一、用前导蛋白酶缺失的A_(12)-LLV_2株FMDV制备疫苗（论文文献综述）
朱元源[1]（2016）在《外源FLAG插入对猪源口蹄疫病毒O/CHA/90株分子生物学特性及免疫原性的影响》文中研究表明口蹄疫（FMD）是一种高度接触性传染病,主要感染牛、猪、羊及野生动物等70多种偶蹄物种,世界动物卫生组织（OIE）将口蹄疫列为法定通报传染病。在口蹄疫防控中,猪口蹄疫有其特殊性:主要通过直接接触发病动物、病毒污染物等传播,对气源性感染不敏感;临床症状明显,少见亚临床感染;发病猪可以通过呼吸道排出大量病毒;感染毒株有宿主嗜性;产生有效免疫应答需免疫高剂量的抗原;疫苗免疫不能阻断病毒在猪体内的传播,仅可以延缓疫病暴发。世界各国主要对牛口蹄疫展开研究,对猪口蹄疫的研究甚少,这造成我国在猪口蹄疫防控工作中无经验可参考。面对近年来我国严峻的猪口蹄疫疫情,展开对猪口蹄疫各项研究具有必要性和紧迫性。本文构建了猪源口蹄疫病毒O/CHA/90株感染性克隆,在VP1G-H环RGD上游（-4）和下游（+10）位插入外源标记,通过分子生物学、免疫学和生物信息学方法对猪口蹄疫病毒进行了研究,旨在探索重组病毒的致病性、变异性以及免疫原性的变化趋势,寻找能区分口蹄疫感染抗体和免疫抗体的分子标记疫苗候选株,为有效防控该病提供技术支撑。1.外源基因FLAG可以插入在猪源口蹄疫病毒O/CHA/90株VP1G-H环RGD上游（-4）和下游（+10）位口蹄疫病毒G-H环突出于衣壳表面,位于结构蛋白VP1 140-160位,是口蹄疫病毒结构蛋白中最易变的区域,具有一定柔韧性。猪源O/CHA/90株是一株分自中国边境地区发病猪的流行毒株,属于O型口蹄疫Cathay拓扑型,是中国大陆用于制备猪用口蹄疫灭活疫苗的制苗毒株。本研究成功构建了猪源口蹄疫O/CHA/90株全长感染性克隆,并在结构蛋白VP1G-H环的RGD上游（-4）141/142位点、RGD下游（+10）157/158（R/A）位分别插入8个氨基酸（DYKDDDDK）的FLAG标记表位,成功拯救出标记病毒vFLAG-O/CHA/90和vO/CHA/90-FLAG。标记病毒能在BHK-21细胞上能稳定传代、产生CPE,而且病毒毒力、蚀斑形态、复制能力与亲本病毒vO/CHA/90相似。标记病毒对乳鼠致病,在乳鼠上稳定传代,且毒力与亲本病毒相似。外源FLAG标记在传代细胞毒和乳鼠毒能稳定存在。结果表明了 G-H环的灵活性,RGD（-4）和RGD（+10）位允许8个氨基酸外源FLAG基因的插入,且FLAG标记能稳定存在于传代标记病毒中。2.外源基因FLAG的插入不影响病毒RGD基序通过整联蛋白途径侵入BHK-21细胞口蹄疫病毒感染细胞主要依赖于宿主细胞表面的受体,它主要通过三种不同的途径进入细胞完成组装和释放等,包括需要RGD基序的整合素受体途径、不需要RGD基序的硫酸乙酰肝素HS受体途径和不确定的未知途径。用两株标记病毒分别感染BHK-21 细胞和 CHO 系列细胞（CHO-K1、CHO-618、CHO-745 和 CHO-677 细胞）,结果显示标记毒株和亲本毒株都只能在BHK-21细胞上形成蚀斑,而不能在CHO系列细胞上生长;依据插入FLAG位点G-H环上142-157位氨基酸肽段,设计了三段人工合成肽,分别进行肽封闭试验,结果显示两条含RGD的肽可不同程度的抑制病毒侵入BHK-21细胞,而含KGE的对照肽段不能抑制病毒侵入BHK-21细胞,表明标记病毒仍然是通过整联蛋白途径侵入BHK-21细胞的。3.FLAG表位的插入对病毒反应原性和中和反应的影响为了研究FLAG的插入对病毒抗原反应性的影响,采用抗FLAG单克隆抗体和兔抗口蹄疫病毒抗体进行双荧光共聚焦检测,标记病毒感染细胞均与相应的FMDV抗体、FLAG抗体发生反应。结果表明标记病毒能与FMDV抗体及FLAG抗体发生良好反应。为了检测标记病毒中和口蹄疫抗体和FLAG抗体的能力,用亲本毒株O/CHA/90毒株制备的口蹄疫高免血清能完全中和标记病毒,48-72h中和效价（Log10）分别为vFLAG-O/CHA/90 3.08±0.66、vO/CHA/90-FLAG 2.34±0.66、vO/CHA/90 1.77±0.66;但鼠源抗FLAG单克隆抗体仅能明显延缓病毒致BHK-21细胞出现CPE时间,48h后-FLAG单抗处理的标记毒株才出现CPE,48h中和效价（Log10）分别为:vFLAG-O/CHA/90 2.61士0.05、vO/CHA/90-FLAG 2.07±0.04。这可能是鼠源抗FLAG单克隆抗体延缓了病毒的侵入或者延缓病毒进入细胞的复制和致病变特性改变。4.FLAG的插入位置对病毒抗原位点和FLAG位点展示的影响将病毒传代后,经结构蛋白P1区编码核苷酸序列测定比较发现,RGD序列及FLAG序列稳定不变,VP1 83位氨基酸均由E变K,该变异常见于适应于BHK-21细胞的口蹄疫病毒。FLAG标记病毒中,vFLAG-O/CHA/90在VP1和VP3上出现三个氨基酸的特有变化,VP3第54位氨基酸由F变L,VP1第142位氨基酸由N变S、第188位氨基酸由D变G。而vO/CHA/90-FLAG仅VP3第86位氨基酸由M变L。三维立体结构预测显示了 FLAG、G-H 1oop环和RGD基序的空间构象差异,其中vFLAG-O/CHA/90的FLAG 8个氨基酸的空间折叠序列在141-148位充分朝外伸展,得到了充分展示,而v O/CHA/90-FLAG的FLAG序列在158-165位向内弯成小圈。将病毒制备灭活疫苗,免疫9-10周龄、约20g的Ba1b/c小鼠各4只,0天、14天各免疫一次（5μg/只）,28天后采血测口蹄疫和FLAG抗体。结果显示:灭活病毒抗原均产生高水平的口蹄疫抗体,但只有vFLAG-O/CHA/90病毒抗原免疫小鼠产生抗FLAG抗体。可见突变位点虽然不直接与G-H环或FLAG表位发生作用,但通过变异影响了病毒结构的变化和抗原位点的改变,可能影响标记抗原表位的展示和嵌合病毒在体内诱导抗体产生。5.标记毒株对猪的致病力以及免疫应答水平评估用体重为40kg左右的健康易感猪共9头,标记毒株及亲本毒株各3头分别颈部肌肉注射鼠毒液2×105LD50。标记病毒攻毒经肌肉注射后无任何临床症状;亲本毒株O/CHA/90攻毒经肌肉注射后猪发病显着,鼻镜、蹄叉、蹄冠、蹄掌等部位均有不同程度的水泡或破损。猪注射标记毒株后FMDV抗体一直保持低水平,猪注射亲本毒株后FMDV抗体于3天后开始上升,5-6天到达顶峰（Log10=3.15）,之后保持高水平抗体。这说明标记病毒没有很好启发机体的免疫应答,而亲本毒株在猪体内有增殖反应,能有效启动机体的体液免疫应答。将病毒配制灭活疫苗,0天、21天各免疫一次（10 μ g/头）,之后28天用O/CHA/90毒株1000ID50攻毒,连续观察10天。21天采血测FMDV和FLAG抗体。结果表明,标记疫苗在加强免疫或攻毒后10天均产生较高水平的抗FMDV抗体,但仅标记疫苗vFLAG-O/CHA/90产生了不同程度的FLAG抗体,这印证了小鼠免疫实验结果。vFLAG-O/CHA/90对猪不致病,免疫后能产生高水平的FMDV抗体和FLAG抗体,且能通过检测手段区分感染动物和免疫动物,是一株有潜力的标记疫苗候选毒株。综上所述,本研究在古典中国拓扑型O型口蹄疫病毒G-H环的RGD上游（-4）和下游（+10）位分别插入FLAG标记,并成功拯救出标记病毒vFLAG-O/CHA/90和vO/CHA/90-FLAG;FLAG插入能稳定存在于标记病毒细胞和乳鼠传代病毒中、未改变病毒整联蛋白受体感染细胞的特性;标记病毒能与口蹄疫抗体和FLAG抗体反应;标记毒株对猪无致病力,仅vFLAG-O/CHA/90灭活抗原可以诱导小鼠和猪产生抗FLAG表位抗体,该病毒结构蛋白上三个氨基酸发生变异可能有助于FLAG表位的展示和诱导抗体的表达。FLAG标记病毒的拯救为研究者通过FLAG抗原标签的追踪来进一步研究猪源口蹄疫的致病机制和免疫机理提供了一种方法,为开展猪口蹄疫的研究提供了一种思路,同时也为未来FLAG标记疫苗的制备提供了一种可能,将有望解决生产检验中区别自然感染与免疫动物的难题。
仝燕许[2]（2014）在《口蹄疫病毒Asia 1/WX株全长感染性cDNA的构建及其重组病毒的体外拯救》文中研究说明口蹄疫（Foot-and-mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染家养和野生偶蹄类动物而引起的一种急性、热性和高度接触性传染病。该病毒在自然过程中不断进化,存在七种不同血清型（O、A、C、SAT1-3和Asia1）和多个不同的亚型,这使得病毒在宿主嗜性、准种范围、毒力以及抗原性等方面表现出多种表型变异的特征。在中国,Asia1型FMD主要有云南58谱系、新疆03谱系和以及后来成为优势流行毒株的江苏05谱系。2003年,我国在新疆维吾尔自治区分离到Asia1型毒株,其代表株为AKT/03,主要致牛羊发病,未发现有猪感染发病。2005年,我国江苏无锡分离到新的Asia1型毒株,其曾迅速传播引发疫情,研究者发现江苏05谱系能够致猪发病并开始关注这一反常现象。本实验尝试通过对该流行的江苏05谱系毒株基因组测序,并序列比对各Asia1型FMDV以展示猪源和牛源Asia1型FMDV在分子遗传学方面的差异,为研究不同来源的Asia1型FMDV致病机制及分子变异机制奠定基础。反向遗传学技术为研究FMDV创造了产生感染性cDNA分子的工具,其可作为病毒遗传操作的平台,为进一步解析FMDV的生命周期提供了机会,其中构建具有感染性的FMDV基因组cDNA全长成为关键。为了获得FMDV基因组cDNA全长克隆,本实验以江苏05谱系的Asia1型FMDV RNA为模版,使用Oligod（T）18反转录得到第一链cDNA,扩增得到覆盖FMDV基因组ORF的近3’端全长片段（长约7500bp）；用特异性下游引物反转录扩增得到基因组5’端ploy（C）束前后两个片段并将这两个片段融合得到基因组5’端片段（长约710bp）。通过酶切将扩增片段顺次连接至载体pSL1180,获得病毒基因组全长cDNA。体外转录本与脂质体共转染BHK21细胞。连续盲传培养后,可观察到BHK21细胞产生病变。通过反转录聚合酶链式反应、间接荧光免疫和空斑实验等检测方法,结果表明获得了感染性分子克隆。一步生长曲线分析发现,拯救病毒比亲本病毒的TCID50明显低；两者的蚀斑形态无差异。该江苏05谱系FMDV株cDNA全长克隆的成功构建,极大地简化了获得FMDV全长cDNA克隆的过程。获得的感染性cDNA克隆可以作为基因操作的载体,对深入研究安全性好、稳定性高和免疫原性强的基因工程疫苗有很大帮助,同时在DNA水平上对病毒基因组修饰改造进一步研究RNA病毒的相关基因结构或者功能成为可能。
王一平[3]（2013）在《细胞因子对PCV2-Cap蛋白免疫增强作用及Cap与FMDV-Vp1共表达产物免疫原性鉴定》文中指出猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2, PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的主要病原，该病原现已在世界各地广泛流行，给养猪业造成巨大经济损失。PCV2含2个主要的开放阅读框ORF1和ORF2，分别编码与病毒复制相关的蛋白Rep和Rep’以及病毒的结构蛋白Cap。Cap蛋白是PCV2的主要免疫保护性抗原，能诱导动物机体产生针对PCV2的中和抗体和保护性免疫力，是研制PCV2基因工程疫苗的理想靶抗原。研究表明，IFN-γ、IL-2和GM-CSF等细胞因子佐剂对疫苗具有免疫增强作用，可显着增强疫苗的免疫保护效力。本研究采用细胞因子佐剂与PCV2-Cap蛋白组合的策略来研制预防PCV2感染的新型基因工程亚单位疫苗，目的是验证猪源IFN-γ（PoIFN-γ）、IL-2（PoIL-2）和GM-CSF（PoGM-CSF）这3种细胞因子能否增强PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的免疫效力。为鉴定PoIFN-γ对PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的免疫增强作用，以杆状病毒表达系统表达PCV2-Cap蛋白、PoIFN-γ及二者的融合蛋白Cap-PoIFN-γ，制备3种PCV2亚单位疫苗：Cap-PoIFN-γ疫苗、PCV2-Cap+PoIFN-γ疫苗及PCV2-Cap疫苗，并经鼠体免疫攻毒试验鉴定3种亚单位疫苗的免疫保护效力。采用IPMA和阻断ELISA方法分别测定免疫及攻毒后PCV2IPMA抗体和中和抗体滴度，结果表明，与Cap-PoIFN-γ疫苗和PCV2-Cap疫苗对比，PCV2-Cap+PoIFN-γ疫苗能诱导产生更高水平的IPMA抗体和中和抗体滴度。淋巴细胞增殖试验检测结果表明，PCV2-Cap+PoIFN-γ疫苗诱导脾淋巴细胞增殖的能力明显高于Cap-PoIFN-γ疫苗和PCV2-Cap疫苗。攻毒后，PCV2-Cap+PoIFN-γ疫苗免疫组鼠肺脏中PCV2病毒载量明显低于Cap-PoIFN-γ疫苗和PCV2-Cap疫苗免疫组，表明PCV2-Cap+PoIFN-γ疫苗能诱导产生更强的保护性免疫力。本研究证实用PoIFN-γ与PCV2-Cap蛋白混合免疫时，PoIFN-γ能显着增强PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的免疫保护效力。为验证PoIL-2和PoGM-CSF对PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的免疫增强作用，以杆状病毒表达系统表达PoIL-2、PoGM-CSF及PCV2-Cap蛋白与这２种细胞因子的融合蛋白Cap-PoIL-2和Cap-PoGM-CSF，制备5种PCV2亚单位疫苗：Cap-PoIL-2疫苗、PCV2-Cap+PoIL-2疫苗、Cap-PoGM-CSF疫苗、PCV2-Cap+PoGM-CSF疫苗及PCV2-Cap疫苗，并经鼠体免疫攻毒试验鉴定5种亚单位疫苗的免疫保护效力。采用IPMA方法测定免疫及攻毒后PCV2抗体滴度，结果表明，PCV2-Cap+PoIL-2疫苗、Cap-PoGM-CSF疫苗、PCV2-Cap+PoGM-CSF疫苗和PCV2-Cap疫苗诱导产生的IPMA抗体滴度相当，但均显着高于Cap-PoIL-2疫苗。淋巴细胞增殖试验和细胞因子检测结果表明，与Cap-PoIL-2疫苗和PCV2-Cap疫苗对比，PCV2-Cap+PoIL-2疫苗、Cap-PoGM-CSF疫苗和PCV2-Cap+PoGM-CSF疫苗可明显提高鼠脾淋巴细胞的增殖能力，刺激脾淋巴细胞分泌更高水平的IFN-γ和IL-2。攻毒后，PCV2-Cap+PoIL-2疫苗、Cap-PoGM-CSF疫苗和PCV2-Cap+PoGM-CSF疫苗免疫组鼠肺脏中PCV2病毒载量明显低于Cap-PoIL-2疫苗和PCV2-Cap疫苗免疫组，表明这３种疫苗能诱导产生更强的保护性免疫力。本研究证实用PoIL-2或PoGM-CSF与PCV2-Cap蛋白混合免疫或以Cap-PoGM-CSF融合蛋白免疫时，PoIL-2和PoGM-CSF均能明显提高PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗的Th1型免疫应答，从而增强疫苗的免疫保护效力。口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus, FMDV）是感染偶蹄目动物的重要病原，在世界范围内引发急性、热性和高度接触性传染病，给全球养殖业造成巨大经济损失。FMDV包括4种结构蛋白Vp1、Vp2、Vp3和Vp4，其中Vp1蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白，能诱导动物机体产生中和抗体。近年来，我国猪群中PCV2和猪O型FMDV流行十分严重，当前对这2种病毒性疫病的防控主要采用灭活疫苗，但PCV2灭活疫苗存在病毒难培养的现实，FMDV灭活疫苗存在灭活不彻底而散毒的危险。研究表明，利用重组蛋白研制的亚单位疫苗对PCV2和FMDV感染具有良好的免疫效果，因此，研制同时预防这2种病毒性疫病的二联亚单位疫苗具有重要意义。本研究采用杆状病毒表达系统表达PCV2-Cap蛋白、FMDV-Vp1蛋白、Cap-Dual-Vp1双表达产物及Cap-Linker-Vp1融合蛋白，制备4种PCV2与FMDV二联亚单位疫苗：Cap-Dual-Vp1-A疫苗、Cap-Dual-Vp1-B疫苗、Cap-Linker-Vp1疫苗及PCV2-Cap+FMDV-Vp1疫苗，并经鼠体免疫试验证实4种二联苗均可诱导产生较高水平的PCV2特异性抗体和抗FMDV-Vp1抗体，且抗体滴度无明显差异。鉴于PCV2-Cap与FMDV-Vp12种蛋白双表达及融合表达的效率均较低，从生产成本角度考虑，可采用PCV2-Cap蛋白与FMDV-Vp1蛋白混合的策略来研制防控PCV2和FMDV感染的二联亚单位疫苗。本研究为进一步研制PCV2与FMDV二联亚单位疫苗奠定了基础。
陈豪泰[4]（2012）在《口蹄疫基因工程病毒拯救及其舌下免疫研究》文中进行了进一步梳理首先，为明了口蹄疫病毒基因组的结构特征及其变异与结构、功能的关系以及系统发生关系，利用DNAstar和Clustalx程序进行了207个口蹄疫病毒基因组序列的同源性分析、多重排比，口蹄疫病毒基因组ORF大小有所差异，范围为6963-7120nt，编码2320-2339aa的多聚蛋白。核苷酸和氨基酸序列的同源性，7个不同血清型间＞77.6%和＞78.3%，本研究发现了可能和生物学功能相关的新的保守和变异区域，研究口蹄疫病毒RNA的保守性、变异性及其遗传变异对理解FMDV的感染、宿主范围和传播有重要作用。其次，根据口蹄疫病毒基因组序列，利用引物软件设计了覆盖口蹄疫病毒基因组的重叠引物，感染细胞中提取了病毒基因组RNA，采用RT-PCR方法分段分别扩增了基因片段，利用单一酶切位点，分别消化各扩增片段和载体，在体外分别进行构建。然后用人工合成基因法合成一段含有20个C碱基的基因片段，利用两端的限制性内切酶位点，将该基因片段连接成基因组全长cDNA分子。经PCR鉴定及全长cDNA测序，分别扩增出了各基因片段，全基因组序列测定结果也与原来的测序结果一致，证实成功构建了口蹄疫病毒基因组全长cDNA分子，并通过体外反转录的方法，拯救并获得口蹄疫基因工程病毒。再次，为了研究金四氧化三铁纳米粒子作为黏膜分子佐剂是否可以增强口蹄疫灭活疫苗的黏膜免疫应答。通过舌下接种方式，将口蹄疫疫苗和纳米粒子共同免疫小鼠，用ELISA法检测免疫小鼠黏膜部位IgA滴度，检测小鼠淋巴细胞增殖反应水平，通过流式细胞仪检测T细胞内IFN-γ和IL-4的表达量。与单独接种疫苗相比，加入分子佐剂后，可以诱导更高水平的黏膜IgA的表达及分泌，极大的提高了黏膜部位抗原特异性T细胞增殖反应以及淋巴细胞中IL-4的表达量。金四氧化三铁纳米粒子作为分子佐剂，通过舌下免疫后，可以有效增强机体对口蹄疫灭活疫苗的黏膜免疫应答，对于预防口蹄疫病毒的感染和清除体内病毒起到重要的作用。最后，为了探讨壳聚糖对口蹄疫病毒核酸疫苗免疫反应的影响。应用壳聚糖作为口蹄疫核酸疫苗递送载体，采用肌肉注射和舌下免疫Balb/c小鼠，并以肌注不同剂量核酸、灭活疫苗组和生理盐水组作为对照，分别检测不同疫苗免疫后的细胞和体液和局部黏膜免疫水平。肌注壳聚糖疫苗组和舌下壳聚糖疫苗组高的细胞和体液免疫反应，且产生与灭活疫苗相似的细胞免疫应答，RNA疫苗诱导体液免疫的能力更强，舌下壳聚糖疫苗组产生粘膜免疫。上述研究结果表明，壳聚糖具有一定的免疫佐剂效应，为获得更有效的口蹄疫RNA疫苗提供了新策略，但该疫苗的推广应用还有待于对影响疫苗免疫效果的各因素进行后续优化和研究。
张奕强[5]（2012）在《O型口蹄疫病毒纯化及其单克隆抗体的制备》文中研究指明由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV）引起的口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）是一种烈性、急性、热性、高度接触性的传染病。该病能够感染多种偶蹄家畜,使动物生产性能下降,而且还导致疫区畜产品的上市和出口会受限制,给各个国家及地区的动物贸易带来了巨大的经济损失,因此一直受到世界各国的广泛重视。目前,快速准确地诊断以及切实有效的疫苗是防控口蹄疫的关键。因此,开发更为敏感、快速、准确的诊断试剂对口蹄疫的防控具有十分重要的现实意义。由于单抗具有纯度高、特异性强、重复性好等突出特点,可用于开发新型诊断试剂和各项基础研究。本研究旨在建立一株或几株能够稳定分泌针对O型FMDV的单抗的杂交瘤细胞系,为开发新型诊断试剂和基因工程新型疫苗提供实验材料；同时,也为今后进一步研究O型FMDV抗原结构、表位生物学功能等病原学研究奠定基础。通过将保存的鼠毒种毒回归乳鼠复壮,利用细胞培养和病毒增殖的方法获得0型FMDV,然后将获得的FMDV进行灭活处理,再经PEG沉淀并浓缩病毒,三氯乙烯脱脂,最后利用蔗糖密度梯度离心法提纯病毒粒子,再通过SDS-PAGE对提纯后的病毒粒子抗原进行纯度检测,同时利用Western-blot进行抗原性分析,结果显示,通过上述方法获得了纯度较高且抗原性好的O型FMDV的完整病毒粒子抗原利用该抗原通过棋盘滴定法建立间接ELISA,确定该抗原的最佳包被浓度为5.0μg/mL,同时将该抗原通过常规免疫的方式免疫BALB/c小鼠,四次免疫后将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞在PEG1500作用下进行融合,制备杂交瘤细胞。经过间接ELISA筛选和3次单克隆化,获得了1株能分泌抗O型口蹄疫病毒的抗体的单克隆杂交瘤细胞株,并且命名为5F10。并且通过动物体内生产法大量制备了5F10单克隆抗体。对5F10杂交瘤细胞产生的腹水利用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法进行纯化后,经SDS-PAGE发现,抗体裂解为重链和轻链,分子量分别在50.0kD和25.0kD左右；经过间接ELISA对5F10单克隆抗体效价进行测定,其细胞培养上清效价为1:512,腹水效价为1:25600；经间接免疫荧光和间接ELISA特异性检测发现,5F10单克隆抗体不与正常BHK-21细胞发生反应,与A型、C型和Asia Ⅰ型FMDV也不存在型间交叉反应；抗体亚型测定结果显示,5F10单克隆抗体为IgG1亚型。O型FMDV侵染BHK-21细胞初步研究表明,应用单抗5F10通过间接免疫荧光检测,O型FMDV感染细胞2h后才能被检测到,病毒仅存在与细胞胞浆中,并且在感染4h后可发现新生病毒粒子突然大量出现。本研究成功制备了抗O型口蹄疫病毒的单克隆抗体,为今后开发新型诊断试剂和基因工程新型疫苗提供实验材料,也为进一步研究O型FMDV抗原结构、表位生物学功能等病原学研究奠定基础。
孙英军[6]（2012）在《口蹄疫病毒非结构蛋白致免疫应答差异的分析》文中进行了进一步梳理目前商品化的口蹄疫疫苗大多是化学灭活苗，该疫苗在预防和控制乃至根除口蹄疫过程中发挥重要作用。口蹄疫灭活疫苗主要依靠体液免疫发挥作用，细胞免疫和非结构蛋白免疫的作用往往被忽视，同时灭活疫苗也存在免疫持续期短的缺点。众多科研人员认为CD4+T细胞应答在口蹄疫保护性应答中具有重要意义，并且认为免疫持续期的长短与病毒特异性的CD4+T细胞数量有一定的关联。融合口蹄疫病毒非结构蛋白2B基因后可以显着提高腺病毒载体疫苗诱导CD4+和CD8+T淋巴细胞应答的水平。在FMDV非结构蛋白上鉴定的大量的CD4+、CD8+T细胞表位，也进一步证明非结构蛋白在诱导细胞免疫方面具有不可忽视的作用。本研究利用结构蛋白相同，而非结构蛋白不同的毒株，在豚鼠和猪体内进行免疫差异分析，具体如下：（1）在豚鼠体内的免疫应答差异和保护率差异本研究选用反向遗产操作技术构建的与野生型毒株（Mya98/BY/2010）相同P1基因而非结构蛋白和前导蛋白不同的重组病毒（分别命为Re-Mya98/BY/2010和Mya98/BY/2010）作为抗原，选用相同剂量病毒液，经BEI灭活后与4种佐剂乳化制备不同的疫苗作为免疫原免疫豚鼠。利用流式细胞仪检测外周血液中CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群的含量，ELISA方法检测豚鼠血清中抗体应答，在免疫28天时进行攻毒实验。抗原剂量相同的条件下，Re-Mya98/BY/2010和Mya98/BY/2010诱导的抗体应答之间没有显着性差异（P>0.05）。两种抗原均能诱导CD4+和CD8+T细胞应答，CD4+T细胞应答没有显着性差异（P>0.05）。Re-Mya98/BY/2010比Mya98/BY/2010更有效的诱导CD8+T细胞亚群分化。免疫Re-Mya98/BY/2010疫苗的保护率分别达到100%，83.33%，100%和50%，而免疫Mya98/BY/2010疫苗保护率仅为20%，0，17%和25%，结果表明融合了不同的非结构蛋白的重组口蹄疫病毒抗原能够诱导与保护率相关的CD8+T细胞应答。（2）在猪体内的免疫应答差异和保护率差异挑选免疫效果较好的，ISA206佐剂乳化的口蹄疫灭活疫苗进行猪体实验，采用同样的方法监测免疫猪的细胞免疫和体液免疫水平。两种疫苗的攻毒保护率都达到100%。液相阻断ELISA结果表明两种抗原在诱导抗体应答上并无显着差异（P>0.05）。Re-Mya98/BY/2010诱导更多数量CD3+T淋巴细胞分化。第7天，免疫Re-Mya98/BY/2010的实验组CD4+和CD8+T淋巴细胞含量升高，并且显着高于免疫Mya98/BY/2010抗原的实验组（P<0.05）。上述结果表明，完整的非结构蛋白可以增强猪体早期的CD4+和CD8+T细胞应答。（3）差异肽段对猪和牛淋巴细胞刺激差异分析我们合成了非结构蛋白上的28条差异肽段，利用基于CFSE的淋巴细胞增殖实验探讨造成免疫差异的原因。实验发现：Re-Mya98/BY/2010与Mya98/BY/2010前导蛋白上2-11氨基酸和3D上2001-2014位氨基酸具有刺激猪源淋巴细胞增殖的作用，前导蛋白上2-11位氨基酸和3A上1493-1510位氨基酸具有刺激牛源淋巴细胞增殖的作用。位于前导蛋白、3A、3D上的多肽刺激猪源或牛源淋巴细胞增殖的比率与其他多肽具有极显着差异（P<0.05）。用前导蛋白上的2-11的肽段免疫FMDV致敏的猪，发现该多肽都能刺激猪外周血中CD8+T细胞亚群分化。结果表明在两种口蹄疫病毒抗原前导蛋白和3A上可能存在具有差异性的T细胞表位。本实验结果表明，重组的口蹄疫病毒能够诱导较高的体液免疫和细胞免疫，进一步说明非结构蛋白在诱导免疫应答方面具有显着的作用。包含流行毒株衣壳的重组口蹄疫疫苗能诱导保护性免疫应答，具有应用于口蹄疫免疫防控的前景。
司伏生[7]（2011）在《猪戊型肝炎病毒分子流行病学分析及基因3型猪戊型肝炎病毒感染性克隆的构建》文中进行了进一步梳理戊型肝炎（Hepatitis E, HE）以前称非甲-非乙型肝炎,是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）感染引起的一种经粪口途径传播的疾病,呈全球分布。该病属于人畜共患病,对人类健康具有很大的危害,已引起亚洲、非洲等许多发展中国家暴发急性肝炎。研究证实HEV可感染猪、野猪、牛、山羊、绵羊、鹿、灵长类、鸡、犬、贝类、啮齿类等多种动物,在这些动物宿主中以猪的感染率最高,病毒载量最大,而且从中分离到的病毒和人源毒株也有较高的同源性。因此,调查清楚猪群中HEV的存在状况,对防控人戊型肝炎具有重要的公共卫生学意义。1上海地区戊型肝炎病毒分子流行病学研究为了能够准确的了解上海地区戊型肝炎在猪群中的流行情况,从上海郊区的39个猪场中采集1487份粪便样品,通过RT-nPCR（反转录套式PCR）的方法,扩增HEV ORF2的部分片断,通过测序和遗传进化分析来研究病毒的存在状况。试验结果表明,1487份样品中的297份样品为HEV RNA阳性,阳性率20%。297份阳性样品中158份为基因3型阳性,139份为基因4型阳性,分别占总阳性率的10.6%和9.30%,基因3型HEV在感染中占主导优势。各个猪场HEV阳性率在12.1%-36%之间,分型结果显示上海郊区猪场HEV基因型为基因3型和4型,从中选取的12株代表性毒株中8株3型HEV属于3b亚型。4株4型HEV分属于4b、4d和一个新的基因亚型。对不同猪场基因3型和4型HEV的流行情况进行相关性分析后发现,上海郊区猪场基因3型和4型HEV的感染率呈负相关,提示两个基因型在生存和进化过程中可能存在相互竞争的关系。本次调查所关注的3个群体中,2-6月龄的猪群中HEV的感染率最高,为29.7%,其次为1-8周龄的猪群,感染率为6.9%,母猪的感染率仅为3.1%,在调查的群体中为最低。遗传进化分析表明,发现两株新的HEV基因4型亚型病毒株。此外,基因3型HEV在进化树中和一株日本分离株的同源性最高。这说明基因3型HEV在上海分布已经较为广泛,但以前的研究表明,中国境内猪群中只存在基因4型HEV,因此其来源还有待进一步研究。2猪基因3型戊型肝炎病毒上海分离株全基因组序列的测定及遗传进化分析为了进一步分析上海地区猪群中基因3型HEV与人源HEV的关系,本研究采用RT-nPCR方法对前面分子流行病学研究中从猪粪便样品中分离到的一株基因3型HEV（命名为SAAS-JDY5）的全基因组序列进行分片段扩增,并对其5’端和3’端两个末端的序列采用cDNA末端快速扩增技术（Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE）进行扩增、克隆和测序。测序结果表明SAAS-JDY5去除3’端poly（A）尾全长为7225bp,5’-非编码区（NCR）为26bp,3’-NCR为73bp。5’和3’非编码区之间有3个开放阅读框（ORF）,ORF1从27到5135位核苷酸,全长5109bp,编码1702个氨基酸。ORF2从5170-7152位核苷酸,全长1983bp,编码660个氨基酸。ORF3从5159到5500位核苷酸,全长342bp,编码113个氨基酸,此序列已经登陆GenBank,序列号为FJ527832。通过生物学软件,将SAAS-JDY5与其它已报道的88个HEV病毒株核苷酸和氨基酸序列比较后发现,SAAS-JDY5HEV全序列与HEV Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型的同源性在74-87%之间,而与3型HEV的同源性最高为90.8%,其中ORF1与3型HEV核苷酸的同源性为86.1-88.7%,氨基酸同源性为96.3-96.9%；ORF2与3型HEV核苷酸的同源性为88.7-90.8%,氨基酸同源性为97.6-98.9%。ORF3与3型HEV核苷酸的同源性为93.8-98.1%,氨基酸同源性为92.6-98.4%。遗传进化分析表明,核苷酸的进化与基因3型HEV在一个分枝上,表明SAAS-JDY5病毒株为基因3型HEV。本研究首次报道了在中国上海地区分离到的基因3型HEV的全基因组序列。3重组HEV衣壳蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体的制备由于HEV缺乏成熟的细胞培养模型,目前一般采用ORF2编码的蛋白作为表达抗原,以此来检测HEV特异性抗体。本研究选取猪基因3型HEVSAAS-JDY5ORF21141-1842区域（a.a381-614）基因,在构建重组表达载体pET-32a-p234的基础上,成功地表达了SAAS-JDY5株的p234蛋白,通过进一步的研究证实该重组蛋白具有较好的免疫原性,能够与猪源HEV阳性血清发生免疫学反应。用该蛋白免疫新西兰大白兔,获得了较高的抗体效价,为进行下一步的研究奠定了基础。4猪基因3型HEV上海分离株感染性克隆的构建及体外转录活性的研究由于缺乏合适的体外细胞培养系统,影响了HEV的进一步研究。通过反向遗传学手段获得HEV的感染性克隆后,就可在DNA水平上通过突变、缺失、插入等手段来研究HEV的复制、表达、病毒的重组、病毒与宿主的相互作用等,也可进行抗病毒策略研究,还可以构建新的病毒载体。本研究在已知猪HEVSAAS-JDY5株全基因组序列的基础上,根据基因组和克隆载体的酶切位点,将已经克隆到的9段3型猪HEV克隆片段经过一系列的克隆和亚克隆后,构建了含有基因组全长cDNA克隆的pGEM4z-HEV重组质粒。在pGEM4z-HEV质粒中,cDNA克隆的5’端上游引入了T7启动子序列,并且在T7启动子的上游引入了单一酶切位点Xba I,3’端引入单一酶切位点Hind Ⅲ.基因组进行全长测序后发现了14个核苷酸的突变。不改变其中的沉默突变序列以作为遗传标志,对于其中的错义突变运用大引物PCR技术（Megaprimer PCR）进行定点突变修补突变的碱基,最终获得了含有遗传标志的基因3型HEV SAAS-JDY5林基因组全长cDNA的重组质粒pGEM4z-HEV.为了验证所构建感染性克隆的感染性,首先在Huh7细胞中进行了细胞试验。将含有猪基因3型戊型肝炎病毒SAAS-JDY5株全基因组的以T7启动子启动转录的重组质粒pGEM4z-HEV进行体外转录,成功获得纯化的HEV基因组RNA。将其转染Huh7细胞后连续培养6天,对转染的细胞通过RT-nPCR和间接免疫荧光等方法检测,证明病毒蛋白在转染的细胞中成功进行了表达。结果表明所构建的感染性克隆pGEM4z-HEV具有感染性,为下一步的体内试验提供了可行性参考。5基因3型HEV人工感染SD大鼠的初步研究体外转录后的HEV RNA转染Huh7细胞,通过间接免疫荧光试验和RT-nPCR初步检测为阳性后,进行了动物试验。pGEM4z-HEV感染性克隆线性化后作为模板用体外转录试剂盒进行体外转录,转录后的RNA肝内注射SD大鼠（SPF级）,同时设立阴性和阳性对照。所有动物接种后连续观察55天,分别于注射后的0、3、7、14、21、28、35、45、50、55天分别采集大鼠的粪便和血清样品,粪便样品用RT-nPCR检测HEV RNA,血清样品用北京万泰生产的HEV总抗体检测试剂盒检测血清中的抗体,用RT-nPCR检测HEV RNA.检测结果表明大鼠在感染后7天左右在粪便中检测到HEV RNA;感染后14天左右开始出现病毒血症,一直持续到第28天还能在血清中检测到HEV RNA;感染后14天左右血清anti-HEV抗体阳性,而阴性对照中均没检测到HEV RNA和特异性抗体。为了检测是否自然感染的可能,采用两套引物对遗传标志部位进行测序验证,结果证实能够检测到遗传标志。通过本研究证实猪基因3型HEV可以跨种传播给SD大鼠,提示该动物可以作为研究HEV复制及致病机理方面一种理想的动物模型。以上体外体内试验结果证明,含有HEV SAAS-JDY5病毒株基因组全长cDNA的pGEM4z-HEV重组质粒具有感染性。本研究首次在我国构建出了猪HEV基因3型的感染性克隆。综上所述,本研究在充分普查上海市猪群中HEV的流行分布及分析猪群中流行的HEV两个基因型之间相互关系的基础上,对来源于猪粪便中的SAAS-JDY5HEV进行了全基因组序列分析,确定了该地区猪群中流行的HEV的基因型,有利于更深入分析猪源HEV与人源HEV的关系。而且在获得全基因组序列的基础上构建了含有T7启动子的感染性克隆,并通过体外及体内试验证实所获得的转录本具有感染性,成功拯救出了基因3型猪HEV,为HEV的分子生物学研究及基因工程疫苗研究打下基础,填补了国内空白。此外,通过本研究证实了猪基因3型HEV可以经人工感染的方式跨种传播给SD大鼠,提示该动物可以作为研究HEV复制及致病机理方面一种可选的动物模型。
赵清[8]（2011）在《一种T细胞免疫原的设计及表达产物对口蹄疫疫苗的免疫增强作用》文中认为口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病,主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物,被国际动物卫生组织（OIE）列为必须通报的烈性传染病。FMDV是小RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus）的成员,有七个血清型,分别为O、A、C、Asia 1、SAT1、SAT2、SAT3,每个血清型又可产生很多基因亚型,血清型之间无交叉免疫保护作用。由于FMDV型多易变,免疫原性弱,造成疫苗的免疫持续期短,免疫保护效果差。因此,研制高效持久的疫苗成为FMD防制技术研究的一个重要内容。高水平中和抗体的产生需要有T细胞与B细胞的共同参与与协同作用, T细胞表位在抗原呈递细胞内与MHC分子结合并表达在细胞表面供T细胞识别结合,结合了抗原肽-MHC分子复合物的T细胞向B细胞提供协同刺激信号,活化并辅助B细胞分化为浆细胞,最终产生大量特异性中和抗体,因此,细胞免疫对于产生保护性免疫作用重大。基于以上认识,我们设计并原核表达一种T细胞免疫原,试图利用该T细胞免疫原为佐剂,提高现有灭活疫苗的免疫效果,使得现有灭活疫苗的免疫保护效果有一个明显的提高,也为蛋白亚单位疫苗的研制奠定基础。所设计的T细胞免疫原包含FMDV VP1,VP4, 3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1 FMDV两个型VP1蛋白的串联编码基因,表达产物命名为OA-VP1。将上述T细胞免疫原分别与OA-VP1和口蹄疫灭活疫苗按不同剂量组合免疫小鼠,于免疫后不同时间测定各组小鼠的体液与细胞免疫应答情况。采用微量中和试验检测小鼠O型和Asia 1型中和抗体,采用流式细胞检测技术和测定γ-干扰素的水平来分析不同免疫组小鼠细胞免疫的水平。结果显示,与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比,添加TI抗原后灭活疫苗（P<0.01）和OA-VP1免疫组（P<0.05）小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体;且CD4+ T细胞数量显着增多,IFN-γ产生水平显着升高（P<0.01）。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用,是一种很好的免疫增效剂,可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成份,以提高疫苗的免疫效果。
项海涛[9]（2009）在《AsiaⅠ型口蹄疫基因治疗与基因免疫双功能疫苗载体的构建》文中研究指明目前,对于口蹄疫的防制主要采用屠杀、隔离和免疫接种,其中疾病流行前的免疫接种是特异性保护家畜免遭感染的有效途径,但现有疫苗接种动物后都会存在免疫空白期,即诱导免疫动物产生体液和细胞免疫反应,等待有效抗体产生的一段时间。动物如果在这段时间内遭到病毒的入侵往往会引起该病的流行。为探索解决免疫动物在疫苗接种的免疫空白期内发病这一难题,本研究以Asia I江苏株为模板,引入RNA干扰机制,进行了双功能疫苗的探索研究,并取得下述进展:1.对pBudCE4.1载体进行改造,将其CMV启动子替换为U6启动子,成功改造出适合于双功能疫苗研究的双启动子载体pBudCE4.1-U6。2.利用绿色荧光蛋白的表达与沉默表达对载体pBudCE4.1-U6的双启动子分别进行功能效率鉴定,结果表明对载体的改造是成功的,载体pBudCE4.1-U6的两个启动子均能启动目的基因的表达。3.针对Asia I江苏株的3D基因设计3条小RNA干扰片段,并将之与免疫组合基因P12A+3C克隆入双启动子载体pBudCE4.1-U6,成功构建出了3个双功能疫苗质粒。4.双功能疫苗质粒转染靶细胞BHK-21,有延迟细胞病变的作用,说明双功能载体能够转录出siRNA,对病毒的转录复制有一定的抑制效果。5.间接免疫荧光检测结果表明双功能载体能够同时启动口蹄疫免疫基因在BHK-21细胞中的表达。
王海伟[10]（2008）在《口蹄疫病毒Asia1/1/YZ/CHA/06的全基因组序列分析》文中研究说明口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,其病原口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease virus,FMDV）属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员,为单股正链RNA,其基因组RNA全长约8.5kb,可直接作为mRNA,编码并翻译出一个多聚蛋白,然后经过一系列裂解,产生4种结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）和10种非结构蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3B1、3B2、3B3、3C和3D）。根据动物交叉保护和血清学试验,FMDV可分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型共7种血清型,不同血清型间不能交叉免疫保护,给口蹄疫的控制和消灭造成了极大的困难。目前FMD呈世界范围的流行趋势,但其血清型的分布具有一定的地理区域性。我国于1958年在云南保山县首先发现Asia1型FMD,且在之后30多年里该型FMDV的流行仅局限于Asia1/YNBS/58谱系,但2005年以来我国在江苏、甘肃、北京、河南等地爆发了江苏谱系Asia1型FMD（Asia1/JS/CHA/05）,该谱系毒株与Asia1/YNBS/58株相比有较大的遗传偏离,来源于印度1980年流行毒株（Asia1/IND/1980）。该谱系毒株在我国牛群中一经流行,趋势迅猛,造成的损失极为严重,因此积极开展Asia1型FMD江苏谱系毒株的研究,对我国FMD的防控具有重要的意义。FMDV全基因组的测定和组装,为FMDV致病性的研究、以及新型疫苗和诊断技术的研制奠定了基础。本研究对分离到的江苏谱系Asia1型FMDV猪源毒株Asia1/1/YZ/CHA/06进行了测序和全基因组序列分析。同时,根据本实验室已测定的江苏谱系Asia1型FMDV牛源毒株Asia1/YS/CHA/05全基因组序列的基础,利用5’RACE方法从Asia1/YS/CHA/05株细胞传代毒中扩增得到5’末端的真实序列,采用常规RT-PCR技术扩增得到六段相互重叠基因组片段,分别克隆至pOK12低拷贝载体中进行序列测定和克隆拼接,构建了Asia1/YS/CHA/05株全长cDNA。
二、用前导蛋白酶缺失的A_(12)-LLV_2株FMDV制备疫苗（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用前导蛋白酶缺失的A_(12)-LLV_2株FMDV制备疫苗（论文提纲范文）
（1）外源FLAG插入对猪源口蹄疫病毒O/CHA/90株分子生物学特性及免疫原性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 第一章 文献综述 |
| 1 口蹄疫病毒的基本特性 |
| 2 口蹄疫病毒与受体的相互作用 |
| 3 猪口蹄疫病毒的特点 |
| 4 口蹄疫外源标记病毒的研究进展 |
| 4.1 外源标记替换标记病毒 |
| 4.2 外源标记插入标记病毒 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 第二章 猪源口蹄疫病毒O/CHA/90株及标记毒株感染性克隆的构建及病毒拯救 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 猪源口蹄疫病毒O/CHA/90及FLAG标记病毒全长感染性克隆的构建 |
| 1.4 标记毒株感染性克隆的构建 |
| 1.5 毒株的拯救 |
| 1.6 毒株的传代 |
| 1.7 毒株的鉴定 |
| 1.8 毒株的荧光共聚焦鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 猪源口蹄疫病毒O/CHA/90株的全长基因组测序分析 |
| 2.2 标记病毒全长病毒质粒的酶切鉴定 |
| 2.3 标记病毒全长病毒质粒FLAG的插入标签鉴定 |
| 2.4 RNA体外转录结果 |
| 2.5 标记病毒的传代收毒时间 |
| 2.6 病毒的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 第三章 外源FLAG在VP1G-H环的插入对口蹄疫病毒的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞与合成肽 |
| 1.2 CHO细胞感染试验 |
| 1.3 合成肽抑制实验 |
| 1.4 病毒增殖规律的测定 |
| 1.5 中和试验 |
| 1.6 免疫沉淀 |
| 1.7 SDS-PAGE |
| 1.8 western blot |
| 1.9 抗原浓缩 |
| 1.10 口蹄疫抗原含量146S测定 |
| 1.11 病毒对小鼠的免疫原性检测 |
| 1.12 FMDV抗体测定 |
| 1.13 FLAG抗体测定 |
| 1.14 病毒三维结构预测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒的生长曲线 |
| 2.2 病毒在不同细胞系上的生长特性 |
| 2.3 受体结合能力 |
| 2.4 病毒中和抗体的能力 |
| 2.5 病毒的反应原性检测结果 |
| 2.6 病毒对小鼠的免疫原性检测结果 |
| 2.7 病毒的遗传稳定性 |
| 2.8 病毒三维立体结构预测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 第四章 标记毒株对猪的致病性及免疫原性的研究 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 LD50测定 |
| 1.4 猪感染试验 |
| 1.5 临床观察及采集病料 |
| 1.6 荧光定量PCR |
| 1.7 疫苗制备 |
| 1.8 免疫程序 |
| 1.9 FMDV抗体测定 |
| 1.10 FLAG抗体测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乳鼠毒毒力及其遗传变异性 |
| 2.2 标记病毒对猪的毒力 |
| 2.3 临床打分情况 |
| 2.4 病毒在猪体内繁殖变异分析 |
| 2.5 病毒接种猪抗体测定 |
| 2.6 荧光定量PCR结果 |
| 2.7 疫苗免疫后口蹄疫抗体产生水平 |
| 2.8 疫苗免疫后FLAG抗体产生水平 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 第五章 全文总结 致谢 作者简介 |
（2）口蹄疫病毒Asia 1/WX株全长感染性cDNA的构建及其重组病毒的体外拯救（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究背景、目的和意义 |
| 1.2 FMD流行病学 |
| 1.3 FMDV基因组结构与功能 |
| 1.4 FMDV反向遗传学研究与应用 |
| 1.4.1 FMDV反向遗传系统 |
| 1.4.2 FMDV反向遗传学研究 |
| 第二章 Asia 1型口蹄疫病毒全长cDNA克隆的构建与分析 |
| 摘要 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 细胞和毒株 |
| 2.1.2 主要试剂和酶 |
| 2.1.3 试验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 引物 |
| 2.2.2 病毒总RNA的提取 |
| 2.2.3 RT-PCR |
| 2.2.4 病毒全长质粒的构建 |
| 2.2.5 基因组序列结构预测与序列分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 基因组片段的扩增 |
| 2.3.2 病毒全长质粒的构建 |
| 2.3.3 非编码区二级结构预测 |
| 2.3.4 序列分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 口蹄疫病毒Asia 1/WX株感染性克隆的体外拯救 |
| 摘要 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 主要试剂与酶 |
| 3.1.2 质粒、细胞和病毒 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 鉴定引物 |
| 3.2.2 体外转录 |
| 3.2.3 体外转录本的转染 |
| 3.2.4 基因标记分析 |
| 3.2.5 间接免疫荧光检测 |
| 3.2.6 病毒蚀斑试验 |
| 3.2.7 病毒生长曲线 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 体外转录 |
| 3.3.2 转染结果与病毒增殖 |
| 3.3.3 基因标记分析 |
| 3.3.4 间接免疫荧光检测 |
| 3.3.5 蚀斑形成试验 |
| 3.3.6 病毒生长曲线 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）细胞因子对PCV2-Cap蛋白免疫增强作用及Cap与FMDV-Vp1共表达产物免疫原性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 PCV2 病原学 |
| 1.1.1 分类 |
| 1.1.2 理化特性 |
| 1.1.3 基因组结构与功能 |
| 1.2 PCV2 疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 灭活疫苗 |
| 1.2.2 弱毒疫苗 |
| 1.2.3 基因工程疫苗 |
| 1.2.4 展望 |
| 1.3 细胞因子佐剂研究进展 |
| 1.3.1 细胞因子概述 |
| 1.3.2 干扰素 |
| 1.3.3 白细胞介素 |
| 1.3.4 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 |
| 1.4 FMDV 病原学 |
| 1.4.1 分类 |
| 1.4.2 形态结构和理化特性 |
| 1.4.3 基因组结构与功能 |
| 1.5 FMDV 疫苗的研究进展 |
| 1.5.1 灭活疫苗 |
| 1.5.2 弱毒疫苗 |
| 1.5.3 基因工程疫苗 |
| 1.5.4 展望 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 第二章 猪 IFN-γ对 PCV2-Cap 蛋白亚单位疫苗免疫增强作用的研究 |
| 摘要 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 质粒、菌株、细胞和主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 重组杆状病毒的构建 |
| 2.1.4 目的蛋白的表达及鉴定 |
| 2.1.5 三种 PCV2 亚单位疫苗的制备 |
| 2.1.6 鼠体免疫攻毒试验 |
| 2.1.7 血清学试验 |
| 2.1.8 淋巴细胞增殖试验 |
| 2.1.9 PCV2 病毒血症检测 |
| 2.1.10 荧光定量 PCR 检测 PCV2 病毒载量 |
| 2.1.11 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的基因的 PCR 扩增 |
| 2.2.2 重组转移载体的鉴定 |
| 2.2.3 重组杆粒的 PCR 鉴定 |
| 2.2.4 目的蛋白表达的鉴定 |
| 2.2.5 PCV2 特异性体液免疫应答 |
| 2.2.6 PCV2 特异性淋巴细胞增殖反应 |
| 2.2.7 PCV2 病毒血症检测 |
| 2.2.8 PCV2 病毒载量检测 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 猪 IL-2 与猪 GM-CSF 对 PCV2-Cap 蛋白亚单位疫苗免疫增强作用的研究 |
| 摘要 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 质粒、菌株、细胞和主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 重组杆状病毒的构建 |
| 3.1.4 目的蛋白的表达及鉴定 |
| 3.1.5 五种 PCV2 亚单位疫苗的制备 |
| 3.1.6 鼠体免疫攻毒试验 |
| 3.1.7 PCV2 特异性 IPMA 抗体检测 |
| 3.1.8 淋巴细胞增殖试验 |
| 3.1.9 细胞因子检测 |
| 3.1.10 PCV2 病毒血症检测 |
| 3.1.11 PCV2 病毒载量检测 |
| 3.1.12 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组转移载体的鉴定 |
| 3.2.2 重组杆粒的 PCR 鉴定 |
| 3.2.3 目的蛋白表达的 Western blot 鉴定 |
| 3.2.4 PCV2 特异性 IPMA 抗体检测 |
| 3.2.5 PCV2 特异性淋巴细胞增殖反应 |
| 3.2.6 细胞因子检测 |
| 3.2.7 PCV2 病毒血症检测 |
| 3.2.8 PCV2 病毒载量检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 PCV2-Cap 蛋白与 FMDV-Vp1 蛋白共表达及免疫原性鉴定 |
| 摘要 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 质粒、菌株、细胞和主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 重组杆状病毒的构建 |
| 4.1.4 目的蛋白的表达及鉴定 |
| 4.1.5 PCV2 与 FMDV 二联亚单位疫苗的制备 |
| 4.1.6 鼠体免疫试验 |
| 4.1.7 PCV2 特异性 IPMA 抗体检测 |
| 4.1.8 FMDV 特异性抗体检测 |
| 4.1.9 统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 目的基因的 PCR 扩增 |
| 4.2.2 重组转移载体的鉴定 |
| 4.2.3 重组杆粒的 PCR 鉴定 |
| 4.2.4 目的蛋白表达的 Western blot 鉴定 |
| 4.2.5 PCV2 特异性 IPMA 抗体检测 |
| 4.2.6 FMDV 特异性抗体检测 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）口蹄疫基因工程病毒拯救及其舌下免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 口蹄疫病毒及其流行病学 |
| 1.1.1 O 型口蹄疫病毒 |
| 1.1.2 A 型口蹄疫病毒 |
| 1.1.3 亚洲 1 型口蹄疫病毒 |
| 1.1.4 南非 1、2 和 3 型口蹄疫病毒 |
| 1.1.5 C 型口蹄疫病毒 |
| 1.2 口蹄疫准种研究进展 |
| 1.2.1 错配倾向的复制和病毒准种 |
| 1.2.2 错误灾变 |
| 1.2.3 病毒准种、适合度和进化选择 |
| 1.2.4 口蹄疫病毒准种特性 |
| 1.2.5 口蹄疫准种株的量化 |
| 1.2.6 口蹄疫准种的优势株与劣势株 |
| 1.3 口蹄疫疫苗 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 紧急疫苗 |
| 1.3.3 油佐剂疫苗 |
| 1.3.4 氢氧化铝疫苗 |
| 1.3.5 可饲疫苗 |
| 1.3.6 抗原表位疫苗 |
| 1.3.7 核酸疫苗 |
| 1.3.8 合成肽疫苗 |
| 1.3.9 病毒样颗粒疫苗 |
| 1.3.10 病毒载体疫苗 |
| 1.3.11 基因工程病毒灭活疫苗 |
| 1.3.12 弱毒活疫苗 |
| 1.3.13 疫苗佐剂与病毒抑制剂 |
| 1.4 口蹄疫天然免疫 |
| 1.4.1 巨噬细胞（Macrophages，MΦ) |
| 1.4.2 树突状细胞（Dendritic cells，DC) |
| 1.4.3 淋巴细胞（Lymphocytes） |
| 1.4.4 非免疫细胞（non-immunological cells） |
| 1.4.5 干扰素（I interferon type I） |
| 1.4.6 天然免疫反应（Innate immune response） |
| 第二章 口蹄疫病毒基因组的遗传变异分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 口蹄疫基因组序列 |
| 2.2.2 口蹄疫基因组同源性分析 |
| 2.2.3 口蹄疫病毒基因组序列的多重排比和进化关系分析 |
| 2.2.4 口蹄疫病毒基因组的非编码区二级结构预测 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 口蹄疫病毒基因组结构与各组分的大小 |
| 2.3.2 口蹄疫病毒基因组的变异性和保守性 |
| 2.3.3 口蹄疫病毒基因组的进化关系 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 O 型口蹄疫病毒基因组的遗传变异 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 酶及主要试剂 |
| 3.2.2 溶液及其配制 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.2.4 病毒 RNA 的提取 |
| 3.2.5 引物设计 |
| 3.2.6 目的片段扩增 |
| 3.2.7 产物的回收与纯化 |
| 3.2.8 病毒基因组测序 |
| 3.2.9 口蹄疫基因组序列 |
| 3.2.10 口蹄疫基因组同源性分析 |
| 3.2.11 口蹄疫病毒基因组序列的多重排比和进化关系分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 O 型口蹄疫病毒基因组同源性分析 |
| 3.3.2 口蹄疫病毒基因组的进化关系 |
| 2.4 讨论 |
| 第四章 口蹄疫病毒全长构建和拯救 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 生物酶和试剂 |
| 4.2.2 引物设计 |
| 4.2.3 细胞和种毒 |
| 4.2.4 体外转录 RNA 的制备 |
| 4.2.5 转染 BHK-21 细胞 |
| 4.2.6 电子显微镜观察 |
| 4.2.7 PCR 法检测病毒基因组 |
| 4.2.8 间接免疫荧光检测病毒 |
| 4.2.9 病毒蚀斑实验 |
| 4.2.10 乳鼠毒力实验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 体外转录结果 |
| 4.3.2 细胞病变观察 |
| 4.3.3 电镜结果 |
| 4.3.4 PCR 鉴定结果 |
| 4.3.5 免疫荧光检测结果 |
| 4.3.6 蚀斑实验 |
| 4.3.7 乳鼠毒力试验 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 口蹄疫基因工程病毒灭活疫苗舌下免疫研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 病毒、细胞和实验动物 |
| 5.2.2 主要试剂及配制 |
| 5.2.3 病毒培养 |
| 5.2.4 病毒的灭活 |
| 5.2.5 病毒的纯化 |
| 5.2.6 病毒 146S 含量测定 |
| 5.2.7 动物免疫和 ELISA 检测 |
| 5.2.8 病毒中和试验 |
| 5.2.9 淋巴细胞转化试验 |
| 5.2.10 肺脏和肠道洗液的收集 |
| 5.2.11 肺脏和肠道中 IgA 检测 |
| 5.2.12 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 基因工程病毒灭活检测 |
| 5.3.2 基因工程病毒抗体的测定 |
| 5.3.3 口蹄疫基因工程病毒黏膜抗体测定 |
| 5.3.4 淋巴细胞增殖检测 |
| 5.3.5 细胞因子水平检测 |
| 5.3.6 基因工程病毒灭活疫苗的动物攻毒实验 |
| 5.3.7 乳鼠免疫保护实验 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 口蹄疫病毒缺失毒株构建和拯救 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株、试验动物及试剂 |
| 6.2.2 溶液及其配制 |
| 6.2.3 质粒构建和 RNA 体外转录 |
| 6.2.4 转染和口蹄疫病毒 RNA 定量 |
| 6.2.5 病毒增长曲线 |
| 6.2.6 病毒中和试验 |
| 6.2.7 统计学分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 口蹄疫缺失病毒核酸疫苗舌下免疫研究 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 疫苗与动物 |
| 7.2.2 主要试剂 |
| 7.2.3 壳聚糖纳米粒制备 |
| 7.2.4 动物和免疫 |
| 7.2.5 病毒中和试验 |
| 7.2.6 淋巴细胞转化试验 |
| 7.2.7 ELISA 检测抗体水平 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 IgG 水平检测 |
| 7.3.2 IgA 水平检测 |
| 7.3.3 淋巴细胞增值试验 |
| 7.3.4 粘膜免疫水平检测 |
| 7.3.5 细胞微量中和试验 |
| 7.3.6 豚鼠免疫保护实验 |
| 7.3.7 乳鼠免疫保护实验 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）O型口蹄疫病毒纯化及其单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 FMDV病原及流行病学研究现状 |
| 1.2 FMDV功能蛋白的研究 |
| 1.2.1 FMDV结构蛋白的功能和特性 |
| 1.2.2 FMDV非结构蛋白的功能和特性 |
| 1.3 FMD的防制 |
| 1.4 单克隆抗体的研究及应用 |
| 1.4.1 单克隆抗体的研究进展 |
| 1.4.2 单克隆抗体的应用 |
| 1.5 FMDV单克隆抗体的研究及应用 |
| 1.5.1 单抗在FMDV抗原的分析与定位中的应用 |
| 1.5.2 单抗在FMDV诊断中的应用 |
| 1.5.3 单抗在FMDV毒株变异鉴定中的应用 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 O型FMDV的纯化及灭活抗原的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞与毒株 |
| 2.1.2 主要试剂与培养基 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒复壮与细胞适应 |
| 2.2.2 病毒的灭活 |
| 2.2.3 病毒的纯化 |
| 2.2.4 病毒含量测定 |
| 2.2.5 聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化病毒 |
| 2.2.6 Western-Blot检测纯化病毒抗原性 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 病毒复壮和细胞适应 |
| 2.3.2 病毒的灭活 |
| 2.3.3 病毒的纯化及含量计算 |
| 2.3.4 SDS-PAGE检测 |
| 2.3.5 Western-Blot检测蛋白抗原性 |
| 2.4 讨论 |
| 3 抗O型FMDV单克隆抗体的制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 毒株、细胞与实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂与培养基配制 |
| 3.1.4 ELISA主要试剂配制 |
| 3.1.5 实验设备 |
| 3.1.6 其它试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物免疫 |
| 3.2.2 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.2.3 动物抗体水平检测 |
| 3.2.4 单克隆抗体的制备 |
| 3.2.5 单克隆抗体的大量制备 |
| 3.2.6 蛋白浓度测定 |
| 3.2.7 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.2.8 FMDV侵染BHK-21观察 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 间接ELISA的建立 |
| 3.3.2 小鼠抗体水平 |
| 3.3.3 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.4 腹水纯化以及浓度测定 |
| 3.3.5 杂交瘤细胞培养上清及纯化腹水效价 |
| 3.3.6 单克隆抗体特异性 |
| 3.3.7 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.3.8 O型FMDV侵染BHKK-21细胞的观察 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 动物免疫 |
| 3.4.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.4.3 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.4.4 FMDV侵染BHK-21细胞观察 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（6）口蹄疫病毒非结构蛋白致免疫应答差异的分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景、目的和意义 |
| 1.2 国内外研究进展 |
| 1.2.1 FMDV 分子生物学特征 |
| 1.2.2 FMDV 非结构蛋白的结构及功能 |
| 1.2.3 抗 FMDV 的固有免疫 |
| 1.2.4 抗 FMDV 的体液免疫应答 |
| 1.2.5 抗 FMDV 的细胞免疫应答 |
| 1.3 研究内容和方法 |
| 第二章 口蹄疫 MYA98/BY/2010 株重组毒株与其野生型毒株对豚鼠的免疫差异分析 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.1.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.2 重组毒和流行毒 TCID50和 LD50的测定 |
| 2.1.3 候选疫苗株的筛选 |
| 2.1.4 抗原量的确定、灭活疫苗的制备 |
| 2.1.5 豚鼠免疫 |
| 2.1.6 CD4+和 CD8+T 淋巴细胞亚群的测定 |
| 2.1.7 检测抗 FMDV 抗体 |
| 2.1.8 攻毒 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.2.1 细胞毒液 TCID50和 LD50测定 |
| 2.2.2 疫苗配制及安全性检测 |
| 2.2.3 外周血中 CD4+、CD8+T 淋巴细胞亚群数量变化 |
| 2.2.4 免疫豚鼠血清抗体应答 |
| 2.2.5 攻毒实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 口蹄疫 MYA98/BY/2010 株重组毒株与其野生型毒株对猪的免疫差异分析 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 疫苗和实验动物 |
| 3.1.2 主要耗材及试剂 |
| 3.1.3 仔猪免疫实验 |
| 3.1.4 CD3+、CD4+和 CD8+T 淋巴细胞亚群的测定 |
| 3.1.5 抗 FMDV 抗体的测定 |
| 3.1.6 攻毒 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 外周血中 CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴细胞亚群数量变化 |
| 3.2.2 血清中抗体水平检测结果 |
| 3.2.3 攻毒实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 非结构蛋白免疫差异位点的初步定位 |
| 4.1 实验材料和方法 |
| 4.1.1 主要试剂和耗材 |
| 4.1.2 差异肽段的合成 |
| 4.1.3 FMDV 致敏和外周血单个核细胞(PBMC)的分离 |
| 4.1.4 CFSE 染色 |
| 4.1.5 细胞刺激培养 |
| 4.1.6 猪体内致敏实验 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）猪戊型肝炎病毒分子流行病学分析及基因3型猪戊型肝炎病毒感染性克隆的构建（论文提纲范文）
| 目录 摘要 ABSTRACT 英文缩略词表 引言 第一部分 文献综述 |
| 第一章 戊型肝炎及其病原分子流行病学研究进展 |
| 1 病原学 |
| 2 病毒分类 |
| 3 HEV的研究历史 |
| 3.1 人HEV |
| 3.2 猪HEV |
| 3.3 禽HEV |
| 4 HEV基因型及其分布 |
| 5 病毒基因组结构和病毒蛋白 |
| 5.1 ORF1蛋白 |
| 5.2 ORF2蛋白 |
| 5.3 ORF3蛋白 |
| 6 流行病学 |
| 7 临床症状和病理损伤 |
| 8 HEV的复制 |
| 9 细胞培养 |
| 10 HEV疫苗研究 |
| 10.1 原核细胞表达的重组蛋白 |
| 10.2 真核细胞系统表达的重组蛋白 |
| 10.3 DNA疫苗 |
| 11 预防和控制 |
| 12 前景和展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 RNA病毒的反向遗传学及应用 |
| 1 RNA病毒反向遗传学的主要策略 |
| 1.1 全长cDNA的装配 |
| 1.2 载体的选择 |
| 1.3 RNA聚合酶系统的选择 |
| 2 RNA病毒的拯救 |
| 2.1 体外转录 |
| 2.2 体内转录 |
| 3 RNA病毒拯救后的鉴定 |
| 4 影响感染性的因素 |
| 4.1 转录物异质性的影响 |
| 4.2 基因突变的影响 |
| 4.3 末端非病毒序列的影响 |
| 4.4 帽子结构的影响 |
| 5 RNA病毒反向遗传学的应用 |
| 5.1 RNA病毒基因组结构与功能的研究 |
| 5.2 研究新疫苗方面 |
| 5.3 RNA病毒载体方面的应用 |
| 5.4 病毒拯救的机制研究 |
| 6 反向遗传学在HEV研究中的应用 |
| 7 HEV研究的重要性 |
| 参考文献 第二部分 试验研究 |
| 第一章 上海地区猪戊型肝炎病毒分子流行病学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-nPCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 2.3 HEV在上海郊区猪场中的流行状况 |
| 2.4 不同年龄段猪群感染HEV的状况 |
| 2.5 基因3型和4型HEV的相关性分析 |
| 2.6 遗传进化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪基因3型戊型肝炎病毒上海分离株全基因组序列的测定及遗传进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-nPCR扩增结果 |
| 2.2 猪基因3型HEV上海分离株的基因组结构 |
| 2.3 与HEV各基因型代表株的同源性比较 |
| 2.4 非编码区及病毒编码蛋白的比较 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组HEV衣壳蛋白的原核表达、鉴定及多克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因的扩增及克隆 |
| 2.2 重组表达质粒pET-32a-p234的构建及鉴定 |
| 2.3 目的蛋白的诱导表达 |
| 2.4 目的蛋白的纯化 |
| 2.5 目的蛋白的Western-Blot |
| 2.6 抗体效价的检测 |
| 2.7 目的蛋白的ELISA检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 猪基因3型HEV上海分离株感染性克隆的构建及体外转录活性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Overlap PCR、In-fusion PCR及酶连构建基因组全长序列 |
| 2.2 亚克隆后重组质粒pGEM 4z-HEV的鉴定 |
| 2.3 T7启动子的引入及突变位点的修正 |
| 2.4 pGEM 4z-HEV质粒的酶切鉴定及线性化 |
| 2.5 RNA的转录及变性电泳 |
| 2.6 转录后RNA的RT-nPCR鉴定 |
| 2.7 间接免疫荧光(IFA)检测培养细胞 |
| 2.8 转染后细胞裂解物的Western Blot检测 |
| 2.9 转染后细胞的RT-nPCR检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 基因3型HEV人工感染SD大鼠的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 粪便中HEV RNA的检测 |
| 2.2 血清中HEV RNA的检测 |
| 2.3 ELISA检测血清中的抗体 |
| 2.4 RT-nPCR检测遗传标志 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 全文结论 本文创新点 附录 攻读博士期间发表和完成的论文 致谢 |
（8）一种T细胞免疫原的设计及表达产物对口蹄疫疫苗的免疫增强作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究的目的及意义 |
| 1.2 口蹄疫概况 |
| 1.2.1 口蹄疫病毒物理特性 |
| 1.2.2 口蹄疫病毒基因组 |
| 1.2.3 口蹄疫病毒结构蛋白 |
| 1.2.4 口蹄疫病毒非结构蛋白 |
| 1.2.5 口蹄疫病毒生命周期 |
| 1.2.6 口蹄疫病毒的遗传变异 |
| 1.3 国内外研究进展 |
| 1.3.1 口蹄疫免疫学研究进展 |
| 1.3.2 口蹄疫疫苗研究进展 |
| 第二章 目的蛋白的表达与抗原制备 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体、质粒与菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液和培养基 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 T 细胞免疫原TI的设计 |
| 2.2.2 阳性质粒转化BL21（DE3） |
| 2.2.3 重组蛋白的小量诱导表达 |
| 2.2.4 重组蛋白的表达检测 |
| 2.2.5 重组蛋白的Western blot活性检测 |
| 2.2.6 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.7 纯化蛋白的透析复性与浓缩 |
| 2.2.8 纯化蛋白的BCA定量 |
| 2.2.9 抗原制备 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目的蛋白的表达和纯化 |
| 2.3.2 目的蛋白的活性检测 |
| 第三章 动物免疫与免疫效果评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 实验动物分组及动物免疫 |
| 3.2.2 血清抗体动态监测和中和抗体效价测定 |
| 3.2.3 细胞介导的免疫应答反应检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 血清中和抗体效价的测定 |
| 3.3.2 小鼠脾脏T细胞表面CD4，CD8与CD3分子的检测 |
| 3.3.3 小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的检测 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）AsiaⅠ型口蹄疫基因治疗与基因免疫双功能疫苗载体的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 双启动子载体pBudCE4.1-U6 的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒、菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器与设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 U6 启动子基因的获得 |
| 1.2.2 双表达载体pBudCE4.1-U6 载体的构建 |
| 1.2.3 U6 启动子启动效果的鉴定 |
| 1.2.4 检测启动子 EF-1α的效率是否受影响？ |
| 2 结果 |
| 2.1 U6 启动子、EGFP 基因的扩增 |
| 2.2 载体pBudCE4.1-U6 的PCR 鉴定、双酶切鉴定 |
| 2.3 载体序列的测定 |
| 2.4 载体pBudCE4.1-U6 中 U6 启动子效率鉴定 |
| 2.5 EF-1α的功效变化 |
| 3 讨论 |
| 第二章 以改造载体为基础之Asia I 型FMDV 双功能疫苗质粒的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 双功能疫苗质粒的构建 |
| 1.2.1 人工合成基因 |
| 1.2.2 目的基因的获得 |
| 1.2.3 免疫基因与载体的连接 |
| 1.3 双功能疫苗质粒pBudCE4.1-U6-RNAi-P12A3C |
| 1.3.1 病毒抑制试验 |
| 1.3.2 间接免疫荧光检测免疫基因的表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 免疫基因的获得 |
| 2.2 重组质粒pBudCE4.1-RNAi-P12A3C / / 酶切鉴定 |
| 2.3 间接免疫荧光检测免疫基因的表达 |
| 2.4 病毒抑制实验检测 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 文献综述 |
| 1 RNAi 研究进展 |
| 1.1 RNAi 的定义 |
| 1.2 RNA 干扰的作用机制 |
| 1.3 RNA 干扰现象的特征 |
| 1.4 RNA 干扰的应用 |
| 2 绿色荧光蛋白研究进展 |
| 2.1 GFP 基础理论研究进展 |
| 2.1.1 发展历史 |
| 2.1.2 GFP 结构 |
| 2.1.3 GFP 发光特性及机制 |
| 2.1.4 GFP 生化特性 |
| 2.1.5 GFP 的改进 |
| 2.2 GFP 应用研究进展 |
| 2.2.1 GFP 的优点 |
| 2.2.2 GFP 应用现状 |
| 2.3 GFP 基因存在的问题与展望 |
| 3 FMDV 分子生物学特性研究 |
| 3.1 FMDV 基因组结构特点 |
| 3.2 FMDV 5＇非翻译区 |
| 3.2.1 蛋白质帽状结构（cap） |
| 3.2.2 FMDV S 片段、poly (C)区、假结（PKs）和顺式复制元件(cre) |
| 3.2.3 FMDV 内部核糖体进入位点(IRES) |
| 3.2.4 FMDV L 区 |
| 3.3 FMDV 结构蛋白和非结构蛋白 |
| 3.3.1 FMDV 结构蛋白 |
| 3.3.2 FMDV 非结构蛋白 |
| 3.4 FMDV 5＇非翻译区 |
| 4 口蹄疫病疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简历 |
（10）口蹄疫病毒Asia1/1/YZ/CHA/06的全基因组序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 口蹄疫简介 |
| 1.2 口蹄疫病毒的形态结构和理化特性 |
| 1.3 口蹄疫病毒分子生物学特性 |
| 1.3.1 基因组的结构与功能 |
| 1.3.2 病毒结构蛋白及其功能 |
| 1.3.3 病毒非结构蛋白及其功能 |
| 1.3.4 口蹄疫病毒的复制过程 |
| 1.4 病毒的遗传变异 |
| 1.5 口蹄疫的防控措施及难点 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 猪源Asia1型口蹄疫病毒全基因组序列的测定与分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病料、细胞和载体 |
| 2.1.2 工具酶与主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 引物的设计与合成 |
| 2.1.5 病料的处理及病毒RNA 的提取 |
| 2.1.6 RT-PCR 及分子克隆 |
| 2.1.7 全基因组的扩增 |
| 2.1.8 5＇RACE 方法扩增并克隆基因组5＇末端 |
| 2.1.9 序列测定和分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 PCR 检测为Asia1 型口蹄疫病毒 |
| 2.2.2 基因组各片段的PCR 扩增、克隆与序列测定 |
| 2.2.3 基因组5＇末端真实序列的克隆与测定 |
| 2.2.4 5＇UTR 和3＇UTR 二级结构分析 |
| 2.2.5 猪源病毒与参考毒株的序列同源性及遗传演化分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 FMDV 细胞受体结合基序 |
| 2.3.2 口蹄疫病毒组织嗜性 |
| 2.3.3 病毒抗的原性 |
| 2.3.4 基因组序列测定的准确性 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Asia1 型口蹄疫病毒全基因组序列的组装 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 毒株、菌株、细胞、载体 |
| 3.1.2 工具酶与主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 病毒全基因组拼接策略及组装 |
| 3.1.5 全基因组组装后测序 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 FMDV 全长cDNA 克隆的酶切鉴定 |
| 3.2.2 FMDV 基因组全长cDNA 的修正 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 poly(C)序列长度 |
| 3.3.2 非病毒碱基的引入 |
| 3.3.3 质粒的不稳定性 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、用前导蛋白酶缺失的A_(12)-LLV_2株FMDV制备疫苗（论文参考文献）
- [1]外源FLAG插入对猪源口蹄疫病毒O/CHA/90株分子生物学特性及免疫原性的影响[D]. 朱元源. 南京农业大学, 2016(07)
- [2]口蹄疫病毒Asia 1/WX株全长感染性cDNA的构建及其重组病毒的体外拯救[D]. 仝燕许. 中国农业科学院, 2014(12)
- [3]细胞因子对PCV2-Cap蛋白免疫增强作用及Cap与FMDV-Vp1共表达产物免疫原性鉴定[D]. 王一平. 中国农业科学院, 2013(02)
- [4]口蹄疫基因工程病毒拯救及其舌下免疫研究[D]. 陈豪泰. 甘肃农业大学, 2012(07)
- [5]O型口蹄疫病毒纯化及其单克隆抗体的制备[D]. 张奕强. 四川农业大学, 2012(07)
- [6]口蹄疫病毒非结构蛋白致免疫应答差异的分析[D]. 孙英军. 中国农业科学院, 2012(10)
- [7]猪戊型肝炎病毒分子流行病学分析及基因3型猪戊型肝炎病毒感染性克隆的构建[D]. 司伏生. 南京农业大学, 2011(12)
- [8]一种T细胞免疫原的设计及表达产物对口蹄疫疫苗的免疫增强作用[D]. 赵清. 中国农业科学院, 2011(10)
- [9]AsiaⅠ型口蹄疫基因治疗与基因免疫双功能疫苗载体的构建[D]. 项海涛. 甘肃农业大学, 2009(06)
- [10]口蹄疫病毒Asia1/1/YZ/CHA/06的全基因组序列分析[D]. 王海伟. 中国农业科学院, 2008(10)