一、霍乱弧菌O_1快速诊断试纸条检测法临床验证报告（论文文献综述）
钱佳婕[1]（2021）在《CRISPR/Cas12a系统在新冠病毒和金黄色葡萄球菌即时检测中的应用》文中进行了进一步梳理严重急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus2,SARS-CoV-2）所造成的新型冠状病毒肺炎是一种持续的大流行病,对公共卫生和全球经济构成了严峻挑战。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）是一种常见的食源性致病菌,易引起食物中毒,并对人类健康造成严重威胁。针对上述致病微生物的现有检测方法各有优势,但仍依赖于大型仪器设备和专业操作人员,极大地限制了其应用范围,也难以在条件相对落后、实验资源匮乏的地区普及。近年来,规律成簇的间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及 CRISPR 相关蛋白（CRISPR associated proteins,Cas）所构成的CRISPR/Cas系统引起了科学家们的广泛关注,其中CRISPR/Cas12a因其具有crRNA指导的靶DNA激发的非特异性ssDNA切割活性成为了体外诊断领域的研究热点;重组酶介导扩增技术（Recombinase aided amplification,RAA）突破了精密控温设备的限制,在恒定且温和的条件下即可快速完成目标核酸的指数扩增;此外,胶体金免疫层析技术具有快速、便携的特点,将其与CRISPR/Cas12a技术结合,有望克服现有致病微生物检测技术的缺陷,实现更灵敏、特异、快速、简便的检测。故本研究意在结合CRISPR/Cas12a系统、RAA等温扩增技术、荧光分析及胶体金试纸条信号输出方式,构建针对SARS-CoV-2和金黄色葡萄球菌的即时检测平台。首先本文建立了一种基于CRISPR/Cas12a系统和荧光分析技术的SARS-CoV-2检测平台,选择N基因作为检测靶标,并将人源RNaseP基因片段作为内参。对反应条件进行优化后,该技术的灵敏度达1 ×100 copies/μL,并在检测临床样本时表现出良好的准确性和特异性,整个检测流程仅需60min。因此,该检测技术平台具有灵敏度高、特异性强、快速高效的特点,具有良好的发展前景,对于COVID-19早期诊断和预防控制具有重要意义。此外,本文基于上述原理构建了一种金黄色葡萄球菌检测平台,选择金黄色葡萄球菌nuc基因和葡萄球菌属16S rDNA作为检测靶标。结合RAA等温扩增技术,该平台检测灵敏度为1×100 CFU/反应,检测人工污染牛奶样品的灵敏度为2×101CFU/mL,并在检测其他食品样品时也表现出良好的准确性,整个检测流程仅需70 min,可满足食品中金黄色葡萄球菌的检测需求。为更好地满足即时检测需求,本文在金黄色葡萄球菌CRISPR荧光检测体系的基础上引入了胶体金免疫层析技术,建立了 一种CRISPR-lateral flow strip（CRISPR-LF）检测平台,可通过裸眼观测或读数仪测定,各项检测参数与上述荧光检测体系相当,并将整个检测流程缩短至60min。该平台在实现目标细菌快速、灵敏、准确、特异检测的同时,提高了检测的便携性和用户友好度,更适合在经济落后、实验资源匮乏的地区使用。因此,CRISPR-LF检测平台在致病菌POCT检测领域具有良好的发展前景,对于食品安全监查、食源性疾病的预防和诊断具有重要意义。
李健[2]（2021）在《应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究》文中研究说明旋毛虫（Trichinella spiralis,T.spiralis）是一种人兽共患食源性寄生虫,生食或半生食含有旋毛虫的猪肉及其产品是人类感染旋毛虫的主要方式,因感染旋毛虫而引起的疾病被称为旋毛虫病（Trichinellosis）,该病呈世界性分布且严重威胁人类健康和公共安全,因此,猪旋毛虫检测被列为屠宰必检项目。目前使用的旋毛虫检测方法存在技术短板,无法满足对日常养殖和现代化屠宰加工过程中,猪体内旋毛虫的监测。因此,针对现代化大型养殖和屠宰场研发一种快速、灵敏的旋毛虫现场检测方法,对于旋毛虫病防控具有重要意义。本研究基于表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS）和上转换发光免疫层析法（Upconversion phosphor immunochromatography assay,UCP-ICA）建立旋毛虫快速检测体系,为研发适用于现代化大型养殖和屠宰场的旋毛虫检测方法奠定基础,具体研究内容和结果如下:1.基于SERS建立旋毛虫检测方法。利用盐酸羟胺还原硝酸银,制备银纳米溶胶,测试其拉曼光谱增强性能及其对实验样品的影响。20只Wistar大鼠口服感染旋毛虫肌幼虫（Muscle larvae,ML）（3500条/只）,并设平行空白对照组（20只Wistar大鼠）。收集血清,采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪采集未感染的血清及感染后28天血清的SERS,对SERS进行去荧光背景及面积归一化处理。比较SERS变化以及通过多元统计分析,如主成分分析（Principal component analysis,PCA）和线性判别分析（Linear discriminant analysis,LDA）,分析SERS并建模。结果表明,所制备的银纳米溶胶颗粒直径约为25 nm,大小均匀,纯度高,且具有良好的拉曼光谱增强效果。感染组和对照组在未感染旋毛虫时的血清拉曼光谱无显着差异;第28天,两组的血清拉曼光谱出现显着差异。通过PCA结合LDA构建诊断算法,发现该方法灵敏度为87.5%,特异度为94.7%,正确度为91.4%。基于以上结果,将银纳米胶体的SERS与PCA和LDA相结合,有望实现大规模、现场、快速、无标记、高准确检测,在旋毛虫病防控方面具有巨大的应用潜力。2.基于UCP-ICA建立旋毛虫免疫层析检测法。将旋毛虫排泄分泌抗原（Excretorysecretory antigens,ES）、山羊抗兔Ig G与上转换发光纳米颗粒（Upconversion nanoparticles,UCNPs）共价偶联,以山羊抗猪Ig G（800 ng/条）与兔抗山羊Ig G（200 ng/条）喷于硝酸纤维素薄膜（Nitrate cellulose sheet,NC sheet）上,分别作为检查带（T线）与质控带（C线）,并且命名该方法为旋毛虫上转换发光免疫层析法（T.spiralis upconversion phosphor immunochromatography assay,Ts-UCP-ICA）。Ts-UCP-ICA优化后的最佳血清稀释倍数为1:150、最佳样品处理液为100 m M HEPES p H 7.5,270 m M Na Cl,0.5%v/v Tween-20,1%v/v BSA。通过检测169份阴性猪血清,确定Ts-UCP-ICA的低特异度cut-off值为0.1906（T/C ratio）,高特异度cut-off值为0.3233。检测猪囊尾蚴、亚洲带绦虫幼虫以及弓形虫感染后的猪血清样本,结果显示,Ts-UCP-ICA特异性良好,均未发生交叉反应。检测感染100、1000、10000 ML猪血清,发现三个剂量分别在第35、30、25天可检出阳性。Ts-UCP-ICA单盲测试（Single-blinded assay）55份猪血清,使用低特异度cut-off值时,检测特异度和灵敏度均100%,使用高特异度cut-off值时,检测特异度为100%和灵敏度为80%。该方法与人工消化法的检测总符合率为87.27%,一致性系数（Kappa值）为0.7454,稳定性为4℃保存6个月有效。本论文建立的两种旋毛虫检测方法,构成“旋毛虫快速检测体系”。基于SERS建立的旋毛虫检测法具有检测速度快,高通量的特点,适合大规模样本筛查;而基于UCP-ICA建立的旋毛虫检测方法可用于可疑血清进一步确定。该检测体系可提高检测效率和检测效果,进一步提升旋毛虫流行病学调查、畜牧养殖及屠宰即时检测水平,为旋毛虫病防控提供技术保障。
李雪彤[3]（2019）在《RT-qsCPA及CPAP可视化方法快速检测副溶血弧菌体系建立》文中进行了进一步梳理副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种广泛分布于自然界、属于弧菌属的食源性致病菌。食用被副溶血弧菌污染的食物后,会引起多种肠胃炎症状（如腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热等）;重症患者还可能出现脱水、休克昏迷,甚至死亡,故副溶血弧菌又被称为“肠炎”弧菌。该菌在26℃下可快速增殖,24 h内增长为原污染量的50790倍,可快速造成食品污染。目前,副溶血弧菌已成为我国首要食源性致病菌,尤其在一些沿海城市,由其引起的食物中毒案例占细菌性食物中毒总数的60%以上。而副溶血弧菌的传统检测方法操作繁琐、耗时较长、工作量巨大,因此,建立简便、快捷、灵敏的检测方法对于食品安全监测具有重要意义。目前,交叉引物扩增技术（cross-primer amplification,CPA）主要结合纳米金试纸条对靶标进行检测,由CPA技术衍生的其他检测方法仍十分少,远不如LAMP技术的开发。因此,为了CPA技术的进一步开发应用,本研究基于CPA技术建立了两种新的副溶血弧菌检测方法——实时荧光定量单交叉引物扩增（Real-time fluorescence quantitative single cross-priming amplification,RT-qsCPA）方法与交叉引物扩增-磷酸根(Cross-priming amplification-HPO42+,CPAP)可视化检测方法。本研究以副溶血弧菌tlh基因为靶基因设计CPA引物（正反向外引物4s和5a,交叉引物CP,内引物2a和3a）;优化RT-qsCPA方法与CPAP可视化检测方法的组成及反应条件;考察两种方法的灵敏度及特异性;比较不同纳米粒子对CPA扩增效率的影响,确定合适的纳米粒子以提高反应效率;比较CPAP可视化检测方法与磷酸根试纸条检测方法的检测效果。试验结果表明:1.RT-qsCPA最佳反应体系为0.5×SYBR GreenⅠ、1×等温扩增缓冲液、0.5 mol·L-1甜菜碱、6 mmol·L-11 MgSO4、0.8 mmol·L-11 dNTPs、0.5μmol·L-11 CP、0.4μmol·L-11 2a、0.4μmol·L-13a、0.05μmol·L-11 4s、0.05μmol·L-11 5a、8 U Bst 2.0 DNA聚合酶、0.2 mg·mL-11 SiO2（50 nm粒径）;最佳反应温度为63℃;最佳反应时间为1h。2.CPAP最佳反应体系为1×等温扩增缓冲液、0.5 mol·L-1甜菜碱、4 mmol·L-11 MgSO4、0.6 mmol·L-11 dNTPs、0.5μmol·L-11 CP、0.4μmol·L-11 2a、0.4μmol·L-11 3a、0.05μmol·L-11 4s、0.05μmol·L-11 5a、8 U Bst 2.0 DNA聚合酶、0.05 U热稳定无机焦磷酸酶（PPase）;CPAP最佳显色试剂组成为1.68 mmol·L-1钼酸铵、0.08 mmol·L-1酒石酸锑钾、0.3 mol·L-11 H2SO4、0.8%抗坏血酸;最佳反应温度为63℃;CPAP最反应时间为35 min。3.0.2 mg·mL-11 SiO2对RT-qsCPA扩增效率具有明显的提高作用。4.RT-qsCPA及CPAP可视化检测方法的检测限均为103copies。5.与使用磷酸根试纸条相比,CPAP可视化检测方法对CPAP产物中的磷酸根检测具有更好检测效果。通过本研究,建立了简易、快速、灵敏的基于CPA技术的定量及可视化新方法,为快速检测食品中副溶血弧菌提供了新的检测技术平台。
李倩茹[4]（2018）在《基于荧光微球的食源性致病菌免疫检测方法的建立及评价》文中研究表明近年来,食品安全问题越来越受到人们的关注与重视,为了防止食源性致病菌污染导致食物中毒的发生,减少食品安全隐患,从食物的源头及食品的生产、加工过程中进行致病菌检测十分必要。因此,研究针对食源性致病菌的快速检测方法、探索标准化的检测模式具有十分重要的意义。由于免疫层析技术具有简单、快速、灵敏度高及稳定性好等特点,而荧光微球有比较稳定的形态结构及发光行为,受外界环境的影响比纯荧光化合物小,而且容易通过荧光信号的测定而达到快速定量,近年来被广泛应用于生物标记检测中。把荧光微球标记技术与免疫层析技术结合建立基于荧光微球的免疫检测模式（FM-ICA）,应用免疫磁分离技术（IMS）富集和浓缩食品中的食源性致病菌,探讨层析过程中的影响因素,并对FM-ICA检测方法进行评价。本研究通过免疫雄性大白兔制备了三种食源性致病菌的多克隆抗体,并与市场购买的单克隆抗体进行了ELISA配对筛选,得到几对能用于双抗夹心的抗体对,并对它们的特异性进行了调查。结果表明,所筛选到的抗体对特异性较好。采用EDC/NHS偶联法,把磁性微球与多克隆抗体进行偶联,筛选到四种性能较好的磁性微球,其中PM3磁珠平均粒径为190.9 nm,xMag-C和xMag-N磁珠的平均粒径分别为1150 nm和1545 nm,EM1磁珠平均粒径为469.7 nm,四种磁珠的粒径分布都较为均匀,分散性较好;不同磁性微球由于粒径不同,磁性微球表面的羧基含量不一样,偶联抗体的量不一样,EM1磁珠偶联量为120μg/mg,而xMag-C和xMag-N两种磁珠偶联量为160μg/mg,PM3纳米磁珠的偶联量在240μg-280μg/mg;利用xMag-C制备了三种食源性致病菌的免疫磁珠,对1×104 CFU/mL菌液,加入0.25-0.5 mg免疫磁珠能使捕获率达到80%以上,磁珠捕获时间为30-45 min,食品基质的稀释倍数对捕获率有显着影响,固体样本稀释20倍,菌体的回收率能达到85%以上。建立了基于荧光微球的免疫层析检测平台,并对影响层析的因素进行了探讨,对平台的应用性能进行了评价。结果表明,所建立的FM-ICA检测副溶血弧菌的敏感性为2×105 CFU/mL,回收率为81.75%-110.50%,37℃放置28天保持稳定,不同批次之间变异系数（CV）小于10%,与23株非目标菌株无叉反应;FM-ICA检测具有较高的敏感性、精密度、特异性和稳定性,整个检测过程能在30 min内完成,具有很好的应用价值,能应用于某些紧急情况下食品中副溶血弧菌的快速筛查,或用于海水中副溶血弧菌的检测,亦能用于腹泻病人中弧菌感染的快速诊断。把荧光免疫层析平台（FM-ICA）与免疫磁分离技术（IMS）结合,用于检测食品中的鼠伤寒沙门氏菌（ST）,探讨了不同洗脱方式、基质的稀释倍数对检测的影响。结果表明,采用70℃加热15 min的方式较其它洗脱方式效果好,洗脱率达到65%左右;将人工污染的鸡蛋基质稀释20倍以上,FM-ICA+IMS检测ST的敏感性可达5×104CFU/mL,比单一的FM-ICA检测法提高了20倍,与25种非目标菌在鸡蛋液中无交叉反应,特异性较好,并在2小时内完成检测,可用于鼠伤寒沙门氏菌爆发时期食品的快速筛查。建立了FM-ICA+IMS检测E.coli O157:H7的模式,最低检测限可达3×103 CFU/m。FM-ICA对同一PVC板的回收率在101.64%-107.03%之间,不同批次PVC的回收率在95.62%-110.2%之间,CV值小于10%,对6株E.coli O157:H7菌株表现出较强的阳性信号,而对其它15株非目标菌株无交叉反应。所建立的FM-ICA+IMS的特异性、稳定性、精密度都较好,相比单一FM-ICA,敏感性提高了33倍,该方法可用于食源性致病菌爆发时期E.coli O157:H7的快速筛查。利用Se和Cd制备了三种荧光CdSe/ZnS量子点,并在其表面包裹一层ZnS后形成CdSe/ZnS量子点,将荧光性能较好的绿光量子点通过溶胀法包裹进聚苯乙烯微球内部,制备了量子点-聚苯乙烯荧光微球（QD-PS）;将QD-PS标记到抗副溶血弧菌抗体上制备了荧光探针,并与ICA相结合建立了副溶血弧菌的快速检测方法（QD-PS-ICA）,检测的敏感性可达1×104 CFU/mL,定量限为4×104 CFU/mL,检测的线性范围为4×104-4.1×107 CFU/mL,较FM-ICA检测方法敏感性提高了20倍,回收率、稳定性和精密度较好。
任永鑫[5]（2018）在《艰难梭菌—GDH的原核表达、纯化与胶体金免疫层析检测方法的建立》文中研究指明艰难梭菌（Clostridium difficile,CD）,作为人肠道常驻菌,是引起抗生素相关性腹泻的主要病原菌,也是院内腹泻的主要致病菌。CDI诊断一般采用两步法,首先针对产毒株和非产毒株均有稳定表达的膜蛋白—谷氨酸脱氢酶（GDH）采用ELISA进行初筛,阳性病例再进行细胞毒素中和试验进行毒素检测。国内目前尚无针对CDI的系统的流行病调查报告,也没有批准的商品化检测试剂盒。本实验拟建立针对GDH的胶体金免疫层析检测方法,为CDI的临床检测、流行病调查,提供一种新的、高特异性检测方法。实验以CD630菌株的全基因组序列为模板,PCR方法克隆GDH完整序列,构建pET30a（GDH）表达质粒,转化至E coli BL21表达菌株,原核表达谷氨酸脱氢酶（GDH）,并对表达条件进行优化。成功表达后,采用Ni-NTA亲和层析法进行纯化,并以纯化后蛋白为抗原,免疫家兔制备多克隆抗体。随后,以纯化的GDH—多克隆抗体为免疫金抗体,GDH—单克隆抗体为检测线包被抗体,建立艰难梭菌—GDH胶体金免疫层析检测方法。通过原核表达系统,高效表达GDH蛋白,经过SDS-PAGE分析,表达的GDH大小约51kDa。通过Ni-NTA系统纯化后,GDH纯度可达90%以上。纯化蛋白免疫家兔后,分离血清并通过Protein A纯化蛋白,得到效价1:51,200的多克隆抗体。以制备的多抗为免疫金抗体成功构建胶体金免疫层析检测方法,经检测其特异性良好,不与其他肠道常驻菌反应、敏感性达到80ng/mL,经过临床应用与PCR方法对照试验,准确率达到80.36%。综上,本实验建立的艰难梭菌-GDH胶体金免疫层析检测方法,具有良好的特异性、准确性,为CDI的临床诊断提供一种新的思路。
董德荣[6]（2016）在《一种新型核酸恒温扩增方法的研究及其在现场检测中的应用》文中研究指明近些年来,新发、突发传染病疫情不断增多,传统传染病有不断抬头的趋势,对人民生命财产安全构成了极大的危害,与此同时我国地震、洪涝灾害频发,且随着中国国际化进程的加快,在华举办的各种国际重大会议及活动增多,安保任务加重,在这样的背景下,对病原微生物的现场检测（point-of-care testing,POCT）提出了很高的要求。病原微生物的现场检测技术主要包括免疫学检测和核酸检测两大类,由于免疫学方法总体灵敏度不高,故又以核酸检测为主。核酸检测按反应温度的不同分为变温核酸扩增技术（Alternating Temperature Nucleic Acid Testing,ATNAT）和恒温核酸扩增技术（Isothermal Nucleic Acid Testing,INAT）。ATNAT主要是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）及其衍生技术,如荧光定量PCR、逆转录PCR等,这些技术共同特点是需要温控严格、元件精密的复杂仪器。INAT是指在恒定温度下扩增核酸的技术,由于温度要求单一,INAT反应在恒温仪器中就可以进行,如水浴锅、金属浴甚至一个保温效果好的保温杯就可以完成反应,彻底抛弃了PCR等技术需要的变温装置,简化了操作步骤,满足部队野战、社区基层医疗、现场流行病学调查、医院床头诊断等即时检测环境下的需求。常用的INAT技术主要包括链替代扩增（SDA）、滚环扩增法（RCA）、环介导恒温核酸扩增法（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）等技术,其中LAMP法由于只需一种酶、扩增效率高,是目前INAT技术中应用最多、论文发表量最大的方法,但也有着引物设计复杂、假阳性率偏高、试剂价格高等缺点,且由于日本知识产权的保护,我国在转化应用上局限性较强。为此我们发明了聚合酶螺旋反应（Polymerase Spiral Reaction,PSR）这一新型的核酸恒温扩增方法,它利用混合引物的设计思路和Bst DNA聚合酶的链置换活性,通过引物结合、延伸、解链、单链旋转、再次延伸的循环,达到等温条件下核酸扩增的目的,PSR兼具PCR法引物设计简单和LAMP法只需一种酶、反应高效的特点,首次实现了一对引物和一种酶在等温环境下的核酸扩增。为进一步提高PSR法的反应速率,我们引入了加速引物的概念,使得反应Ct值缩小到20min之内,并优化了反应体系和引物设计参数,最终建立聚合酶螺旋反应这一新型的核酸恒温扩增方法。常用的核酸检测结果判读方法包括琼脂糖凝胶电泳法、荧光成像法、核酸薄膜层析试纸条法和实时浊度法等方法,但它们都有一个共同的特点即需要专业的仪器,且对操作人员专业水平要求较高,在现场检测中局限性较强。本研究利用PSR反应中金属离子浓度、酸碱性等反应体系参数的变化,采用钙黄绿素（Calcein）、羟基萘酚蓝（HNB）和pH值指示剂（甲酚红-苯酚红）这三种颜色指示剂,评估其对反应的影响及最佳显色浓度。最终在反应前加入1μl指示剂,反应后通过简单的颜色判读即可判断反应结果,阴性到阳性的变化分别为钙黄绿素（淡橙色→绿色）、羟基萘酚蓝（紫色→天蓝色）、甲酚红-苯酚红（红色→黄色）,PSR显色法简便、经济、肉眼可识别,完全满足POCT检测的要求。从待测生物样本中提取核酸是核酸检测的第一步,现场、临床等即时检测环境下也不例外。核酸提取一般是采用基于胍盐裂解法、硅膜法、磁珠法等各种原理的试剂盒,或者是采用核酸自动化提取仪,但用试剂盒提取核酸费时费力、操作复杂,往往需要2小时以上的时间,不能满足即时检测快速、简便的需求,核酸自动化提取仪能实现高通量且操作简便,但比较笨重、维护成本高。本研究通过核酸暴露的理论,研制了一种以非离子型表面活性剂Chelex-100、TritonX-100为主要裂解成分的样本处理管,评价其从革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒等不同病原微生物中提取核酸的效果,结果显示只需要在90℃裂解10min,即可适用于PSR、LAMP及荧光定量PCR等检测技术,并且效果与商用试剂盒相当,具有操作简便、裂解效果好、不影响后续反应的特点,且不受粪便、痰液、血液等复杂样本的影响,同时具有病原灭活、核酸释放、过滤除杂、精确加样这四大特点,特别适合于现场检测情况下使用。酶、引物等生物活性物质在非低温环境下易失活,通过与国内同行的交流与合作,采用玻璃化技术对PSR反应体系中的生物活性物质进行处理,实验结果证实处理后的酶在50℃放置加速破坏,2个月后活性没有明显变化,相当于室温放置1-2年,解决了这一问题。并研制了便携式PSR检测仪,检测仪同时包括裂解区和扩增区,通过挤压样本处理管滴加一滴裂解液（约10μl）至反应管盖上,静置片刻后甩下液体在检测仪中完成扩增,在提示声响后取出即可通过颜色变化判读阴阳性结果,便携式PSR检测仪通过了不同酸碱度样本和粪便、尿液、血液等复杂样本的考核。本研究在完善PSR反应及其相应的样本快速处理、结果快速判读等方法后,建立了基于PSR反应的快速检测技术平台,为日常疾病预防控制任务和申请国家药监局相应批号提供技术支持,并致力于应对新发、突发传染病疫情及实验室常规的病原检测。本研究还构建了肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、霍乱弧菌这六种病原微生物的PSR检测方法,实验数据证实其具有良好的特异性和敏感性,并在临床考核中取得了良好成效。综上所述,本研究发明了聚合酶螺旋反应这一新型的核酸恒温扩增方法,具有良好的特异性与敏感性;解决了样本核酸提取和扩增结果判读繁琐、复杂的问题;建立了基于PSR反应的快速检测技术平台;并研制了简洁易用的便携式PSR检测仪。我们认为PSR技术将为即时检测、应对新发突发传染病疫情及实验室常规的病原检测提供有力的技术支持,逐渐走向现场、走向基层、走向家庭,最终让核酸检测随处可行。
史咏梅,何晖,谭华,冯子力,伍碧梅,朱海,涂承宁,唐明慧,杨泽,汪海波[7]（2015）在《一种快速筛查金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析方法的建立》文中研究指明目的建立一种快速筛查金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析检测方法。方法以荧光纳米颗粒作为示踪标记物,采用双抗体夹心法检测金黄色葡萄球菌A蛋白,制备了稀土离子标记的免疫层析试纸条,在紫外激发光源下判断反应结果。对该方法的特异性、敏感性和样本检测的适用性进行了分析。结果所制备的试纸条具有良好的特异性,与表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌、O1/O139群霍乱弧菌、副溶血性弧菌均无交叉反应。用该试纸条检测纯菌液和未经培养的粪便、呕吐物的灵敏度为7.2×104CFU/ml,检测经培养的模拟污染食物样本、粪便样本的检测限最低为7.2×102CFU/ml,反应在15 min内完成。结论本研究成功建立了金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析检测方法,能够快速检测食品、奶制品、呕吐物、粪便中的金黄色葡萄球菌,具有良好的特异性和灵敏性,便于开展现场快速检测。
徐苗苗[8]（2015）在《两种海洋病原微生物快速检测技术的研究》文中研究指明副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,简称VP）,是一种革兰氏阴性人鱼共患致病菌。副溶血性弧菌食物中毒与进食含有该菌的食物有关,生食或食入未煮熟的海产品或腌制食品是其主要传播途径。随着海产品消费水平的提高,副溶血性弧菌引起的食物中毒事件呈逐年上升的趋势,由该菌引发的疾病现已跃居食源性疾病之首。锯缘青蟹呼长孤病毒是近年来发现的一种青蟹类病毒,其致死率较高并难以控制,严重影响了青蟹养殖业经济的发展。由于该病毒发现较晚,国内对其进行的研究相对较少。目前,针对副溶血性弧菌的检测技术众多,包括各种分子生物学和免疫学方法。对青蟹呼长孤病毒的检测主要有肉眼症状观察法、传统的组织切片及超薄切片技术,PCR以及其衍生技术。但迄今为止,现有的各种检测技术虽然可以实现高特异性和高灵敏度,但是一般对仪器设备的要求比较高,且需要有熟练的专业技术人员操作,很难应用于基层单位及在病害发生现场进行快速检测。因此,针对上述两种具有严重危害的海洋病原微生物,迫切需要建立一种简便快速、特异性强、灵敏度高且成本低的检测技术,以适用于基层单位和现场的日常监测。交叉引物恒温扩增（CPA）是近几年建立的一种新的恒温扩增技术,该方法在恒温条件下就可以实现对目的片段的大量扩增。将该扩增技术与免疫胶体金技术相结合可实现快速、直观的检测效果,且对设备的要求比较低,操作相对简单。免疫胶体金技术是以胶体金为示踪物,利用抗原抗体特异性结合的原理,实现对抗原或抗体的快速检测。该方法灵敏度高,且对仪器的依赖程度低,操作简单。本研究结合分子生物学和免疫胶体金技术,分别建立了针对副溶血性弧菌和青蟹呼长孤病毒的新型检测技术,主要研究结果如下:（1）CPA-核酸试纸条法快速检测副溶血性弧菌方法的建立:以副溶血性弧菌种特异性溶血基因tlh为靶基因,设计两对扩增引物和一对检测探针。通过对CPA反应体系中的各个影响因子进行优化,最终确定最佳反应体系为:上下游外围引物各0.1μmol/mL,上下游交叉引物各0.6μmol/mL,两条检测探针各0.3μmol/mL,Mg2+浓度为4.0 mmol/mL,甜菜碱浓度0.8 mol/L,dNTPs浓度0.4 mmol/mL,2μl 10×ThermoPol缓冲液,反应温度63℃,反应时间1 h。分别采用核酸试纸条和琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测,结果表明两种检测方法对CPA扩增产物的检测结果一致。通过比较普通PCR法与CPA-试纸条法对副溶血性弧菌纯培养物和基因组检测灵敏度发现,CPA-试纸条对纯培养物的检测限为5.8×102cfu/mL,对基因组的检测限为11.4 pg/mL,其灵敏度是普通PCR的10倍。该方法从扩增到检测完成仅需75 min,为副溶血性弧菌的快速检测提供了一种更高效的技术支持。（2）锯缘青蟹呼肠孤病毒外壳蛋白VP12原核表达体系的建立:以BL21/pET28a为表达载体构建重组表达质粒,通过对诱导表达条件的优化,表达后的重组蛋白量占总蛋白的83%,实现了重组蛋白VP12的高效表达。（3）锯缘青蟹呼肠孤病毒外壳蛋白VP12多克隆抗体的制备:以纯化的VP12重组蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经Western blotting分析该抗体能特异性的识别VP12蛋白,通过间接ELSIA测定该抗体的效价为1:51200。（4）锯缘青蟹呼肠孤病毒外壳蛋白VP12单克隆抗体的制备:以VP12重组蛋白为抗原进行单克隆抗体的制备,采用常规免疫技术,通过脾细胞与杂交瘤细胞的融合,成功制备了5株抗VP12细胞株。最后经Dot blotting分析,细胞株1M9和2N5产生的抗体亲和力较高,因此,选取McAb 1M9和McAb 2N5作为后续免疫胶体金制备的抗体材料。采用硫酸铵与protein G亲和层析法对单克隆抗体进行纯化,纯化后的抗体浓度分别为4.004mg/mL、4.078 mg/mL,且经SDS-PAGE电泳检测只有重链和轻链两条特异性条带。Western blotting实验结果表明抗体特异性较好,经间接ELISA测得两个抗体1M9和2N5的效价分别为1:102400和1:51200。（5）免疫胶体金试纸条的制备及其检测应用:采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20nm的胶体金颗粒,对制备的胶体金进行透射电镜和紫外可见光谱分析,证明制备的胶体金颗粒均一、分布均匀,质量较好,可以用其标记抗体。用1M9抗体作为金标单克隆抗体,同时分别将2N5单克隆抗体和羊抗鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线。通过一系列优化最终确定金标抗体的最低标记浓度为37.5μL每毫升胶体金溶液,单克隆抗体2N5和羊抗鼠IgG的包被浓度均分别为0.75 mg/mL和1.0 mg/mL。在此基础上将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按顺序依次组装成一次性免疫胶体金层析试纸条。用试纸条分别对稀释后的VP12重组抗原和呼肠孤病毒颗粒进行检测。检测结果表明,该试纸条对纯抗原的检测灵敏度为3.8μg/mL,对病毒颗粒的检测灵敏度为20.4μg/mL。取对虾白班综合症病毒和无菌水作为阴性对照检测其特异性,结果显示该试纸条只对锯缘青蟹呼肠孤病毒的检测结果呈阳性,具有较好的特异性。本研究建立的针对两种病原微生物的检测方法,具有快速、灵敏、高效、直观的检测特点,为两种病原微生物的早期预防、检验检疫、快速诊断、监测防控提供了较为实用的检测工具。
刘志强[9]（2014）在《黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制》文中研究表明刺参富含刺参粘多糖、蛋白质、氨基酸、刺参皂苷等营养，由于其较高的经济价值与营养价值，我国刺参养殖规模增长迅速，但是养殖模式的不够成熟及生产过程中的不规范操作，刺参病害问题日渐突出，其中由细菌感染引起的化皮病是当前养殖刺参中最常见、危害最为严重的疾病。该病存在明显的病原多样性和地区差异，黄海希瓦氏菌（Shewanella smarflavi）是引起辽宁刺参化皮病的重要病原菌，导致养殖过程中刺参大量死亡，造成巨大的经济损失，严重危害刺参养殖业的发展。水产养殖中针对水生动物疾病的爆发无非就是要做到快速、准确的诊断，而通常病原菌引起大规模疾病的爆发都有一段潜伏期，在这段时间内，动物本体往往没有太明显的症状，这就造成了疾病确诊的延误，从而耽误了疾病治疗的最佳时机。目前针对黄海希瓦氏菌检测的生理生化方法、分子生物学鉴定法及ELISA法都不同程度需要专业操作技术人员且耗时过久，在基层无法操作检测，为了达到疾病早期确诊，这就要求一种快速、简便、准确的检测方法。胶体金免疫层析技术（GICA）是一种以胶体金为标记物的快速免疫结合分析技术，通过该技术建立的试纸条是一种新型体外检测工具，具有简便快速、肉眼判断、放大反应等优点，能极大满足基层现场检测黄海希瓦氏菌的所有要求，无需专业人员即可定期进行检测，从而达到对病原菌感染养殖动物引起疾病起到良好的监测作用。本研究前期先行制备抗黄海希瓦氏菌单克隆抗体及多克隆抗体，为试纸条的研制准备材料，应用双抗夹心法建立了检测黄海希瓦氏菌的GICA方法，对胶体金标记单抗、抗体喷涂等各项指标进行优化，并确定了最佳条件，成功研制了黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条。本研究所研制的试纸条对黄海希瓦氏菌进行检测，510min肉眼即可判读结果，检测灵敏度达到105CFU／mL，最佳检测浓度为5×1055×106CFU／mL。试纸条分别对两个浓度5×105、5×107CFU／mL的希瓦氏菌（KCCM41821）、迟钝爱德华菌（ATCC15947）、杀鲑气单胞菌（MT004）、河豚链球菌（KCTC3657）、哈维弧菌（ATCC14126）、灿烂弧菌（ATCC33125）、美人鱼弧菌（ATCC33539）、副溶血弧菌KCTC2471)、溶藻弧菌（KCCM40513）、创伤弧菌（ATCC2126）、鳗弧菌（KCTC2711）12株菌均无交叉反应。4℃或37℃存放6个月，检测结果稳定。该试纸条检测灵敏度高、特异性强，稳定性好，而且无需检测仪器即可检测黄海希瓦氏菌，特别适用于基层推广使用，可以对该菌引起的仿刺参疾病起到良好的监测作用。
徐苗苗,刘静雯[10]（2014）在《副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus O3:K6大流行克隆的溯源》文中研究表明副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）是一种革兰氏阴性嗜盐性海洋细菌。1950年从日本一次暴发性食物中毒中首次分离发现。作为一种食源性人鱼共患致病菌,副溶血性弧菌在全球的河口、海洋和沿海广泛传播,由其引起的食物中毒已跃居其它病原菌之首。副溶血性弧菌在进化过程中通过基因重组和基因水平转移逐渐改善其对环境的适应性,因而与其它所有致病微生物相比,副溶血性弧菌的基因型和血清型都具有高度的多样性。本文就副溶血性弧菌,特别是1996年后在世界范围内出现的O3:K6新血清型流行株（形成所谓的O3:K6大流行克隆Pandemic clone）的发现及流行特征、变异分子流行病学特征、在我国的分布及研究进展进行综述,以期为O3:K6大流行克隆的溯源提供更多依据。
二、霍乱弧菌O_1快速诊断试纸条检测法临床验证报告（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、霍乱弧菌O_1快速诊断试纸条检测法临床验证报告（论文提纲范文）
（1）CRISPR/Cas12a系统在新冠病毒和金黄色葡萄球菌即时检测中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 致病微生物的危害与现状 |
| 1.1.1 传染性病毒简介 |
| 1.1.2 食源性致病细菌简介 |
| 1.2 致病微生物的检测技术 |
| 1.2.1 SARS-CoV-2 |
| 1.2.2 金黄色葡萄球菌 |
| 1.3 即时检测 |
| 1.3.1 即时检测概述 |
| 1.3.2 即时检测技术分类 |
| 1.4 基于CRISPR/Cas检测技术简介 |
| 1.4.1 CRISPR/Cas系统简介 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas检测技术 |
| 1.5 论文的研究意义及内容 |
| 2 基于CRISPR/Cas12a技术的SARS-CoV-2荧光检测平台 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要病毒株 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.2.3 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 样品处理及病毒RNA提取 |
| 2.3.2 检测靶标的选择、引物的设计 |
| 2.3.3 crRNA的设计与转录 |
| 2.3.4 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 2.3.5 CRISPR/Cas12a检测反应体系的优化 |
| 2.3.6 CRISPR/Cas12a检测的可行性研究及最优检测位点的选择 |
| 2.3.7 SARS-CoV-2 CRISPR-fluorescence检测方法的建立与灵敏度表征 |
| 2.3.8 临床样本的CRISPR-fluorescence检测 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 2.4.2 CRISPR/Cas12a检测反应体系的优化 |
| 2.4.3 CRISPR/Cas12a检测体系最优检测位点的选择 |
| 2.4.4 SARS-CoV-2 CRISPR-fluorescence检测方法的建立与灵敏度表征 |
| 2.4.5 临床样本的CRISPR-fluorescence检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 基于CRISPR/Cas12a技术的金黄色葡萄球菌荧光检测平台 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要菌株 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.2.3 主要培养基 |
| 3.2.4 主要药品和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌种保藏、活化和培养 |
| 3.3.2 金黄色葡萄球菌计数方法 |
| 3.3.3 样品处理 |
| 3.3.4 特异性靶标的选择、引物的设计 |
| 3.3.5 crRNA的设计与转录 |
| 3.3.6 CRISPR/Cas12a的顺式切割活性验证 |
| 3.3.7 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 3.3.8 基于PCR的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.3.9 基于RAA的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.3.10 金黄色葡萄球菌CRISPR-fluorescence检测系统灵敏度试验 |
| 3.3.11 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的检测系统构建及灵敏度表征 |
| 3.3.12 其他人工污染食品检测 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 CRISPR/Cas12a的顺式切割活性验证 |
| 3.4.2 CRISPR/Cas12a的反式切割活性验证 |
| 3.4.3 基于PCR的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.4.4 基于RAA的CRISPR-fluorescence检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 3.4.5 金黄色葡萄球菌CRISPR-fluorescence检测系统灵敏度试验 |
| 3.4.6 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的检测系统构建及灵敏度表征 |
| 3.4.7 其他人工污染食品的CRISPR-fluorescence检测 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 基于CRISPR/Cas12a技术的金黄色葡萄球菌POCT检测平台 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要菌株 |
| 4.2.2 实验仪器与设备 |
| 4.2.3 主要培养基 |
| 4.2.4 主要药品和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌种保藏、活化和培养 |
| 4.3.2 金黄色葡萄球菌计数方法 |
| 4.3.3 样品处理 |
| 4.3.4 特异性靶标的选择、引物的设计 |
| 4.3.5 crRNA的设计与转录 |
| 4.3.6 胶体金试纸条的反应条件优化 |
| 4.3.7 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 4.3.8 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的特异性表征 |
| 4.3.9 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的CRISPR-LF检测系统构建及灵敏度表征 |
| 4.3.10 其他人工污染食品检测 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 胶体金试纸条反应条件的优化 |
| 4.4.2 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的建立及灵敏度表征 |
| 4.4.3 金黄色葡萄球菌CRISPR-LF检测方法的特异性表征 |
| 4.4.4 人工金黄色葡萄球菌污染牛奶的CRISPR-LF检测系统构建及灵敏度表征 |
| 4.4.5 其他人工污染食品的CRISPR-LF检测 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者攻读硕士学位期间发表论文 |
（2）应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1 章 旋毛虫及旋毛虫病研究进展 |
| 1.1 旋毛虫及其生活史 |
| 1.2 旋毛虫病 |
| 1.3 旋毛虫检测方法的研究进展 |
| 第2 章 SERS在生物检测中的概况及应用 |
| 2.1 SERS概况 |
| 2.2 SERS在生物检测中的应用 |
| 第3章 UCP-ICA在生物检测中的概况及应用 |
| 3.1 UCP概况 |
| 3.2 UCP-ICA在生物检测中的应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1 章 基于SERS建立旋毛虫病快速筛查模型及评价 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物和旋毛虫 |
| 1.1.2 主要试剂、耗材 |
| 1.1.3 主要实验仪器 |
| 1.1.4 主要溶液的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 旋毛虫ML收集 |
| 1.2.2 旋毛虫感染模型构建和血清样本制备 |
| 1.2.3 银纳米颗粒制备和表征 |
| 1.2.4 血清SERS光谱测量和收集 |
| 1.2.5 光谱数据处理和多元统计分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 旋毛虫ML收集后鉴定 |
| 1.3.2 银纳米颗粒表征结果 |
| 1.3.3 SERS测试结果 |
| 1.3.4 血清SERS多元统计分析 |
| 1.3.5 血清SERS官能团发掘 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 SERS光谱 |
| 1.4.2 统计分析 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 旋毛虫UCP-ICA制备及其优化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 旋毛虫虫种和实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂、耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 旋毛虫ML收集及其ES抗原制备 |
| 2.2.2 旋毛虫ML-ES抗原鉴定 |
| 2.2.3 UCNPs-ES/山羊抗兔IgG制备与表征 |
| 2.2.4 旋毛虫UCP-ICA建立与优化 |
| 2.2.5 Ts-UCP-ICA的操作流程 |
| 2.2.6 阈值(cut-off)确立 |
| 2.2.7 Ts-UCP-ICA检测不同感染剂量阳性血清的效果评价 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 旋毛虫ML-ES抗原的鉴定结果 |
| 2.3.2 UCNPs-ES/山羊抗兔IgG偶联表征 |
| 2.3.3 Ts-UCP-ICA建立与优化 |
| 2.3.4 Ts-UCP-ICA-cut-off值确定 |
| 2.3.5 Ts-UCP-ICA检测不同感染剂量阳性血清的结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 Ts-UCP-ICA评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Ts-UCP-ICA制备 |
| 3.2.2 特异性分析 |
| 3.2.3 单盲测试分析 |
| 3.2.4 一致性评价 |
| 3.2.5 稳定性分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 特异性分析结果 |
| 3.3.2 单盲测试结果 |
| 3.3.3 一致性评价 |
| 3.3.4 稳定性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）RT-qsCPA及CPAP可视化方法快速检测副溶血弧菌体系建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 立题背景及意义 |
| 1.2 副溶血弧菌概述 |
| 1.2.1 弧菌属分类 |
| 1.2.2 副溶血弧菌生物学特性 |
| 1.2.3 副溶血弧菌血清型分类 |
| 1.2.4 副溶血弧菌致病因子及危害 |
| 1.3 副溶血弧菌快速检测技术的研究进展 |
| 1.3.1 传统分离鉴定 |
| 1.3.2 免疫学检测方法 |
| 1.3.3 分子生物学检测方法 |
| 1.4 交叉引物扩增技术(Cross-priming Amplification,CPA) |
| 1.4.1 CPA概述 |
| 1.4.2 CPA基本原理 |
| 1.4.3 CPA引物设计 |
| 1.4.4 CPA特点 |
| 1.4.5 CPA产物检测方法 |
| 1.4.6 CPA应用 |
| 1.5 磷酸根检测方法 |
| 1.6 研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.1.3 主要培养基及引物稀释 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 菌种培养 |
| 2.2.2 模板DNA提取 |
| 2.2.3 菌株鉴定及模板量确定 |
| 2.2.4 CPA反应引物的设计与合成 |
| 2.2.5 RT-qsCPA反应的初步建立及可行性验证 |
| 2.2.6 RT-qsCPA反应条件优化 |
| 2.2.7 引物碱基数对RT-qsCPA反应的影响 |
| 2.2.8 不同纳米粒子对RT-qsCPA扩增效率的影响 |
| 2.2.9 副溶血弧菌RT-qsCPA反应的灵敏度及特异性试验 |
| 2.2.10 副溶血弧菌CPAP可视化检测方法的建立及可行性验证 |
| 2.2.11 副溶血弧菌CPAP可视化检测方法的条件优化 |
| 2.2.12 副溶血弧菌CPAP可视化检测方法的灵敏度及特异性试验 |
| 2.2.13 CPAP可视化检测法与磷酸试纸条的Pi产物检测对比 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 菌株的鉴定 |
| 3.2 副溶血弧菌RT-qsCPA检测法的可行性验证 |
| 3.3 副溶血弧菌RT-qsCPA检测的条件优化 |
| 3.3.1 内引物2a和3a的浓度比例优化 |
| 3.3.2 交叉引物CP的浓度优化 |
| 3.3.3 内引物2a和3a的浓度优化 |
| 3.3.4 甜菜碱浓度优化 |
| 3.3.5 MgSO4 浓度优化 |
| 3.3.6 dNTPs浓度优化 |
| 3.3.7 反应温度优化 |
| 3.4 引物碱基数对RT-qsCPA反应的影响 |
| 3.4.1 交叉引物CP中1s区碱基数对扩增反应的影响 |
| 3.4.2 内引物3a碱基数对扩增反应的影响 |
| 3.4.3 内引物2a碱基数对RT-qsCPA扩增反应的影响 |
| 3.5 不同纳米粒子对RT-qsCPA扩增效率的影响 |
| 3.5.1 不同浓度纳米粒子对RT-qsCPA扩增效率的影响 |
| 3.5.2 不同种类纳米颗粒对RT-qsCPA扩增效率的影响 |
| 3.6 副溶血弧菌RT-qsCPA检测方法的灵敏度及特异性试验 |
| 3.6.1 副溶血弧菌RT-qsCPA检测方法的灵敏度及检测限 |
| 3.6.2 副溶血弧菌RT-qsCPA检测方法的特异性试验 |
| 3.7 副溶血弧菌CPAP可视化检测方法的可行性验证 |
| 3.7.1 CPAP体系中扩增特异性Pi信号检测 |
| 3.7.2 CPAP体系中非扩增特异性Pi信号的检测 |
| 3.8 副溶血弧菌CPAP可视化检测方法的条件优化 |
| 3.8.1 显色反应中样品稀释倍数优化 |
| 3.8.2 甜菜碱浓度优化 |
| 3.8.3 MgSO_4 浓度优化 |
| 3.8.4 dNTPs浓度优化 |
| 3.8.5 Bst2.0 DNA聚合酶酶量优化 |
| 3.8.6 PPase酶量优化 |
| 3.8.7 反应时间优化 |
| 3.8.8 钼酸铵浓度优化 |
| 3.8.9 酒石酸锑钾浓度优化 |
| 3.8.10 H_2SO_4 浓度优化 |
| 3.8.11 抗坏血酸(Vc)浓度优化 |
| 3.9 副溶血弧菌CPAP可视化检测方法的灵敏度及特异性试验 |
| 3.9.1 副溶血弧菌CPAP可视化检测方法的灵敏度及检测限 |
| 3.9.2 副溶血弧菌CPAP可视化检测方法的特异性验证 |
| 3.10 CPAP可视化检测法与磷酸试纸条的Pi产物检测的对比 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 靶基因的选择 |
| 4.2 引物的设计 |
| 4.3 副溶血弧菌RT-qsCPA检测方法及CPAP可视化检测方法的优化 |
| 4.3.1 甜菜碱浓度 |
| 4.3.2 Mg2+浓度 |
| 4.3.3 dNTPs浓度 |
| 4.3.4 引物碱基数对RT-qsCPA检测效率的影响 |
| 4.3.5 纳米粒子对检测效率的影响 |
| 4.3.6 显色试剂成分浓度优化 |
| 4.4 RT-qsCPA法与常规凝胶电泳结果的比较 |
| 4.5 CPAP可视化检测方法与磷酸根试纸条对Pi产物检测结果的比较 |
| 4.6 本研究建立的两种基于CPA反应的检测方法的比较 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间发表文章 |
（4）基于荧光微球的食源性致病菌免疫检测方法的建立及评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 常见食源性致病菌 |
| 1.1.1 单核细胞增生李斯特菌 |
| 1.1.2 副溶血性弧菌 |
| 1.1.3 沙门氏菌 |
| 1.1.4 大肠杆菌 |
| 1.1.5 阪崎肠杆菌 |
| 1.1.6 其它食源性致病菌 |
| 1.2 我国食源性致病菌污染现状 |
| 1.3 食源性致病菌检测方法研究进展 |
| 1.3.1 传统检测方法 |
| 1.3.2 基于免疫学的检测方法 |
| 1.3.2.1 酶联免疫吸附检测方法 |
| 1.3.2.2 免疫荧光技术 |
| 1.3.2.3 免疫层析技术 |
| 1.3.2.4 免疫磁珠分离技术 |
| 1.3.3 生物传感技术 |
| 1.3.4 基于核酸的检测方法 |
| 1.4 荧光微球及其在食源性致病菌检测中的应用 |
| 1.4.1 荧光微球的制备方法 |
| 1.4.2 荧光微球在食源性致病菌检测中的应用 |
| 1.5 本研究的目的意义和主要内容 |
| 第二章 几种食源性致病菌多克隆抗体的制备及配对筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器设备 |
| 2.2.1 实验动物与所需菌种 |
| 2.2.2 实验用抗体 |
| 2.2.3 所需培养基 |
| 2.2.4 主要溶液及试剂 |
| 2.2.5 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 抗体的制备 |
| 2.3.2 效价测定 |
| 2.3.3 抗体的纯化 |
| 2.3.4 抗体的HRP标记 |
| 2.3.5 抗体的配对筛选 |
| 2.3.6 抗体对特异性分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 三种食源性致病菌抗血清纯化后抗体的效价 |
| 2.4.2 HRP标记后抗体的工作浓度 |
| 2.4.3 抗体配对分析 |
| 2.4.4 抗体对特异性分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 磁珠的筛选、免疫磁珠的制备及应用条件研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及实验仪器 |
| 3.2.1 实验所用抗体及菌种 |
| 3.2.2 实验所用磁珠 |
| 3.2.3 实验所需试剂 |
| 3.2.4 主要仪器设备 |
| 3.2.5 缓冲液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 磁性微球的筛选 |
| 3.3.1.1 磁性微球与抗体的偶联方法 |
| 3.3.1.2 偶联过程中蛋白质浓度的测定方法 |
| 3.3.1.3 磁性微球性能观察 |
| 3.3.1.4 不同抗体浓度对微球偶联的影响 |
| 3.3.2 磁性微球的粒径分布 |
| 3.3.3 免疫磁珠的应用条件 |
| 3.3.3.1 免疫磁珠添加量对致病菌捕获率的影响 |
| 3.3.3.2 捕获时间对捕获率的影响 |
| 3.3.3.3 不同食品基质对免疫磁珠捕获率的影响 |
| 3.3.3.4 食品基质稀释倍数对免疫磁珠捕获率的影响 |
| 3.3.4 数据处理 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 BCA测定蛋白标准曲线 |
| 3.4.2 磁珠的筛选及磁珠性状分析 |
| 3.4.3 微球上抗体的偶联量 |
| 3.4.4 磁珠添加量对致病菌捕获率的影响 |
| 3.4.5 捕获时间对捕获率的影响 |
| 3.4.6 不同食品基质对免疫磁珠捕获率的影响 |
| 3.4.7 基质的稀释倍数对免疫磁珠捕获的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 基于荧光微球的免疫层析平台的建立及评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验菌种及抗体对 |
| 4.2.2 主要试剂及仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 FM与抗体偶联 |
| 4.3.2 ICA试纸条的制备 |
| 4.3.3 FM-ICA检测程序 |
| 4.3.4 FM-ICA试纸条优化 |
| 4.3.3.1 FM上偶联抗体量对检测的影响 |
| 4.3.3.2 FM-pab的稀释倍数 |
| 4.3.3.3 T线抗体浓度对检测的影响 |
| 4.3.3.4 层析时间对检测的影响 |
| 4.3.5 FM-ICA检测评价 |
| 4.3.4.1 LOD、LOQ及线性关系 |
| 4.3.4.2 FM-ICA回收率 |
| 4.3.4.3 FM-ICA精密度 |
| 4.3.4.4 FM-ICA稳定性 |
| 4.3.4.5 FM-ICA特异性 |
| 4.3.4.6 FM-ICA对模拟样品检测 |
| 4.3.6 数据处理 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 FM与抗体的偶联 |
| 4.4.2 FM-ICA试纸条优化 |
| 4.4.2.1 抗体标记浓度 |
| 4.4.2.2 FM-pab的稀释倍数 |
| 4.4.2.3 T线抗体浓度对检测的影响 |
| 4.4.2.4 T值、C值及HT/HC值随层析时间的动力学变化 |
| 4.4.3 试纸条性能评价 |
| 4.3.3.1 敏感性评价 |
| 4.3.3.2 回收率评价 |
| 4.3.3.3 精密度分析 |
| 4.3.3.4 稳定性评价 |
| 4.3.3.5 特异性评价 |
| 4.4.4 食品基质对FM-ICA检测的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 FM-ICA检测的敏感性 |
| 4.5.2 FM-ICA检测的准确度 |
| 4.5.3 食品基质对FM-ICA检测的影响 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 FM-ICA+IMS快速检测食品中的鼠伤寒沙门氏菌 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.1.1 实验菌株及培养条件 |
| 5.2.1.2 试剂及仪器 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.2.2.1 磁性微球与抗体偶联 |
| 5.2.2.2 荧光微球与抗体偶联 |
| 5.2.2.3 FM-ICA试纸条的制备 |
| 5.2.2.4 IMB洗脱方式 |
| 5.2.2.5 FM-ICA+IMS对模拟样本的定性检测 |
| 5.2.2.6 IMB+FM-ICA对模拟样本低浓度鼠伤寒沙门氏菌的特异性 |
| 5.2.2.7 IMB+FM-ICA对自然存在样本检测的可行性分析 |
| 5.2.2.8 数据处理 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 FM-ICA制备 |
| 5.3.2 不同洗脱剂对IMB洗脱比较 |
| 5.3.3 不同洗脱时间对IMB洗脱率的影响 |
| 5.3.4 FM-ICA+IMS的模拟检测 |
| 5.3.5 FM-ICA+IMS在低浓度食物样本中的特异性 |
| 5.3.6 FM-ICA+IMS在自然状态下食物样本中的检测 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 基于荧光微球的免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速检测E.coliO157:H774 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.1.1 实验菌株 |
| 6.2.1.2 实验试剂及仪器设备 |
| 6.2.1.3 主要溶液的配制 |
| 6.2.2 免疫磁珠的制备 |
| 6.2.3 免疫磁珠的优化 |
| 6.2.4 FM-ICA的制备 |
| 6.2.4.1 荧光微球与抗体偶联 |
| 6.2.4.2 ICA试纸条的制备 |
| 6.2.4.3 FM-ICA检测程序 |
| 6.2.4.4 FM-ICA性能评价 |
| 6.2.4.5 IMS-FICA检测模拟样本 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 免疫磁珠的制备与优化 |
| 6.3.2 FM-ICA试纸条的制备 |
| 6.3.3 FM-ICA评价 |
| 6.3.3.1 敏感性分析 |
| 6.3.3.2 特异性分析 |
| 6.3.3.3 准确度与精密度分析 |
| 6.3.3.4 稳定性分析 |
| 6.3.4 IMS+FICA对食品样本的模拟检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 CdSe/ZnS-聚苯乙烯荧光微球的制备及在副溶血弧菌快速检测中的应用 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 实验材料与方法 |
| 7.2.1 实验材料及试剂 |
| 7.2.2 实验菌株 |
| 7.2.3 实验所需仪器 |
| 7.2.4 实验方法 |
| 7.2.4.1 量子点的合成方法 |
| 7.2.4.2 CdSe/ZnS-聚苯乙烯荧光微球的合成 |
| 7.2.4.3 QD-PS荧光微球与抗体偶联 |
| 7.2.4.4 免疫层析卡的制备 |
| 7.2.4.5 QD-PS-ICA检测评价 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 QD的合成结果 |
| 7.3.2 QD的包裹 |
| 7.3.3 QD-PS-ICA评价 |
| 7.3.3.1 QD-PS-ICA对菌液检测的敏感性分析 |
| 7.3.3.2 QD-PS-ICA检测准确度和精密度分析 |
| 7.3.3.3 QD-PS-ICA检测特异性分析 |
| 7.3.3.4 QD-PS-ICA检测稳定性分析 |
| 7.3.3.5 不同食品基质对QD-PS-ICA检测的影响 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、本论文的主要创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）艰难梭菌—GDH的原核表达、纯化与胶体金免疫层析检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 英汉缩略词名词对照 第一章 文献综述 |
| 1.1 艰难梭菌 |
| 1.1.1 艰难梭菌概述 |
| 1.1.2 艰难梭菌流行现状 |
| 1.1.3 艰难梭菌感染的病理机制 |
| 1.1.4 艰难梭菌的诊断、治疗、与预防 |
| 1.1.5 艰难梭菌检测抗原-谷氨酸脱氢酶 |
| 1.1.6 小结 |
| 1.2 胶体金免疫层析检测方法研究进展 |
| 1.2.1 胶体金免疫层析检测方法概述 |
| 1.2.2 胶体金免疫层析技术的基本原理以及特点 |
| 1.2.3 胶体金免疫层析技术在疾病诊断中的应用 |
| 1.2.4 小结 |
| 1.3 研究目的与意义 第二章 谷氨酸脱氢酶的原核表达与多抗制备 |
| 2.1 主要材料 |
| 2.1.1 主要试剂及材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 重组蛋白的原核表达 |
| 2.2.2 多抗制备 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 GDH的原核表达 |
| 2.3.2 多抗制备与纯化 第三章 胶体金免疫层析检测方法的建立 |
| 3.1 主要材料 |
| 3.1.1 主要试剂及耗材 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 胶体金的制备 |
| 3.2.2 金标抗体的制备与优化 |
| 3.2.3 各组分预处理 |
| 3.2.4 NC膜包被抗体浓度的优化 |
| 3.2.5 试纸条的组装 |
| 3.2.6 试纸条的检测方法与结果判断 |
| 3.2.7 验证性实验 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 胶体金制备 |
| 3.3.2 金标抗体的制备 |
| 3.3.3 各组分预处理 |
| 3.3.4 NC膜包被抗体浓度的优化 |
| 3.3.4.1 T 线抗体包被浓度优化 |
| 3.3.4.2 C线抗体包被浓度优化 |
| 3.3.5 验证性实验 第四章 全文讨论 第五章 实验结论 参考文献 致谢 附录 个人简历 |
（6）一种新型核酸恒温扩增方法的研究及其在现场检测中的应用（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1. 病原微生物常用鉴定方法 |
| 2. 恒温核酸扩增技术简介 |
| 3. 常用的扩增结果检测方法简介 |
| 4. 核酸检测中样本处理的研究现状 |
| 5. 本研究的意义与主要研究内容 |
| 第二章 聚合酶螺旋反应 |
| 1. 聚合酶螺旋反应的引物设计思路 |
| 2. 聚合酶螺旋反应的扩增原理 |
| 3. 聚合酶螺旋反应的验证 |
| 4. 聚合酶螺旋反应的优化 |
| 5. 气溶胶污染的防止 |
| 第三章 聚合酶螺旋反应结果可视化研究 |
| 1. 钙黄绿素（Calcein）作指示剂 |
| 2. 羟基萘酚蓝作指示剂 |
| 3. 基于pH变化的颜色判读 |
| 4. 用SYBR Green I作指示剂的颜色判读 |
| 第四章 生物样本核酸的快速提取 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第五章 便携式PSR检测仪的研制 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第六章 基于聚合酶螺旋反应的快速检测技术平台 |
| 第七章 聚合酶螺旋反应在细菌检测中的应用 |
| 1. PSR在肺炎克雷伯杆菌中的应用 |
| 1.1 肺炎克雷伯杆菌简介 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 2. PSR在铜绿假单胞菌检测中的应用 |
| 2.1 铜绿假单胞菌简介 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第八章 聚合酶螺旋反应在快速检测真菌中的应用 |
| 1. 白色念珠菌简介 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第九章 聚合酶螺旋反应在病毒检测中的应用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第十章 聚合酶螺旋反应在烈性传染病检测中的应用 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 主要化学试剂及仪器品牌 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）一种快速筛查金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析方法的建立（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 2结果 |
| 3讨论 |
（8）两种海洋病原微生物快速检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 海洋中主要的病原微生物 |
| 1.1.1 海洋环境 |
| 1.1.2 海洋病原微生物的来源 |
| 1.1.3 海洋病原微生物的种类及危害 |
| 1.1.4 副溶血性弧菌研究进展 |
| 1.1.5 锯缘青蟹呼肠孤病毒研究进展 |
| 1.2 海洋病原微生物检测技术 |
| 1.2.1 免疫学方法 |
| 1.2.2 分子学方法 |
| 1.2.3 其他方法 |
| 1.3 本研究的目的与意义 |
| 第2章 CPA-核酸试纸条法快速检测副溶血性弧菌方法的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验主要试剂 |
| 2.1.3 主要实验仪器表 |
| 2.1.4 主要试剂及培养基的配制 |
| 2.1.5 引物及探针的设计 |
| 2.1.6 副溶血性弧菌tlh基因重组克隆质粒的构建 |
| 2.1.7 CPA扩增引物和探针的可行性验证 |
| 2.1.8 CPA扩增产物的检测 |
| 2.1.9 CPA反应体系及反应条件的优化 |
| 2.1.10 CPA法检测特异性和灵敏度的确定 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 副溶血性弧菌tlh基因片段阳性克隆质粒的构建及验证 |
| 2.2.2 副溶血性弧菌CPA法扩增体系的初步建立 |
| 2.2.3 反应体系的优化结果 |
| 2.2.4 CPA法检测副溶血性弧菌特异性分析 |
| 2.2.5 CPA法与传统PCR法检测灵敏度的比较 |
| 2.3 分析与讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 引物设计 |
| 3.1.3 重组克隆质粒构建 |
| 3.1.4 青蟹呼长孤病毒VP12蛋白序列生物信息学分析 |
| 3.1.5 重组表达质粒的构建 |
| 3.1.6 重组蛋白的诱导表达、纯化及免疫印迹分析 |
| 3.1.7 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12多克隆抗体的制备 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 重组克隆质粒的验证 |
| 3.2.2 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12结构特征 |
| 3.2.3 重组表达质粒的构建及验证 |
| 3.2.4 重组蛋白的诱导表达、纯化及免疫印迹分析 |
| 3.2.5 多克隆抗体的制备 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 锯缘青蟹呼长孤病毒外壳蛋白VP12单克隆抗体的制备 |
| 4.1 实验材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 小鼠免疫 |
| 4.1.3 细胞融合 |
| 4.1.4 阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆 |
| 4.1.5 杂交瘤细胞的冻存及复苏 |
| 4.1.6 腹水的制备 |
| 4.1.7 Dot blotting检测抗体灵敏度 |
| 4.1.8 腹水单克隆抗体的纯化 |
| 4.1.9 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 4.1.10 间接ELISA法测定单克隆抗体效价 |
| 4.1.11 单克隆抗体的Western blotting分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 骨髓瘤细胞的准备 |
| 4.2.2 融合细胞的鉴定 |
| 4.2.3 Dot blotting分析 |
| 4.2.4 单克隆抗体 1M9和 2N5纯化效果的SDS-PAGE电泳分析 |
| 4.2.5 单克隆抗体亚类的鉴定 |
| 4.2.6 抗体效价的测定 |
| 4.2.7 抗体的Western blotting分析 |
| 4.3 分析与讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 免疫胶体金试纸条检测方法的建立 |
| 5.1 实验材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 胶体金颗粒的制备 |
| 5.1.3 胶体金与金标抗体最佳标记条件的确定 |
| 5.1.4 胶体金探针的制备及纯化 |
| 5.1.5 金标垫的预处理 |
| 5.1.6 金标垫、检测线、质控线上抗体最佳喷涂量的确定 |
| 5.1.7 封闭液的确定 |
| 5.1.8 试纸条的组装 |
| 5.1.9 试纸条的使用方法及结果判读 |
| 5.1.10 试纸条检测灵敏度确定 |
| 5.1.11 试纸条检测特异性验证 |
| 5.2 结果分析 |
| 5.2.1 胶体金质量的鉴定 |
| 5.2.2 单克隆抗体与胶体金标记的最佳pH |
| 5.2.3 单克隆抗体与胶体金标记最低标记量 |
| 5.2.4 金标垫处理液的选择 |
| 5.2.5 金标抗体稀释浓度 |
| 5.2.6 NC膜封闭液的优化 |
| 5.2.7 NC膜上最低抗体包被浓度的确定 |
| 5.2.8 试纸条灵敏度的验证 |
| 5.2.9 试纸条特异性的验证 |
| 5.3 分析与讨论 |
| 5.4 结论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 本论文的主要结论 |
| 6.2 本论文的主要创新点 |
| 6.3 本论文的研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在学期间发表的学术论文 |
（9）黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 黄海希瓦氏菌的研究进展 |
| 1.1 黄海希瓦氏菌的分类地位及生物学特性 |
| 1.2 黄海希瓦氏菌的感染症状及致病性 |
| 1.3 黄海希瓦氏菌的诊断方法 |
| 2 胶体金免疫层析技术在水产养殖界中的推广及应用 |
| 2.1 胶体金免疫层析（GICA）的原理 |
| 2.2 胶体金免疫层析技术在水产养殖业中的应用 |
| 2.2.1 胶体金免疫层析技术在水产动物病原微生物检测中的应用 |
| 2.2.2 胶体金免疫层析技术在水产动物药物残留检测中的应用 |
| 2.2.3 胶体金免疫层析技术在水产养殖其他领域中的应用 |
| 第二章 黄海希瓦氏菌单克隆抗体的生产、纯化及特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 抗原的制备 |
| 1.2.2 单克隆抗体的生产 |
| 1.2.3 单克隆抗体的纯化、浓度鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 杂交瘤细胞培养上清效价的测定 |
| 2.2 杂交瘤细胞培养的特异性检测 |
| 2.3 腹水效价的测定 |
| 2.4 抗黄海希瓦氏菌单克隆抗体的纯度鉴定及浓度测定 |
| 2.5 纯化后抗体效价的测定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 黄海希瓦氏菌多克隆抗体的生产、纯化及制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 抗原的制备 |
| 1.2.2 多克隆抗体的制备 |
| 1.2.3 多克隆抗体的纯化及特性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 未纯化多克隆抗体效价测定 |
| 2.2 纯化后多克隆抗体的纯度及蛋白浓度 |
| 2.3 纯化后多克隆抗体效价测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 胶体金免疫体系的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 单抗—胶体金复合物的制备及纯化 |
| 1.2.2 金标垫、检测线及质控线上抗体最适喷涂量的确定 |
| 2 结果 |
| 2.1 金标单抗的制备及纯化 |
| 2.1.1 胶体金标记抗体最低稳定量的测定 |
| 2.1.2 胶体金标记抗体最适 pH 的测定 |
| 2.2 胶体金单抗活性检测 |
| 2.3 金标垫及检测线及质控线上抗体最适喷涂量的确定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 胶体金试纸条的组装及评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的组装 |
| 1.2.2 试纸条检测结果的判定 |
| 1.2.3 黄海希瓦氏菌胶体金试纸条性能评价 |
| 2 结果 |
| 2.1 试纸条对单菌悬液灵敏度、特异性的测定 |
| 2.2 试纸条对混合菌悬液特异性及灵敏度的检测 |
| 2.3 人工增菌实验 |
| 2.4 试纸条的稳定性检测 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及发明专利 |
| 致谢 |
（10）副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus O3:K6大流行克隆的溯源（论文提纲范文）
| 1 副溶血性弧菌的发现历程及传播 |
| 1.1 副溶血性弧菌的发现及危害 |
| 1.2 我国首株分离株的形态及生理生化特性 |
| 1.3 传播途径 |
| 2 O3:K6的变异分子流行病学特征 |
| 2.1 血清型及其多样性 |
| 2.2 分子分型 |
| 2.3 分子进化 |
| 2.4 致病机制 |
| 3 O3:K6大流行克隆在中国的分布 |
| 4 检测方法 |
| 5 结论与展望 |
四、霍乱弧菌O_1快速诊断试纸条检测法临床验证报告（论文参考文献）
- [1]CRISPR/Cas12a系统在新冠病毒和金黄色葡萄球菌即时检测中的应用[D]. 钱佳婕. 浙江大学, 2021(02)
- [2]应用表面增强拉曼光谱和上转换发光免疫层析技术检测旋毛虫的研究[D]. 李健. 吉林大学, 2021
- [3]RT-qsCPA及CPAP可视化方法快速检测副溶血弧菌体系建立[D]. 李雪彤. 沈阳农业大学, 2019(02)
- [4]基于荧光微球的食源性致病菌免疫检测方法的建立及评价[D]. 李倩茹. 华南理工大学, 2018(05)
- [5]艰难梭菌—GDH的原核表达、纯化与胶体金免疫层析检测方法的建立[D]. 任永鑫. 黑龙江八一农垦大学, 2018(08)
- [6]一种新型核酸恒温扩增方法的研究及其在现场检测中的应用[D]. 董德荣. 中国人民解放军军事医学科学院, 2016(11)
- [7]一种快速筛查金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析方法的建立[J]. 史咏梅,何晖,谭华,冯子力,伍碧梅,朱海,涂承宁,唐明慧,杨泽,汪海波. 中国国境卫生检疫杂志, 2015(03)
- [8]两种海洋病原微生物快速检测技术的研究[D]. 徐苗苗. 集美大学, 2015(05)
- [9]黄海希瓦氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制[D]. 刘志强. 大连海洋大学, 2014(08)
- [10]副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus O3:K6大流行克隆的溯源[J]. 徐苗苗,刘静雯. 微生物学通报, 2014(10)