.6 CFEM型效应蛋白 |
| 1.7 丝状真菌基因敲除研究进展 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 1.9 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 植物材料、菌株、质粒、试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 培养基和试剂配方 |
| 2.4 橡胶树炭疽病菌基因组DNA和总RNA的提取 |
| 2.4.1 SDS法提取橡胶树炭疽病菌的基因组DNA |
| 2.4.2 橡胶炭疽病菌总RNA提取 |
| 2.5 橡胶树炭疽病菌CgBASP2和CgCFEM3基因的克隆 |
| 2.6 橡胶树胶孢炭疽病菌CgBASP2和CgCFEM3基因生物信息学分析 |
| 2.7 载体的构建 |
| 2.7.1 CgBASP2和CgCFEM3敲除载体的构建 |
| 2.7.2 CgBASP2互补载体的构建 |
| 2.7.3 CgCFEM3GUS表达载体的构建 |
| 2.7.4 pUC19-35S-CgCFEM3-FLAG载体的构建 |
| 2.8 用氯化铯密度梯度离心的方法大提质粒 |
| 2.9 橡胶树胶孢炭疽病菌原生质体的制备和转化 |
| 2.9.1 橡胶树胶孢炭疽病菌原生质体的制备 |
| 2.9.2 橡胶树胶孢炭疽病菌原生质体转化 |
| 2.10 胶孢炭疽病菌转化子的鉴定 |
| 2.11 转化子菌落表型的观察和菌落直径的测量 |
| 2.12 转化子孢子计数 |
| 2.13 转化子分泌特性分析 |
| 2.14 转化子碳源利用分析 |
| 2.15 橡胶树离体叶片的接种实验 |
| 2.16 转化子机械穿透力分析 |
| 2.16.1 玻璃纸穿透力分析 |
| 2.16.2 洋葱表皮活体穿透力分析 |
| 2.17 转化子纤维素酶活力测定 |
| 2.17.1 粗酶液的提取 |
| 2.17.2 纤维素酶活力测定的原理与方法 |
| 2.17.3 葡萄糖标准曲线的绘制 |
| 2.18 转化子果胶酶活力测定 |
| 2.18.1 粗酶液的提取 |
| 2.18.2 果胶酶活力测定的原理与方法 |
| 2.18.3 半乳糖醛酸标准曲线的绘制 |
| 2.19 转化子抗逆性分析 |
| 2.20 转化子活性氧(ROS)检测 |
| 2.21 CgCFEM3效应蛋白在植物中的表达情况 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CgBASP2基因的结果与分析 |
| 3.1.1 CgBASP2基因扩增及序列分析 |
| 3.1.2 CgBASP2基因的敲除突变体构建与验证 |
| 3.1.3 △CgBASP2互补菌株△CgBASP2+basp2的构建与验证 |
| 3.1.4 △CgBASP2的生物学特性分析 |
| 3.1.5 △CgBASP2的致病力分析 |
| 3.1.6 △CgBASP2菌丝机械穿透力的影响 |
| 3.1.7 △CgBASP2纤维素酶和果胶酶的活力测定 |
| 3.1.8 △CgBASP2对氧化胁迫的抗性分析 |
| 3.1.9 △CgBASP2菌丝体中活性氧(ROS)检测 |
| 3.2 CgCFEM3基因结果与分析 |
| 3.2.1 CgCFEM3基因扩增及序列分析 |
| 3.2.2 CgCFEM3胞外分泌特性分析 |
| 3.2.3 CgCFEM3在橡胶树叶片原生质体中的表达情况分析 |
| 3.2.4 CgCFEM3基因的敲除突变体构建与验证 |
| 3.2.5 △CgCFEM3的生物学特性分析 |
| 3.2.6 △CgCFEM3的致病力分析 |
| 3.2.7 △CgCFEM3机械穿透力分析 |
| 3.2.8 △CgCFEM3对氧化胁迫的抗性分析 |
| 3.2.9 △CgCFEM3菌丝体中活性氧(ROS)检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 炭疽菌CgBASP2基因 |
| 4.2 炭疽菌CgCFEM3基因 |
| 5 结论 |
| 5.1 CgBASP2基因的分离和初步功能分析 |
| 5.2 CgCFEM3基因的分离和初步功能分析 |
| 参考文献 |
| 附录一 本实验所用PCR引物 |
| 附录二 琼脂糖凝胶回收目的片段 |
| 附录三 目的片段连接、质粒转化反应 |
| 附录四 碱裂解法提取质粒 |
| 附录五 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 致谢 |
四、橡胶树炭疽病病原菌变异的初步研究（论文参考文献）
- [1]黄麻炭疽菌代表性菌株分离鉴定及应用核心种质的构建[D]. 郭艳春. 福建农林大学, 2020
- [2]海南省橡胶树炭疽病监测及其防治药剂施用技术研究[D]. 郑行恺. 海南大学, 2019(01)
- [3]海南菠萝蜜真菌病害调查、病原鉴定及3种病原真菌生物学特性与室内药剂筛选[D]. 顾红杰. 海南大学, 2019(06)
- [4]巴西橡胶树LFG基因在抑制真菌侵染中的负调控功能研究[D]. 李书缘. 海南大学, 2019
- [5]橡胶树原生质体PTI检测体系的建立以及橡胶树抗病相关CDPK基因家族的克隆和功能鉴定[D]. 张晓东. 海南大学, 2018(08)
- [6]豇豆拮抗内生细菌的筛选、鉴定及抗菌活性的测定[D]. 张骕. 海南大学, 2018(08)
- [7]中国区橡胶树白粉菌分类进化与遗传多样性研究[D]. 吴华. 海南大学, 2018
- [8]橡胶树炭疽菌候选效应蛋白基因Cg4LysM的分离鉴定和初步功能分析[D]. 苏慧君. 海南大学, 2017(02)
- [9]橡胶树茎杆溃疡病病原鉴定与防治药剂的室内筛选[D]. 周雪敏. 海南大学, 2016(01)
- [10]橡胶树胶孢炭疽病菌两个候选效应蛋白基因CgBASP2和CgCFEM3的分离鉴定和功能分析[D]. 汪倩. 海南大学, 2015(07)