一、微载体粘附培养的肝细胞腹腔内移植治疗急性肝功能衰竭大鼠的实验研究（论文文献综述）
焦智慧[1]（2020）在《ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究》文中指出肝脏是哺乳动物最大的实质器官,具有加工储存营养物质、代谢药物毒物、分泌胆汁、合成蛋白质等重要功能。肝脏缺血再灌注损伤是外科手术中常见的一种临床综合征,20世纪90年代出现了腹腔镜的肝切除术,腹腔镜手术可以最大程度的减少腹壁神经和肌肉的损伤,减少出血、术后疼痛和粘连,加快手术恢复。尽管采用微创外科手术,在肝切除、肝移植、出血性休克等临床手术中仍不可避免的出现肝脏缺血再灌注损伤,严重会导致肝炎以及术后肝功能的衰竭。对于晚期肝功能不全的有效治疗办法是原位肝移植,但也面临着器官短缺,费用昂贵、免疫排斥和移植并发症等问题,因此,寻找能够减轻肝脏缺血再灌注损伤以及提高肝脏再生能力的安全有效的治疗办法是目前肝脏外科亟待解决的问题之一。脂肪间充质干细胞（ADSCs）能够自我更新、具有多向分化能力、来源丰富、取材损伤小,是目前细胞疗法理想的种子细胞。ADSCs主要依靠分化和旁分泌发挥作用,旁分泌指干细胞释放的多种生物因子在微环境里通过细胞基质在局部以及临近组织对靶细胞发挥的生物学作用。随着对旁分泌机制的深入研究,发现ADSCs分泌的多种细胞因子具有促进血管生成,抑制炎症反应,调节免疫应答,修复组织再生等多种生物学功能。ADSCs在体外培养的过程中,会将细胞因子等生物活性物质分泌到培养液中,这种含有细胞分泌物的培养液为脂肪间充质干细胞的条件培养液（ADSC-CM）。尽管ADSCs在临床上对许多疾病有治疗效果,但ADSCs具有免疫原性,对植入ADSCs的不可控分化仍是重要的安全隐患。因此,使用ADSC-CM的无细胞疗法成为绕过细胞疗法局限性的一种再生医学治疗方法。目前有关肝脏缺血再灌注损伤的动物模型以啮齿类动物为主,而从比较医学角度,小型猪与人的同源性好,体积大小以及器官大小与人更为接近,因此也作为研究缺血再灌注损伤理想的实验动物,所获得的研究数据更有价值,易于临床转化。而ADSC-CM在大型实验动物的研究较少,特别是肝脏领域尚未见报道,所以本研究旨在通过建立小型猪肝脏缺血再灌注合并部分切除模型,探究ADSC-CM治疗肝脏缺血再灌注合并部分切除损伤的疗效,为比较医学开展肝病治疗,拓宽ADSC-CM移植领域提供研究依据。本研究使用30头小型猪,其中6头用于脂肪组织的获取。采用胶原酶消化法分离培养ADSCs,使用诱导培养基和特定染色鉴定ADSCs成脂、成骨、成肝分化能力,应用细胞流式鉴定ADSCs表面特异性抗原。ADSCs饥饿培养48 h获得ADSC-CM,经3 kda超滤管离心浓缩ADSC-CM用于后续实验。另外24头小型猪随机分为四组:模型组（IRI）,DMEM对照组（DMEM）,脂肪间充质干细胞组（ADSCs）,脂肪间充质干细胞条件培养基组（CM）,每组6头。四组实验动物均通过腹腔镜手术建立肝脏缺血再灌注合并部分肝切除模型,IRI组通过肝实质注射生理盐水,DMEM组注射基础培养基,ADSCs组注射脂肪间充质干细胞,数量为1×106/kg,CM组按照1×106/kg细胞数提取等量干细胞分泌的条件培养液,注射浓缩的ADSC-CM进行干预。分别在术前、术后1 d、3 d、7 d采集血液样本及肝组织样本用于相关指标的检测。通过HE染色观察病理组织学变化,透射电镜观察超微结构的变化,血常规检测外周血的炎性细胞变化,试剂盒检测抗氧化酶以及细胞凋亡酶活性,TUNEL染色检测凋亡细胞的阳性率,ELISA法检测血清中炎症相关因子、再生相关因子以及ADSC-CM成分,q RT-PCR法检测炎症、凋亡以及再生相关基因水平变化,Western Blot法检测肝组织中凋亡以及再生相关蛋白水平的变化,免疫组化染色检测凋亡相关蛋白以及再生相关蛋白水平的变化。本研究结果如下:（1）病理组织学与超微结构变化:术后各组肝小叶结构被破坏,肝索排列紊乱,肝细胞空泡变性明显,炎性细胞浸润,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预明显减少空泡变性和炎性细胞浸润;术后IRI组和DMEM组肝细胞内质网严重扩张,细胞核膜皱缩,染色质边集化,ADSCs或ADSC-CM干预改善了内质网扩张及肝细胞核膜皱缩的程度。（2）肝脏功能变化:术后各组ALT、AST、LDH、ALP和T-BIL均升高,TP呈降低趋势,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预明显降低了ALT、AST、LDH、ALP和T-BIL的升高程度,缓解了TP的降低程度,促进肝脏功能的恢复。（3）氧化应激指标变化:术后各组肝组织抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD活性显着降低,MPO酶活性和MDA含量显着升高,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预显着增强了抗氧化酶的活性,降低MPO酶活性,并能减少氧化产物MDA的水平,从而减少术后的氧化应激反应,且两个干预组的上述氧化应激指标均无显着性差异。（4）炎症指标变化:术后外周血中炎性细胞WBC、NE、LY含量迅速升高,ADSCs或ADSC-CM干预减少了外周血中的炎性细胞的数量;IRI组和DMEM组血清中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量呈升高趋势,ADSCs或ADSC-CM干预降低促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平,同时增强抑炎因子IL-10的表达;肝组织中炎症因子基因水平的表达与血清结果一致,ADSCs和ADSC-CM通过抑制促炎因子的过度释放以及增强抑炎因子的表达显着改善了术后的炎症反应,且两个干预组之间没有显着性差异。（5）凋亡指标变化:术后各组P53、Bax、Fas、Fasl基因和蛋白水平均显着升高,Bcl-2表达水平降低,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预抑制了凋亡相关指标P53、Bax,、Fas、Fasl的表达,提高抗凋亡Bcl-2的表达水平;ADSCs组和CM组显着降低TUNEL阳性细胞率及Caspase酶活性,减少术后肝细胞凋亡,且两组之间没有显着性差异。（6）再生指标变化:相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预显着提高血清中血管生成相关因子VEGF、ANG-1、ANG-2的表达,增强组织中肝脏再生相关基因HGF、Cyclin D1的表达,抑制肝再生终止基因TGF-β的表达,提高Ki67的阳性细胞数及细胞增殖PCNA蛋白的表达,且ADSCs组和CM组之间没有显着性差异。（7）ADSC-CM成分检测:通过ELISA法检测到小型猪ADSC-CM中含有促进血管生成的VEGF、ANG-1、ANG-2、b-FGF,调节炎症反应与肝脏再生的TNF-α、IL-1β、IL-6。综上所述,经肝实质移植ADSCs和ADSC-CM均能够改善肝脏缺血再灌注合并部分肝切除的病理组织学损伤及超微结构变化,减轻过度炎症反应及氧化应激反应,减少细胞凋亡,促进肝脏再生。本试验成功应用ADSCs和ADSC-CM干预肝脏缺血再灌注合并部分切除后的肝损伤,证明ADSCs和ADSC-CM抗氧化、抗炎、抗凋亡和促进肝再生的作用,且二者干预效果无显着差异,推测ADSCs发挥作用的机制很可能是通过分泌细胞因子的旁分泌途径。
陈笑艳[2]（2019）在《胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的作用与机制研究》文中提出研究背景:急性肝功能衰竭（acute liver failure,ALF）是由多因素所引发的迅速和严重的肝损伤,临床上如何治疗ALF一直是难以解决的问题。现阶段治疗ALF最有效的方法是肝脏移植,但其受到供体短缺和手术费用高昂等因素的限制,无法常规应用。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）移植作为一种新兴细胞移植疗法,成为了治疗ALF的研究热点,然而,研究表明移植的MSCs仅有少量细胞募集到受损组织,其治疗效果受到移植后的低细胞利用率和存活率的限制。胶原凝胶具有良好的生物相容性和特有的拓扑三维结构,既可以为细胞的靶向递送提供载体,同时也可以提供细胞生长所需的三维环境,进而维持并提高MSCs的存活能力与功能。然而,目前移植胶原凝胶复合MSCs是否对ALF具有更好的治疗效果缺乏研究。本研究建立以D-氨基半乳糖苷（D-Galactosamine,D-Gal）诱导的小鼠ALF模型,通过检测胶原凝胶复合MSCs移植在治疗小鼠ALF中取得的疗效,为胶原凝胶复合MSCs移植应用于临床治疗ALF提供实验基础和依据。研究目的:本研究主要探讨移植胶原凝胶复合MSCs对ALF小鼠的治疗作用及相关作用机制。研究方法:分离C57BL/6小鼠的骨髓MSCs,体外贴壁培养,每3天换液,用传至3-6代的MSCs进行实验。将MSCs与胶原凝胶混合制备,通过扫描电子显微镜检测胶原凝胶与MSCs的生物相容性。将经荧光预处理的MSCs、胶原凝胶复合MSCs分别肝脏多点注入ALF小鼠的肝脏,进行小动物活体成像检测,探究MSCs在肝脏中定植情况。将105只C57BL/6小鼠随机分为5组:（1）对照组（生理盐水）;（2）D-Gal+PBS组;（3）D-Gal+胶原凝胶组;（4）D-Gal+MSCs组;（5）D-Gal+胶原凝胶-MSCs组。组（1）中的小鼠腹腔注射生理盐水,另外4组小鼠腹腔注射D-Gal,建立小鼠ALF模型。于造模12小时后,4组ALF小鼠分别肝脏多点注射200μLPBS、200μL胶原凝胶、1×106MSCs、包含1×106MSCs的胶原凝胶-MSCs,统计各组小鼠的生存率。检测各组小鼠的ALT、AST和炎症因子水平,Western bloting、组织病理学染色检测各组小鼠肝脏组织中肝细胞的增殖和凋亡水平。结果:扫描电镜发现胶原凝胶与MSCs具有较好的相容性,小动物活体成像检测发现几乎所有信号均集中于肝脏,脾脏位置无信号,胶原凝胶复合MSCs移植的信号强于单独MSCs移植的ALF小鼠。经D-Gal处理后,小鼠血清中AST和ALT水平显着增高,并且在给药后第3天达到峰值。肝功能指标在D-Gal+胶原凝胶-MSCs组和D-Gal+MSCs组的小鼠明显优于D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组（P<0.05）,D-Gal+胶原凝胶-MSCs组比较D-Gal+MSCs组有明显改善（P<0.05）。HE染色提示D-Gal+胶原凝胶-MSCs组和D-Gal+MSCs组的肝脏损伤程度轻于D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组,D-Gal+胶原凝胶-MSCs组轻于D-Gal+MSCs组。D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组小鼠3天生存率不足15%,两组之间无显着差异,MSCs治疗组小鼠7天生存率为44%,而胶原凝胶复合MSCs治疗组小鼠生存率相比较单纯MSCs治疗组显着提高（7天生存率76%）。Western Bloting和免疫组化均显示D-Gal+胶原凝胶-MSCs组肝细胞增殖率明显优于D-Gal+MSCs组、D-Gal+PBS组及D-Gal+胶原凝胶组,同时,肝细胞凋亡明显低于D-Gal+MSCs组,相应的肝脏内IL-1β、IL-6、TNF-α、i NOS和CCL2等炎性因子水平D-Gal+胶原凝胶-MSCs也低于D-Gal+MSCs组。进一步的研究发现,D-Gal+胶原凝胶-MSCs通过激活PI3K/AKT信号通路发挥治疗作用。实验表明,尽管胶原凝胶本身对ALF无治疗作用,但胶原凝胶复合MSCs移植能增强MSCs的肝脏定植能力,并能对小鼠ALF产生更好的治疗效果,本研究的顺利进行,为解决MSCs移植治疗ALF提供了新的思路。结论:（1）胶原凝胶复合MSCs移植能增强MSCs的肝脏定植能力,从而更有效的减轻小鼠ALF;（2）胶原凝胶复合MSCs可通过抑制细胞凋亡,促进细胞增殖来减轻肝损伤;（3）移植胶原凝胶复合MSCs调控PI3K/AKT信号通路改善肝细胞功能。
孙婷[3]（2019）在《超声靶向微泡破坏介导BMSCs修复大鼠急性肝损伤的实验研究》文中提出目的:超声靶向微泡破坏（Ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD）技术是一种新的药物和基因递送方式,靶向特异性强、效率高,已有研究显示UTMD能增强骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的靶向归巢率,改善心功能和修复缺血心肌。本研究中,我们拟探讨UTMD对BMSCs归巢至肝脏的可行性、有效性,进而评估BMSCs对急性肝损伤的治疗效果,试图分析UTMD促进BMSCs靶向归巢的潜在机制。方法:采用贴壁离心法分离培养大鼠BMSCs,鉴定其增殖特性、三向分化能力和细胞表面抗原标志。携带增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）的慢病毒感染BMSCs用于体内示踪。SD大鼠经腹腔单次注射1.5g/kg D-氨基半乳糖（D-galactosamine,D-Gal）建立急性肝损伤（Acute liver injury,ALI）模型,检测24小时后血清学和肝脏组织结构评价模型是否成功建立。辐照急性肝损伤大鼠,24h后检测肝组织内基质细胞衍生因子（Stromal cell derived factor 1,SDF-1）和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的蛋白水平以确定合适的UTMD辐照强度。60只ALI模型鼠随机分Control,UTMD,BMSCs以及UTMD+BMSCs四组,大鼠进行相应实验处理48h后,每组随机选取3只大鼠,检测肝脏内BMSCs的归巢数量,并通过Western Blot和实时荧光定量聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction）qRT-PCR分析肝组织内趋化因子的表达程度-SDF-1,monocyte chemotactic protein 1（MCP-1）,intercellular cell adhesion molecule（ICAM-1）,vascular cell adhesion molecule 1（VCAM-1）和hepatocyte growth factor（HGF）。分别于治疗后48h,72h,1w和2w后检测大鼠血液生化指标—丙氨酸转氨酶（Alanine transaminase,ALT）,天冬氨酸转氨酶（Aspartate transaminase,AST）,碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）以及肝脏组织结构改变,同时于治疗后1w检测各组大鼠的肝细胞凋亡和增殖情况。结果:分离培养的大鼠BMSCs显示良好的干细胞特性。应用不同强度超声辐照ALI大鼠肝脏后,SDF-1和TNF-α表达水平随超声能量增加而增强（p<0.01）。在BMSCs和/或UTMD治疗后,UTMD+BMSCs组大鼠肝脏内BMSCs数量明显高于BMSCs组。此外,UTMD+BMSCs组大鼠肝内SDF-1,MCP-1,ICAM-1,VCAM-1和HGF的蛋白和mRNA表达量均高于BMSCs组（p<0.01）。UTMD+BMSCs组大鼠肝脏的生物学标志物的血清水平显着降低,肝细胞凋亡率明显低于BMSCs组（均p<0.05）。UTMD+BMSCs组大鼠肝脏病理损伤程度较其他三组改善明显。结论:UTMD能通过上调某些特异性的粘附分子和细胞因子增强BMSCs在ALI大鼠的肝脏归巢,从而增强干细胞对损伤肝脏的修复,改善受损肝功能,抑制细胞凋亡,促进肝细胞增殖。UTMD可为BMSCs移植修复急性损伤的肝脏提供有效且无创的治疗新方案。
袁淑芳[4]（2013）在《骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究》文中研究指明目的：（1）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行体外培养、鉴定。（2）对D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的急性肝衰竭（ALF）大鼠给予尾静脉、门静脉二种途径注射同种异体移植大鼠BMSCs,探讨BMSCs移植治疗ALF的可能性、对比两种移植途径的疗效。（3）通过测定各组血清及肝组织中细胞因子的表达,探讨BMSCs移植治疗ALF的机制、了解BMSCs在肝内归巢的影响因素、探讨BMSCs移植对ALF血清和肝组织中细胞因子表达及肝细胞凋亡的影响及机制,为临床开展BMSCs移植治疗ALF、为临床提供可靠的ALF预后评估系统、实时准确地评价ALF的免疫状态、病情及预后并指导临床治疗提供依据。方法：（1）采用全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,进行体外培养。采用DAPI标记BMSCs、细胞免疫荧光、流式细胞术进行BMSCs表型鉴定。（2）采用10%D-氨基半乳糖1-4g/kg/次、12小时一次和0.005%脂多糖20μg/kg,经腹腔注射制备大鼠ALF模型,观察造模后大鼠肝功能、肝组织病理损害程度。（3）通过尾静脉和门静脉注射的方式移植BMSCS。66只大鼠随机平均分为对照组、尾静脉移植、门静脉组。各途径组同种异体移植BMSCs,移植BMSCs数量为1.4×107个/kg,对照组给予等体积生理盐水腹腔注射。于移植后24h、72h、120h、168h收集血液样本和肝组织标本。检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）,比较BMSCs移植前后各组肝功能的改善情况。（4）用HE染色观察肝脏的病理学变化。用TUNEL法检测肝细胞凋亡。采用ELISA、RT-PCR方法测定各组血清及肝组织内CD163、IL-10的水平。用原位杂交、Western blot方法检测肝组织基质细胞衍化生长因子-1α （SDF-1α）蛋白的表达水平；用免疫荧光组织化学法、RT-PCR方法检测肝组织血管内皮生长因子VEGF蛋白的表达；采用免疫组化、Western blot方法检测肝组织Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平。结果：（1）原代培养的大鼠BMSCs传代后,高表达CD29和CD90,不表达CDllb和CD45。用DAPI进行BMSCs标记,荧光显微镜下观察可见所有BMSCs均已标上蓝色荧光。（2）采用了D-氨基半乳糖模型（D-Gal）/脂多糖（LPS）诱导的大鼠ALF模型。模型建立后,组织HE染色出现典型急性肝损伤表现,肝衰竭对照组大鼠血清ALT. AST水平和肝细胞凋亡较BMSCs移植组明显升高,且有时间依赖性,这些结果支持了建模成功。（3）ALF对照组大鼠血清ALT、AST水平随病程逐渐升高,在移植后120h、168h,尾静脉、门静脉组移植组血清ALT、AST水平与对照组的差别均有统计学意义（P<0.01）,尾静脉与门静脉移植组之间血清ALT, AST水平的差别无统计学意义（P>0.05）。（4）BMSCs移植后168h,尾静脉与门静脉移植组大鼠肝组织均可见大量DAPI阳性标记的细胞,ALF模型对照组未见DAPIP日性标记的细胞。（5） BMSCs移植后120h、168h,尾静脉移植组、门静脉移植组的炎性细胞浸润明显减少,肝小叶结构逐渐恢复,汇管区可见胆管增生。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况与对照组相比有统计学意义（P<0.05）。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况的差别无统计学意义（P>0.05）。（6）在移植后120h、168h,与对照组相比BMSCs移植组肝细胞凋亡明显减轻（P<0.05）。BMSCs移植后120h尾静脉组、门静脉组细胞凋亡指数分别为22.00±16.84%、20.60±7.60%；移植后168h细胞凋亡指数分别为18.33±8.78%、12.67±8.78%,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。尾静脉和门静脉植组之间肝细胞凋亡改善情况无统计学差异（P>0.05）。（7）原位杂交、免疫荧光、Western blot结果显示：BMSCs移植组中SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平随肝功能的好转逐渐逐渐升高,在移植后120h、168h与对照组相比有显着性差异（P<0.05）。尾静脉和门静脉植组之间肝组织SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平无统计学差异（P>0.05）。相关分析发现肝组织中SDF-1α、VEGF两者表达水平呈正相关（P<0.05）。肝组织中SDF-1α、 VEGF蛋白的表达与肝细胞凋亡之间存在负相关,相关系数分别0.293、-0.274（P<0.05）。（8） ELISA及RT-PCR结果显示：ALF对照组大鼠血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随时间的延长、肝功能的恶化而升高。BMSCs移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随肝功能的好转逐渐降低,在移植后120h、168h与实验组相比有显着差异（P<0.01）。门静脉与尾静脉移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平之间的差别无统计学意义（P>0.05）。相关分析发现血清及肝组织中CD163、IL-10两者表达水平呈正相关（P<0.05）。CD163IL-10与ALT、AST之间均有明显的相关性（P<0.01）。（9）大鼠肝组织中Caspase-1、IL-18蛋白及蛋白的表达趋势一致,BMSCs移植后大鼠肝组织中Caspase-1和IL-18水平明显下降,在移植后120h、68h、BMSCs移植组中Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平与对照组相比有显着差异（P<0.05）。门静脉组与尾静脉移植组之间Caspase-1、IL-18蛋白的表达差别无统计学意义（P>0.05）。尾静脉和门静脉植组之间Caspase-1、IL-18蛋白的表达无统计学差异（P>0.05）。相关分析发现Caspase-1、IL-18两者呈正相关（P<0.05）; Caspase-1、IL-18肝细胞凋亡之间均有明显的相关性（P<0.01）。结论：（1）采用全骨髓贴壁筛选法可以成功分离培养、扩增出高纯度大鼠BMSCs,并保持其原有的生物学特性。DAPI可成功标记BMSCs。（2）采用10%D-Gall.4g/kg/次,间隔12小时,共两次。联合0.005%LPS （10mg/支）20μg/kg、腹腔注射可成功建立大鼠ALF模型。该方法可靠、可重复性强、模型形成稳定、大鼠生存期较长,能满足本研究的需要。（3） BMSCs尾静脉、门静脉移植后,BMSCs可以归巢到ALF大鼠肝脏。（4） BMSCs移植能够促进ALF大鼠肝功能的恢复,减轻肝脏组织炎症坏死程度,BMSCs对ALF大鼠具有一定治疗作用。（5）尾静脉移植、门静脉移植途径均能有效改善ALF大鼠的肝功能、减轻肝脏病理损害程度。但二种途径相比差异无统计学意义。（6） BMSCs移植可减少ALF肝脏免疫炎症反应,抑制肝细胞凋亡。（7） BMSCs可以特异归巢至损伤肝脏,促进VEGF的分泌、并促进肝细胞增殖及肝脏血管再生、促进肝脏组织修复。（8） CD163. IL-10水平随肝组织炎症程度改善而下降,反映了肝功能的急剧恶化和疾病严重程度。BMSCs移植能降低CD163、IL-10水平,调节促炎与抗炎因子达到新的平衡。CD163、IL-10可作为早期评估患者肝移植预后观察的敏感血清标志蛋白的指标。（9）Caspase-1和IL-18在肝衰竭、肝细胞凋亡的发病过程中起重要作用。BMSCs移植能降低Caspase-1、IL-18水平。Caspase-1和IL-18可望成为急性肝衰竭的预测因子和未来的治疗靶点。
郭伟[5]（2013）在《丝素蛋白基大孔微载体共培养C3A细胞治疗大鼠急性肝衰竭的实验研究》文中提出研究背景肝脏是人体最重要的脏器之一,担负着人体分泌胆汁、凝血、新陈代谢、吞噬或免疫作用、解毒、调节水与电解质等一系列复杂的生理功能。急性肝功能衰竭是以快速进展的严重肝功能损害引起严重肝功能不全疾病,严重危及人类生命。各种原因引起的急性肝功能衰竭,常规治疗病死率高达60-80%。目前临床上急性肝功能衰竭的有效治疗手段主要包括三种：原位肝移植、生物人工肝支持系统以及肝细胞移植。随着肝脏移植技术的发展及免疫抑制剂的使用,目前肝脏移植已经被认为是治疗各种终末期肝病及急性肝衰竭唯一有效的治疗手段。但因为肝器官移植受到供体器官短缺、手术风险大、治疗费用高、术后免疫排斥导致供肝功能丧失以及终生需要服用免疫抑制剂治疗等因素的限制,决定了其在我国广泛应用仍有一定的困难。以体外培养的肝细胞为核心构建的生物型人工肝支持系统是一种理想的替代治疗方法,但是因生物反应器价格昂贵、供肝细胞来源以及其治疗过程中可能产生的血流动力学紊乱等因素制约了其临床广泛应用。肝细胞移植具有技术简单,容易操作,对患者创伤小、费用相对低廉、肝细胞在体外培养后减少了细胞表面的抗原性,可以降低免疫排斥反应、移植肝细胞可以发挥肝脏解毒、合成功能等特殊优势。相关试验研究已证明肝细胞移植可延长急性肝衰竭患者供体等待时间,明显改善患者的肝功能水平,由于肝脏的再生能力和潜力很大,在接受肝细胞移植后,部分患者残存的肝脏得以再生,肝功能可以恢复至正常水平。因此,肝细胞移植已被认为是对终末期肝疾病及急性肝衰竭的一种具有良好发展前景的治疗方法。但是,它需要解决的问题仍有很多,主要包括细胞来源问题和高密度高活性肝细胞培养问题。肝细胞的质与量是肝细胞移植研究中的关键问题,如何方便地获取高密度、高质量、高活性的肝细胞已成为肝细胞移植成功需要解决的重要问题。以生物支架材料大孔微载体为核心的三维肝细胞培养有望解决此难题。主要利用微载体悬浮培养技术来实现肝细胞的高密度培养及扩增,使细胞在数量上及功能上都能达到临床应用的要求。利用微载体悬浮培养技术进行种子细胞的扩增和用来充当体内细胞治疗的传输载体,近年来在肝细胞移植、生物人工肝及组织工程领域的应用研究正日趋升温。相比于实心微载体,大孔微载体的明显优势在于为细胞生长、粘附、增殖提供了足够的空间和更大的面积,有利于营养物质的进入和代谢产物的排出,从而提高了细胞代谢活性和培养密度。然而,目前市售的微载体的主要成分多见于明胶、葡聚糖、纤维素等,缺乏肝细胞特异性,细胞生长较为缓慢,不容易黏附于微载体表面；而且随着培养时间的延长,细胞容易脱落、死亡,从而降低了细胞培养密度和活性。随着对组织工程支架材料的深入研究,研究人员发现对高分子材料进行适当的化学改性、表面修饰等处理,以增强其力学特性,生物相容性及肝特异性,可诱导和提高肝细胞在支架上的黏附和增殖行为。在肝组织工程支架方面,半乳糖基是肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor, ASGPR）的特异性配体,是肝细胞识别的相应位点并能产生特异性相互作用。以半乳糖基修饰各种天然原材料的和人工聚合物,通过聚合物链上的半乳糖基和肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体之间独特的分子识别功能,优化支架的肝细胞特异性,提高肝细胞的特异功能。在肝组织工程细胞外基质支架材料上接枝半乳糖基,可诱导和提高肝细胞在细胞外基质支架上的粘附和增殖行为。我们的前期研究工作中,以生物相容性良好的天然高分子材料丝素蛋白、壳聚糖、乳糖酸为原料,把半乳糖基引入壳聚糖中,应用乳化-化学交联将丝素蛋白与半乳糖基化壳聚糖复合,经过极性溶液处理、冷冻干燥等处理,制备出了一种肝细胞特异性丝素蛋白／半乳糖基化壳聚糖大孔微载体。成功建立了丝素蛋白／半乳糖基壳聚糖大孔微载体制备技术,扫描电子显微镜观察该大孔微载体表面及内部呈多孔结构,开口向外,呈喇叭状,孔的分布均匀,适合于肝细胞高密度培养。并通过1HNMR谱、FITR谱表征,证实半乳糖基已经成功接枝到支架材料之中。该支架材料中引入了肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的特异性配体一半乳糖基,成功制备出了一种具有肝细胞特异性的高性能的大孔微载体。体外丝素蛋白/乳糖基壳聚糖大孔微载体与肝细胞系C3A细胞悬浮培养实验表明肝细胞能与大孔微载体特异性黏附、细胞围绕微载体聚集生长,并表现出很好的活力。然而,体内环境相对于体外环境更为复杂,SF/GC大孔微载体C3A细胞复合物在体内能否有效存活?能否对动物急性肝衰竭模型进行有效的提高生存率、改善肝功能、减轻肝脏损伤?这些问题的深入探讨无疑将有助于细胞移植技术的发展。基于研究现状以及本课题组前期的工作结果,本实验拟采用丝素蛋白/乳糖基壳聚糖大孔微载体C3A细胞悬浮培养形成的复合物腹腔内移植的方法,以观察SF/GC大孔微载体C3A细胞复合物对急性肝功能衰竭的治疗效果。本研究旨在探讨SF/GC大孔微载体C3A细胞复合物在动物急性肝衰模型体内移植的可行性,为今后临床上更好的应用细胞移植技术治疗急性肝衰竭提供必要的理论和实验依据。目的以肝细胞系C3A细胞为移植细胞,以丝素蛋白/乳糖基化壳聚糖大孔微载体为载体,对C3A细胞行大孔微载体粘附培养、检测其生物学特性,探讨将丝素蛋白/乳糖基化壳聚糖大孔微载体粘附培养C3A细胞复合物植入到切除80%肝组织的急性肝功能衰竭大鼠模型腹腔内,观察存活率,检测肝功能水平及观察肝脏组织学变化,评价其对急性肝衰大鼠的治疗效果,为将来临床应用提供必要的理论和实验依据。方法首先采用冷冻干燥法制备丝素蛋白／半乳糖基壳聚糖大孔微载体,与肝细胞系C3A细胞进行粘附共培养,对其生物相容性及细胞功能进行检测,确定行大孔微载体C3A复合体移植的最佳时期。然后切除大鼠80%肝脏组织构建SD大鼠急性肝功能衰竭模型。最后大鼠肝衰模型建立后分别将培养72h的丝素蛋白／半乳糖基化壳聚糖大孔微载体C3A细胞复合物（A组）、C3A细胞悬液2mL（含6.0×107个C3A细胞,B组）植入到急性肝功能衰竭大鼠腹腔内。观察移植后大鼠1周内存活率,检测血清白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）肝功能指标,检查肝脏组织学变化。结果大孔微载体C3A细胞共培养第3天上清液中葡萄糖消耗及白蛋白浓度最高。丝素蛋白/乳糖基壳聚糖大孔微载体C3A细胞复合物对急性肝衰竭模型动物的实验显示,移植后1周急性肝衰竭大鼠的存活率分析比较：微载体组动物的生存率明显高于其他两组,A组为50%,B组为40%,C组为10%,各移植组高于对照组（P<0.05）。移植后1周内,微载体组肝功能各项指标水平逐渐下降,移植术后第7天肝功能各项指标逐渐接近正常水平,与移植第1日有显着统计学差异（P<0.05）。对照组肝功能各项指标水平无明显下降趋势,ALT水平于移植术后第1日达最高峰。肝组织切片形态学观察示大孔微载体C3A细胞复合物组移植第7天后肝脏病理有不同程度的恢复,较其他两组有明显改善。结论以丝素蛋白、壳聚糖、乳糖酸为原料制备的丝素蛋白/乳糖基化壳聚糖大孔微载体表面及内部为多孔结构,孔的分布均匀,具有肝细胞特异性,适合肝细胞高密度培养,是较为理想的细胞载体材料。大孔微载体与C3A细胞共培养能更好的维持培养的C3A细胞活性及功能,以第3天的功能较好,适合应用移植。通过切除大鼠80%肝脏组织能成功构建大鼠急性肝衰竭模型。丝素蛋白/乳糖基化壳聚糖大孔微载体具有良好的生物相容性,应用丝素蛋白/乳糖基化壳聚糖大孔微载体培养C3A细胞腹腔内移植治疗急性肝衰竭大鼠能提高生存率,改善肝功能,减轻肝脏病理改变。
房青[6]（2010）在《人源性生物人工肝的制备及临床前研究》文中进行了进一步梳理急性肝衰竭（acute liver failure, ALF）是病毒性肝炎一种危重的临床综合征,传统支持治疗病死率高达80%。肝移植是有效的ALF治疗措施,但由于肝供体严重缺乏,许多患者在等待供体过程中死亡。生物人工肝支持系统（bioartificial liver support system, BALSS）是未来最有希望在体外提供全面肝功能支持,使患者顺利过渡到肝移植或肝再生的有效治疗方法。BALSS的关键生物材料是肝细胞。虽然新鲜分离的猪肝细胞和人肝细胞瘤细胞都曾经被用作BALSS的细胞材料,但由于存在过敏反应、病毒感染和诱发肿瘤等不安全因素,临床应用受到很大限制。我们应用SV40 Tag和端粒酶转染原代人肝细胞建立了永生化人肝细胞系（immortalized human hepatocytes, IHH）。前期研究表明,IHH表现高增殖活性,可在微载体上高密度培养,体内不具有成瘤性。体外分析表明：IHH具有正常肝细胞的主要功能,表达与肝脏代谢、解毒、合成相关的基因和蛋白。将IHH与肝衰竭血清孵育后,可使血清胆红素进行性地降低,尿素进行性升高,表明IHH具有对胆红素和血氨的解毒功能。目的：应用微载体大规模培养IHH,构建人源性生物人工肝（human-derived bioartificial liver, hBAL）,通过对大量ALF血浆灌流解毒的体外实验和对小鼠ALF模型、恒河猴ALF模型治疗的体内实验,评价hBAL治疗ALF的有效性和安全性,为hBAL进入临床Ⅰ期试验提供依据。方法：应用微载体搅拌悬浮方法大规模高密度培养IHH。采用腹腔注射四氯化碳（CCl4）建立裸鼠ALF模型,将微载体培养IHH注射于裸鼠腹腔内进行腹膜透析治疗,并设未治疗组和空微载体治疗组,比较各组动物的肝功能损伤指标,肝组织病理和动物生存率。将微载体培养IHH和树脂颗粒灌装特制容器构建IHH细胞反应器,连接蠕动泵,对400 mL ALF血浆灌流解毒6 h,IHH细胞反应器再生18 h后,再次进行6 h灌流解毒,解毒-再生循环6次,观察ALF血浆胆红素、尿素浓度变化,评价IHH细胞反应器的体外解毒功能。用间隔48 h两次注射D-氨基半乳糖（D-galactosamine, D-GalN）的方法建立恒河猴ALF模型,IHH细胞反应器连接血液净化装置制备hBAL,采用连续10 h每5h更换新的IHH细胞反应器的连续治疗模式及治疗5 h,间隔19 h,重复3次的间隔治疗模式对两只ALF恒河猴分别进行了hBAL治疗,观察转氨酶、胆红素、血氨、尿素、胆汁酸、血糖、凝血酶原时间、凝血酶原活动度、纤维蛋白原等肝功能损伤指标的变化及ALF恒河猴生存情况和不良反应,评价hBAL对ALF的疗效和安全性。死亡恒河猴肝组织切片HE染色观察肝坏死情况。对IHH进行了染色体分析及SCID鼠成瘤实验以评价其安全性。结果：采用微载体技术可大规模培养IHH,培养体积可达500-600mL。腹腔注射CCl4后24 h,所有小鼠的转氨酶升高达正常值10倍以上。未治疗组和空微载体治疗组动物48 h内全部死亡,肝组织检查发现肝细胞广泛坏死；而采用IHH-微载体治疗组48 h动物生存率为83.3%,持续14d后转为长期存活。存活的动物转氨酶降至正常水平,肝组织检查显示肝细胞坏死显着减少,免疫组织化学染色显示腹腔微载体上肝细胞仍存活,并表达人肝细胞特异蛋白α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin,α1-AT）。IHH细胞反应器对ALF血浆灌流解毒6h后,可使血浆总胆红素下降18%,解毒-再生循环6次后,可使血浆总胆红素下降41%；血浆尿素从解毒-再生循环第4次起升高,到第6次,总升高幅度为22%,而空微载体对照组ALF血浆相应指标无显着变化。间隔48 h两次注射D-GalN可成功制备恒河猴ALF模型,恒河猴血清转氨酶升高44倍,胆红素升高5.4倍,血氨升高2.5倍,凝血酶原时间>75秒,凝血酶原活动度<10%,未经治疗的恒河猴反应迟钝,进食饮水减少,呕吐,尿少,最长生存时间不超过63 h。造模后48 h开始连续10h的hBAL治疗可使恒河猴血液肝损伤指标改善：转氨酶下降70-80%；胆红素下降约70%；血氨未继续升高,而尿素水平增高；总胆汁酸（total bile acid, TBA）下降约75%。治疗终止后上述指标反弹,到造模后4天为反弹高峰。凝血功能未改善,恒河猴生存7.6天。肝组织病理学检查显示与未治疗ALF恒河猴比,肝坏死减轻,肝淤血减少。造模后24 h开始间隔hBAL治疗3次,每次均使转氨酶下降约50%,治疗终止后,转氨酶反弹升高,但造模后4天的反弹高峰幅度较低,仅为连续治疗的39%；间隔hBAL治疗抑制了胆红素升高,造模后4天的反弹幅度为连续治疗的12%；间隔hBAL治疗后尿素水平显着升高,约为连续治疗的一倍,同时血氨无显着升高。间隔hBAL治疗还抑制了TBA的升高,改善了凝血功能,造模后7天,凝血功能恢复正常。经3次间隔hBAL治疗后,ALF恒河猴痊愈而长期存活。hBAL治疗过程中设备运行稳定,各项参数正常。不良反应有低血压和低血钙,对症治疗后缓解。染色体分析示IHH为二倍体,IHH移植SCID鼠皮下和肝脏内6个月未成瘤。结论：应用微载体培养IHH可成功制备可再生性人源性生物人工肝。体外实验中可使400mL ALF血浆胆红素降低,血浆尿素增高,具有解毒功能。体内实验中可使ALF小鼠和ALF恒河猴生存期延长,肝损伤指标改善,疗效显着,安全性好。对ALF恒河猴治疗的间隔治疗模式疗效优于连续治疗模式,在肝损伤较轻时及时给予BAL治疗疗效较好。
顾劲扬[7]（2009）在《骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养的实验研究》文中研究表明急性肝功能衰竭是一类死亡率极高的综合征候群。近年来,生物人工肝（bioartificial liver, BAL）支持系统已成为延长急性肝功能衰竭患者生命,并向肝移植手术过渡的一种替代性治疗手段。其中,肝细胞是BAL的生物核心材料,BAL对肝功能衰竭患者的支持作用有赖于所用肝细胞的生物学特性。因此,如何获得更接近正常人肝细胞功能、对人体无害且足够数量的肝细胞历来成为BAL领域的研究热点。原代肝细胞是一种高分化细胞,正常生理状态下处于静止期,很难分化增殖,一旦失去体内生存微环境,在体外传统培养过程中极易丧失其结构特征和分化再生能力,呈“去分化”状态。近年来,许多研究证实肝细胞和非肝实质细胞在体外共培养可通过异质细胞间的相互作用充分模拟肝细胞在体内的生存环境,形成缝隙连接、胆管样结构,故可有效延长肝细胞的生存时间,促进肝细胞增殖分化,并保持肝细胞特有的生物学功能。因此,共培养是肝细胞大规模、高活性培养并最终应用于BAL的理想培养方式。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCS）是一类具有自我复制和多向分化潜能的干细胞,既容易分离又易于在体外扩增,以其分泌多种可溶性细胞因子和表达内生性细胞外基质的特点,在骨髓中为造血干细胞的生长、增殖、迁移和分化提供必要的微环境。有鉴于此,骨髓MSCS与肝细胞共培养可能成为BAL的理想细胞来源。本课题旨在明确骨髓MSCS与肝细胞共培养对肝细胞的作用和规律,揭示共培养中肝细胞增殖与凋亡的分子生物学机制,确定共培养体系中肝细胞增殖与凋亡的关键分子靶点,既解决了BAL中肝细胞大规模、高活性和高功能培养问题、为BAL提供最适细胞来源,又为进一步将分子靶向研究应用到肝细胞大规模培养中奠定坚实的理论基础。另外,急性肝功能衰竭的预后取决于并存在患者血浆/血清中的循环再生抑制因子与肝细胞再生因子之间的竞争与对抗,骨髓MSCS与肝细胞共培养体系能否耐受肝功能衰竭血浆/血清的细胞毒性作用、有效发挥肝细胞支持功能是影响BAL效能的关键问题。第一部分肝细胞与骨髓MSCS最适共培养体系的建立和规律研究目的:建立猪肝细胞与骨髓MSCS体外最适共培养体系,为BAL的构建提供理想细胞来源。方法:自中华实验猪（n=3）髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代,流式细胞仪分别鉴定各代CD29、CD44、CD45和CD90比例。原位两步胶原酶法分离猪肝细胞,台盼兰拒染实验判断肝细胞活率,并采用抗白蛋白和CK18免疫细胞化学染色法鉴定肝细胞纯度。将肝细胞与MSCS分别按照1:1、2:1、5:1和10:1等不同比例随机混合培养,并设立肝细胞与MSCS单纯培养组为对照组。观察各组肝细胞形态和功能变化及随时间变化规律。结果:第3代骨髓MSCS纯度>90%,新鲜分离的肝细胞活率>95%,纯度>99%。倒置显微镜观察发现共培养组肝细胞迅速粘附于MSCS表面,并呈球形聚集生长。电镜观察提示共培养组有大量细胞外基质存在,且肝细胞内超微结构与正常肝细胞接近,异质细胞间可见细胞连接形成。共聚焦显微镜进一步提示异质细胞间形成三维分层生长。活细胞工作站记录MSCS高迁移性,且与肝细胞聚集生长相关。共培养组肝细胞糖原染色明显强于对照组,抗白蛋白免疫细胞化学染色示实验组肝细胞内白蛋白水平较对照组显着增高。Dead/Live荧光染色见共培养组肝细胞活性较对照组明显改善。肝细胞/MSCS共培养2:1组的白蛋白分泌水平和尿素合成能力为各组中最佳,自第1d共培养起显着高于各组（P<0.05）,并在第2d达到高峰,且随后的下降趋势较缓慢。流式细胞仪分选出共培养组肝细胞经Western Blotting检测提示2:1组肝细胞内白蛋白和细胞色素P4503A1合成水平均较其余各组显着增高（P<0.05）。细胞周期检测提示共培养组肝细胞分布于G2-S期的比例较对照组显着增加（P<0.05）。结论:猪肝细胞与骨髓MSC体外共培养可维持肝细胞形态与功能,猪肝细胞与MSC按2:1比例接种培养至第2d可最大程度维持肝细胞功能,为构建功能性BAL提供高效细胞材料。第二部分骨髓MSCS参与肝细胞培养的作用机制研究目的:探索骨髓MSCS来源的细胞外基质和可溶性细胞因子在最适共培养体系中的作用。方法:自中华实验猪（n=3）髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代;原位两步胶原酶法分离猪肝细胞后与MSCS按照2:1比例随机混合培养至第2d,免疫细胞化学染色观察纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I、III、V型胶原表达水平和胞内外分布情况。合成纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I和V型胶原SiRNA特异性片段分别转染MSCS后再与肝细胞共培养,观察肝细胞特异性功能变化水平。使用Millicell悬挂式小室将猪肝细胞与MSCS按照2:1比例隔离培养,观察非直接接触共培养体系中肝细胞特异性功能变化,检测培养液上清中TNF-α、IL-6和TGF-α水平。抗IL-6中和抗体孵育后的MSCS与肝细胞建立上述共培养体系,检测肝细胞特异性功能变化水平。结果:免疫细胞化学染色提示单纯培养的肝细胞内表达除纤维连接蛋白以外所有细胞外基质,而MSCS胞内外均不表达III型胶原。共培养组肝细胞与MSCS之间分布大量细胞外基质网络,由纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I型和V型胶原组成。Western Blotting检测提示RNAi片段转染MSCS后纤维连接蛋白、层粘连蛋白和I型胶原表达干扰效率超过85%,V型胶原超过50%。各干扰组白蛋白分泌水平和尿素合成水平均较对照组显着下降（P<0.05）。非直接接触共培养组白蛋白和尿素浓度与肝细胞培养组相比较显着升高（P<0.05）。肝细胞组、共培养组、MSCS组上清液中均未检测到TNF-α。TGF-α水平在肝细胞组与共培养组之间没有统计学差异（P>0.05）。共培养组和MSCS组IL-6水平较肝细胞组显着增高（P<0.05）,两组之间未见统计学差异（P>0.05）。IL-6中和抗体实验后白蛋白分泌和尿素合成水平较对照组显着降低（P<0.05）。结论:骨髓MSCS通过分泌纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I和V型胶原,以及IL-6共同提高原代肝细胞特异性功能,为组织工程、细胞生物学和BAL的研究提供新手段。第三部分骨髓MSCS共培养下的肝细胞蛋白质组学研究目的:比较骨髓MSCS与原代肝细胞构建最适共培养体系前后肝细胞内蛋白质表达谱的差异,并对明确的蛋白质进行功能分析,在蛋白质水平上阐明骨髓MSCS共培养下的原代肝细胞功能改善的机制。方法:自中华实验猪（n=3）髂前上棘抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离单个核细胞,贴壁传代培养至第3代,与原位两步胶原酶法分离得到的猪肝细胞建立最适共培养体系。流式细胞仪分选CD44-CD45-细胞群,并设立肝细胞单纯培养组作为对照,每组重复3次。将提取的蛋白样品采用固相pH梯度双向凝胶电泳进行分离,使用ImageMaster 2D Elite软件对图像进行匹配和差异分析,识别两组间表达差异的蛋白质点,将部分差异蛋白点进行胶内原位切割、酶解后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异表达的蛋白质,获得肽质指纹谱。通过生物信息学查询鉴定蛋白质并将差异蛋白质分子归类相应生物学事件。Western印迹技术验证部分蛋白质在肝细胞单纯组与共培养组肝细胞之间的表达差异。结果:流式细胞仪可将共培养细胞分选为CD44-CD45-（肝细胞）、CD44+CD45-（MSCS）两群。经双向凝胶电泳成功建立肝细胞蛋白质二维电泳图谱,图像分辨率高,重复性好。两组间差异表达量≥3倍的蛋白质点共40个,其中表达上调的19个。经质谱鉴定出34个蛋白点,Western Blotting检测证实CFTR、IL-6、HMG-1变化水平与蛋白质组结果基本一致。这些差异蛋白的分子功能主要与肝脏代谢功能、细胞周期调节、细胞增殖与凋亡、免疫调节等相关。结论:采用比较蛋白质组学的方法可以发现大量与骨髓MSCS共培养下的原代肝细胞内差异表达的蛋白质,这些功能蛋白的差异表达可能与MSCS和原代肝细胞体外共培养下肝细胞特异性功能改善、细胞生存时间延长、免疫调节密切相关,为进一步优化肝细胞功能提供了靶点。第四部分骨髓MSCS诱导肝细胞耐受肝功能衰竭血清的实验研究目的:明确与骨髓MSCS共培养的肝细胞可耐受慢加急性肝功能衰竭患者血清的细胞毒性,以及共培养细胞对肝衰血清的肝功能支持作用。方法:患者知情同意前提下收集慢性乙型肝炎慢加急性肝功能衰竭患者血清（n=18）及正常志愿者血清（n=18）。建立猪肝细胞与骨髓MSCS最适共培养体系。实验分为4组:肝衰竭血清单纯肝细胞培养组（Hep-F）、肝衰竭血清共培养组（Co-F）、正常人血清单纯肝细胞培养组（Hep-N）和正常人血清共培养组（Co-N）。血清浓度依次为10%、20%、40%、60%、80%和100%。培养24h后收集上清液检测白蛋白水平和肝细胞周期确定最适肝衰竭血清浓度。观察细胞生长状态、超微结构及细胞活力。分别检测60%浓度血清培养组SOD、LDH、GLN和CHE水平。更换为含10%胎牛血清的完全培养基继续培养24h,收集肝衰竭血清单纯肝细胞培养组（Hep-FB）、肝衰竭血清共培养组（Co-FB）、正常人血清单纯肝细胞培养组（Hep-NB）和正常人血清共培养组（Co-NB）上清液,重复检测SOD、LDH、GLN和CHE水平。结果:骨髓MSCS共培养后的肝细胞在60%浓度的肝衰竭血清中肝细胞贴壁数量最多,呈岛状聚集生长。肝细胞表达白蛋白水平最佳（P<0.05）,G2-S期细胞比例升至32.08%,细胞内超微结构接近正常,细胞活力较对照组明显改善。Hep-F组SOD、GLN、CHE活性显着下降（P<0.05）,而LDH显着升高（P<0.05）;Co-F组SOD、GLN和LDH水平与Co-N组之间差异无统计学意义（P>0.05）,仅CHE活性有所下降（P<0.05）,但与Hep-F组比较有显着性提高（P<0.05）。Hep-NB、Hep-FB、Co-NB与Co-FB之间SOD活性的差异无统计学意义（P>0.05）;Co-FB组LDH、GLN、CHE活性较Hep-F组有显着性改善（P<0.05）。结论:与骨髓MSCS共培养的肝细胞可耐受中高浓度慢加急性肝功能衰竭血清的细胞毒性,有效维持肝细胞功能的支持作用。
刘妍芳[8]（2007）在《微囊化罗非鱼肝细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验观察》文中研究表明目的:1.建立罗非鱼肝细胞的分离及纯化方法。2.应用微囊化法对罗非鱼肝细胞进行免疫隔离。3.观察微囊化罗非鱼肝细胞移植对肝衰大鼠的治疗作用。4.探讨鱼纲与哺乳纲动物间肝细胞移植的可能性。材料和方法:1.采用胶原酶冷消化法和两步低速离心法分离罗非鱼肝细胞。应用倒置显微镜和透射电镜观察罗非鱼肝细胞形态及其超微结构。采用台盼蓝拒染法检测细胞活力。2.D-GalN（D-galactosamine,D-氨基酸半乳糖盐酸盐）大鼠腹腔内注射,建立急性药物性肝衰模型。3.采用ACA（Alginate-Chitosan-Alginate,海藻酸钠—壳聚糖—海藻酸钠）微囊包裹罗非鱼肝细胞移植入肝衰大鼠模型腹腔内,即微囊化罗非鱼肝细胞移植组（简称微囊化组,N=35只）;并设立空微囊移植组（空微囊组,N=28只）、裸肝细胞移植组（裸肝细胞组,N=35只）及NS（Normal saline,生理盐水）对照组（NS组,N=28只）等作为实验对照。4.比较移植后各组肝衰大鼠的一周存活率;于移植后24h和48h分别取各组存活大鼠5只经腹主动脉取血作肝功能检测,观察谷丙转氨酶、总胆红素和白蛋白的变化;分别在24h、48h、7d和14d时间点上对移植物进行光镜和电镜的病理检查。结果:1.平均每条鱼获得0.93±0.22×108个肝细胞,台盼蓝染色示肝细胞活率为90.1±0.79%,纯度为89.75±1.92%。光镜下新分离的肝细胞呈透亮圆球形,形态大小一致,少数聚集成团。透射电镜示罗非鱼肝细胞细胞质内可见大量圆形或卵圆形线粒体和糖原颗粒;粗面及滑面内质网较多;细胞核形状较为规则,大而圆,核仁清晰。2.制备好的空微囊多为圆形,边缘清晰,内部为透明凝胶液体,外部膜结构完整。包裹肝细胞大部分居于微囊内部,仅有少量肝细胞贴于囊壁上。3.移植后受体一周存活率比较:微囊化组受体一周存活率为57.9%明显高于裸肝细胞组（21.1%,P<0.05）;与空微囊组（16.7%）、生理盐水组（16.7%）比较亦有显着性差异（P<0.05）;而裸肝细胞组、空微囊组和生理盐水组三组组间比较差异不显着（P>0.05）。4.移植48h后受体肝功能检测:（1）微囊化肝细胞组ALT为1103.9±132.4U/L,明显低于裸肝细胞组（2188.3±185.4U/L,P<0.01）;与空微囊组（2257.8±283.3U/L）、生理盐水组（2379.2±168.7U/L）比较亦有显着性差异（P<0.01）;而裸肝细胞组、空微囊组和生理盐水组三组组间比较差异不显着（P>0.05）。（2）微囊化肝细胞组TBIL为6.21±0.86μmol/L,明显低于裸肝细胞组（9.18±0.96μmol/L,P<0.05）;与空微囊组（8.82±0.93μmol/L）、生理盐水组（8.76±0.74μmol/L）比较亦有显着性差异（P<0.05）;而裸肝细胞组、空微囊组和生理盐水组三组组间比较差异不显着（P>0.05）。（3）微囊化肝细胞组ALB为23.2±1.14g/L,明显低于裸肝细胞组（21.0±1.98g/L,P<0.05）;与空微囊组（20.6±1.34g/L）、生理盐水组（19.3±1.22g/L）比较亦有显着性差异（P<0.05）;而裸肝细胞组、空微囊组和生理盐水组三组组间比较差异不显着（P>0.05）。5.各组移植物病理检查:裸肝细胞在移植后48h即可见腹腔内有较多白色团块粘附于大网膜上,收集移植物组织HE染色后光镜检查可见腹膜将移植的裸肝细胞包裹为细胞团块,周围大量炎症细胞浸润,肝细胞多已变性坏死;而微囊化组在移植后48h,可从受体腹腔中收集到形态完整的微囊,其内肝细胞活力良好,台盼蓝染色示肝细胞活率可达到80%。移植后7d,微囊化组受体腹腔内可见到形态完整、无明显粘连的微囊。其内肝细胞存活良好,将微囊压碎后,肝细胞台盼蓝染色活力达45.3±5.8%。透射电镜观察可见微囊内罗非鱼肝细胞结构正常,细胞核形状较为规则。移植后14天大体观察见含罗非鱼肝细胞的微囊主要粘附于肠壁、网膜、肝脏下缘和侧腹壁,少量微囊粘聚成团,周围可见血管形成。将微囊压碎后,肝细胞台盼蓝染色活力仍可达34.7±4.0%。结论:1.胶原酶冷消化法分离的罗非鱼肝细胞形态完整、活性良好,产量和纯度均较高,是一种较好的分离方法。2.移植后罗非鱼肝细胞能在微囊内较长期存活,具有较强的耐低氧能力。3.ACA微囊可起到良好的免疫隔离作用,有利于移植物的长期存活,并且其具有较好的生物相容性,较为有效的避免了囊周纤维化的发生。4.微囊化包裹罗非鱼肝细胞腹腔内移植有助于大鼠急性药物性肝衰的逆转,显着提高急性肝衰大鼠的存活率、改善肝功能、减轻肝脏病理改变。
张艳[9]（2007）在《同种异体肝细胞腹腔内移植联合ALR治疗大鼠急性肝衰竭的研究》文中研究说明目的:急性肝衰竭（ALF）起病急,自然死亡率高,目前最有效的治疗是原位肝脏移植,但由于供肝短缺,等待肝移植的患者越来越多,许多患者在等待移植期间死亡,这促进了广大学者探索治疗ALF新的方法。而肝细胞移植（HCT）被公认为继肝移植后一项有效、安全而有希望的治疗方法,动物实验表明脾实质内移植为最有效的移植途径,但临床脾内移植手术风险大,在临床应用中受到限制。本研究拟探讨同种异体肝细胞腹腔内移植联合ALR治疗大鼠ALF的疗效,及ALR在同种异体HCT免疫应答中的作用及其机制。方法:采用半原位胶原酶灌注法分离成年SD大鼠肝细胞用以移植。用1.0g/kg的D-gal诱导SD大鼠ALF,诱导后24h,74只ALF大鼠随机分成5组,除Ⅴ组14只外,其余组各15只。Ⅰ组:注射生理盐水;Ⅱ组:移植2×107肝细胞,以后注射生理盐水;Ⅲ组:移植2×107肝细胞,联合CsA10mg.kg-1.d-1;Ⅳ组:移植2×107肝细胞,同时注射ALR50μg.kg-1.d-1;Ⅴ组:注射ALR50μg.kg-1.d-1;肝细胞和药物均腹腔内注射。观察大鼠的存活率、肝脏功能、移植肝细胞存活情况、病理变化,检测各组大鼠CD4、CD8、CD68、IL-1β、TNF-α的水平。结果:各组间大鼠2周存活率两两比较,Ⅳ组存活率显着高于Ⅰ组（66.7% vs 0%,P=0.001）,余组间无差异。药物诱导后2-3天血清生化指标水平达高峰,各组间无差异。但d1-2腹水生化指标有差异,Ⅲ组ALT水平高于Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ组;Ⅱ、Ⅲ组AST水平均高于Ⅳ、Ⅴ组,Ⅰ组高于Ⅳ组;Ⅰ组TBil低于Ⅱ、Ⅳ组。移植后第14天生化指标恢复正常。移植后d1-2血清TNF-α水平Ⅰ、Ⅱ组均高于Ⅳ组、Ⅴ组,Ⅲ组高于Ⅴ组;Ⅳ组d1-2血清IL-1β低于Ⅱ组;d1-2腹水TNF-α、IL-1βⅡ组均高于其它组。d1-2大网膜CD68阳性率Ⅱ组高于Ⅰ、Ⅳ组;肝细胞结节内CD68阳性率Ⅳ组低于Ⅱ、Ⅲ组。移植后大网膜d1-2 CD4、CD8阳性率Ⅰ、Ⅱ组均高于Ⅳ、Ⅴ组,且Ⅱ组CD4阳性率高于Ⅲ组。各存活组间d14各项指标均无差异。结论:肝细胞腹腔内移植联合ALR能提高ALF大鼠存活率。ALR通过降低血清及腹腔内TNF-α、IL-1β水平,抑制CD4+/CD8+T细胞、单核-吞噬细胞介导的免疫应答,而促进移植肝细胞存活和增殖,改善肝脏功能及组织学变化。
林建扬[10]（2007）在《腹腔内移植微载体贴附共培养肝细胞与肝星状细胞治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究》文中认为目的研究大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）与肝实质细胞（hepatocyte,HC）微载体贴附共培养时HSC对HC形态及功能的影响,为体外原代培养肝细胞的营养与支持提供参考。将微载体贴附共培养的肝细胞与HSC移植到D-GalN诱导的急性肝衰竭（acute liver failure, ALF）大鼠腹腔内,评估其对急性肝衰竭大鼠的疗效,为临床应用肝细胞移植及生物人工肝（bioartificial liver, BAL）提供理论依据。方法采用半原位酶分离法灌注分离获得SD大鼠肝细胞,并与大鼠肝星状细胞进行微载体贴附共培养,观察肝细胞的形态及功能改变,确定行肝细胞移植（heptacyte transplantation, HCT）的最佳时期。再将体外共培养的肝细胞与肝星状细胞移植入D-氨基半乳糖诱导形成的急性肝衰竭大鼠模型腹腔内,观察2周内大鼠的存活率,检测肝功能指标,并观察肝脏及腹膜组织学变化。结果每只鼠可分离获得（13.4±4.3）×107个肝细胞,肝细胞活力为89.2%±9.6%。体外培养的肝细胞形态特征及白蛋白、尿素合成等功能可保持7天以上。共培养第3天上清液中白蛋白及尿素浓度最高,LDH最低,与单独培养组比较,差异有显着性（P<0.05）。我们选用体外培养3天的肝细胞或HC/HSC进行HCT。移植2周内HCT组、HSC-HCT组大鼠存活率较ST组明显升高,尤其以HSC-HCT组升高显着,三组之间差异均有显着性（P<0.05）。移植后7天内,HCT组、HSC-HCT组大鼠肝功及凝血均有明显改善,与空载体组比较差异有显着性（P<0.05）。ST组在移植3天后,肝脏病理有继续恶化趋势,而HCT组、HSC-HCT组都有不同程度的恢复。腹膜组织HE染色证实移植入腹腔内的HC或HC/HSC在受体腹腔内存活一周左右。结论微载体培养肝细胞第3天有较好白蛋白及尿素合成功能,且LDH漏出量较低,适合行肝细胞移植。HSC与HC共培养,能更好地发挥肝细胞生物学功能。腹腔内移植微载体贴附培养HC或HC/HSC,都可以对急性肝衰竭大鼠提供代谢支持,可显着改善肝功能、减轻肝脏病理改变,提高急性肝衰竭大鼠的存活率,尤以腹腔内移植微载体贴附HC与HSC效果更佳。
二、微载体粘附培养的肝细胞腹腔内移植治疗急性肝功能衰竭大鼠的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、微载体粘附培养的肝细胞腹腔内移植治疗急性肝功能衰竭大鼠的实验研究（论文提纲范文）
（1）ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 腹腔镜微创技术简介 |
| 1.1.1 腹腔镜微创技术的发展简介 |
| 1.1.2 腹腔镜肝切除术的发展应用 |
| 1.1.3 腹腔镜微创技术的客观评价 |
| 1.1.4 腹腔镜微创技术的发展方向 |
| 1.2 肝脏缺血再灌注损伤 |
| 1.2.1 肝脏缺血再灌注损伤的发生机制 |
| 1.2.2 肝脏缺血再灌注损伤的预防治疗 |
| 1.2.3 探究肝脏缺血再灌注损伤的实验动物模型 |
| 1.3 间充质干细胞概述 |
| 1.3.1 干细胞的生物学特性与分类 |
| 1.3.2 间充质干细胞的由来与定义 |
| 1.3.3 间充质干细胞生物学功能 |
| 1.3.4 间充质干细胞作用机制 |
| 1.3.5 干细胞临床应用的安全性 |
| 1.4 间充质干细胞条件培养基 |
| 1.4.1 间充质干细胞的旁分泌作用 |
| 1.4.2 间充质干细胞条件培养基的治疗作用 |
| 1.4.3 脂肪间充质干细胞条件培养基 |
| 1.4.4 脂肪间充质干细胞条件培养基的临床应用 |
| 1.5 目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验器材 |
| 2.1.3 试验药品及试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 小型猪脂肪间充质干细胞的分离培养 |
| 2.2.2 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的鉴定 |
| 2.2.3 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的评估 |
| 2.2.4 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取制备 |
| 2.2.5 小型猪腹腔镜下肝缺血再灌注合并部分切除模型的建立 |
| 2.2.6 腹腔镜建立肝缺血再灌注合并部分切除模型的安全性监测 |
| 2.2.7 小型猪ADSC-CM对血液常规指标的影响 |
| 2.2.8 小型猪ADSC-CM对肝组织形态学观察 |
| 2.2.9 小型猪ADSC-CM对肝脏酶谱的影响 |
| 2.2.10 小型猪ADSC-CM对肝脏氧化应激的影响 |
| 2.2.11 小型猪ADSC-CM对炎症反应的影响 |
| 2.2.12 小型猪ADSC-CM对肝细胞凋亡的影响 |
| 2.2.13 小型猪ADSC-CM对肝再生的影响 |
| 2.2.14 小型猪ADSC-CM成分检测 |
| 2.2.15 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 小型猪脂肪间充质干细胞的分离培养和形态比较 |
| 3.2 小型猪脂肪间充质干细胞的鉴定 |
| 3.2.1 表面抗原的鉴定 |
| 3.2.2 成骨分化能力的鉴定 |
| 3.2.3 成脂分化能力的鉴定 |
| 3.2.4 成肝分化能力的鉴定 |
| 3.3 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的评估 |
| 3.3.1 增殖能力的比较 |
| 3.3.2 迁移能力的比较 |
| 3.4 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取制备 |
| 3.4.1 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取 |
| 3.4.2 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的浓缩 |
| 3.5 腹腔镜建立肝损伤模型安全性监测结果 |
| 3.6 血液常规指标检测结果 |
| 3.6.1 白细胞(WBC) |
| 3.6.2 中性粒细胞(NE) |
| 3.6.3 淋巴细胞(LY) |
| 3.7 肝组织形态学观察结果 |
| 3.7.1 肝脏病理结构观察结果 |
| 3.7.2 肝脏超微结构观察结果 |
| 3.8 术后肝脏酶谱检测结果 |
| 3.8.1 谷丙转氨酶(ALT) |
| 3.8.2 谷草转氨酶(AST) |
| 3.8.3 碱性磷酸酶(ALP) |
| 3.8.4 乳酸脱氢酶(LDH) |
| 3.8.5 总胆红素(TBIL) |
| 3.8.6 总蛋白(TP) |
| 3.9 肝组织氧化应激检测结果 |
| 3.9.1 丙二醛(MDA) |
| 3.9.2 超氧化物歧化酶(SOD) |
| 3.9.3 过氧化氢酶(CAT) |
| 3.9.4 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) |
| 3.9.5 髓内过氧化物酶(MPO) |
| 3.10 炎症反应水平检测结果 |
| 3.10.1 血清炎症相关指标检测结果 |
| 3.10.2 肝脏组织炎症相关基因水平检测结果 |
| 3.11 肝细胞凋亡水平检测结果 |
| 3.11.1 肝脏组织凋亡相关酶活性检测结果 |
| 3.11.2 肝脏组织凋亡相关基因水平检测结果 |
| 3.11.3 肝脏组织凋亡相关蛋白水平检测结果 |
| 3.11.4 肝脏组织Fas和Fasl免疫组织化学染色结果 |
| 3.11.5 肝脏组织TUNEL染色结果 |
| 3.12 肝脏再生水平检测结果 |
| 3.12.1 血清再生相关指标检测结果 |
| 3.12.2 组织再生相关基因检测结果 |
| 3.12.3 组织再生相关蛋白检测结果 |
| 3.12.4 肝脏组织Ki67免疫组织化学染色结果 |
| 3.13 小型猪ADSC-CM成分分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ADSCs培养方法的改良 |
| 4.2 ADSC-CM对肝脏缺血再灌注损伤的研究基础 |
| 4.3 ADSC-CM对小型猪肝脏功能的影响 |
| 4.4 ADSC-CM对小型猪氧化应激的影响 |
| 4.5 ADSC-CM对小型猪炎症反应的影响 |
| 4.6 ADSC-CM对小型猪细胞凋亡的影响 |
| 4.7 ADSC-CM对小型猪肝脏再生的影响 |
| 4.8 小型猪ADSC-CM成分分析的探讨 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（2）胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 英文略缩词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨髓间充质干细胞的修饰在治疗急性肝功能衰竭的研究进展及现状 |
| 参考文献 |
| 硕士学位期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（3）超声靶向微泡破坏介导BMSCs修复大鼠急性肝损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 第一章 大鼠BMSCs的分离、培养、鉴定 |
| 前言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 大鼠急性肝损伤模型的建立与评估 |
| 前言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 UTMD促进BMSCs靶向归巢急性肝损伤大鼠肝脏 |
| 前言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 UTMD增强BMSCs对急性肝损伤的修复作用 |
| 前言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表的论文 |
（4）骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 国内外研究概况 |
| 第一部分 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（5）丝素蛋白基大孔微载体共培养C3A细胞治疗大鼠急性肝衰竭的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 一 急性肝功能衰竭的修复机制与临床治疗 |
| 二 肝细胞来源 |
| 三 微载体培养技术 |
| 四 论文工作的提出 |
| 第二章 丝素蛋白基大孔微载体C3A细胞复合物的构建及细胞功能检测 |
| 前言 |
| 一 实验试剂与实验设备 |
| 二 实验方法 |
| 三 实验结果 |
| 四 结论 |
| 五 讨论 |
| 第三章 SF/GC大孔微载体C3A细胞复合物治疗大鼠急性肝衰模型作用的研究 |
| 前言 |
| 一 实验材料与试剂 |
| 二 实验方法 |
| 三 实验结果 |
| 四 结论 |
| 五 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附录 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（6）人源性生物人工肝的制备及临床前研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、主要实验试剂 |
| 二、主要仪器设备和耗材 |
| 三、实验动物 |
| (一) 裸鼠 |
| (二) 恒河猴 |
| 四、主要实验方法 |
| (一) IHH的大规模培养 |
| 1. IHH平面培养 |
| 2. 细胞免疫荧光染色检测IHH细胞纯度 |
| 3. IHH种子细胞库的建立 |
| 4. 微载体大规模培养IHH |
| (二) 微载体培养IHH的体外解毒功能 |
| 1. 微载体培养IHH与肝衰竭血浆共孵育 |
| 2. 微载体培养IHH抵抗肝衰竭血浆细胞毒作用 |
| (三) 人源性生物人工肝的构建 |
| 1. 细胞反应器的构建 |
| 2. 细胞反应器的再生 |
| 3. 人源性生物人工肝的构建 |
| (四) 人源性生物人工肝的体外解毒功能 |
| (五) 人源性生物人工肝的体内解毒功能 |
| 1. IHH-微载体腹膜透析治疗ALF小鼠 |
| 2. 人源性生物人工肝对ALF恒河猴的治疗 |
| (六) 人源性生物人工肝的安全性分析 |
| 1. 染色体核型分析 |
| 2. SCID鼠成瘤性实验 |
| 五、统计学分析 |
| 结果 |
| 一、IHH的大规模培养 |
| (一) IHH细胞纯度鉴定 |
| (二) IHH种子细胞库的建立 |
| (三) IHH的微载体培养 |
| 二、微载体培养IHH的体外解毒功能 |
| (一) 微载体培养IHH的体外解毒功能 |
| (二) 微载体培养IHH抵抗肝衰竭血浆细胞毒作用 |
| 三、人源性生物人工肝的构建和体外解毒功能 |
| 四、人源性生物人工肝的体内解毒功能 |
| (一) IHH-微载体腹膜透析治疗ALF小鼠 |
| 1. 小鼠ALF模型的制备 |
| 2. IHH-微载体治疗对ALF裸鼠生存率的影响 |
| 3. 肝组织病理学分析 |
| 4. 微载体上IHH免疫组化染色检查 |
| (二) 人源性生物人工肝对ALF恒河猴的治疗 |
| 1. 恒河猴急性肝衰竭模型的制备 |
| 2. 人源性生物人工肝治疗ALF恒河猴 |
| 五、人源性生物人工肝的安全性评价 |
| (一) 染色体核型分析 |
| (二) 实验动物成瘤 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 肝细胞与骨髓MSCS最适共培养体系的建立和规律研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 骨髓MSCS参与肝细胞培养的作用机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 骨髓MSCS共培养下的肝细胞蛋白质组学研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 骨髓MSCS诱导肝细胞耐受肝功能衰竭血清的实验研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述一 生物人工肝中细胞材料的研究进展 |
| 综述二 肝细胞与非实质细胞体外共培养的研究进展 |
| 综述三 猪源性生物人工肝支持系统的安全性问题 |
| 综述四 肝功能衰竭血浆在终末期肝病细胞疗法中的作用 |
| 综述五 肝中静脉在成人活体右半肝移植中的应用研究进展 |
| 攻读博士学位期间科研工作情况 |
| 致谢 |
（8）微囊化罗非鱼肝细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验观察（论文提纲范文）
| 中英文缩略语对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 第2章 罗非鱼肝细胞的分离以及微囊制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 形态学观察 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 微囊化罗非鱼肝细胞移植治疗急性肝功能衰竭 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.1 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 综述 异种肝细胞移植的研究进展 |
| 附录 B 待发表论文 微囊化罗非鱼肝细胞治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究 |
| 个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果 |
（9）同种异体肝细胞腹腔内移植联合ALR治疗大鼠急性肝衰竭的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：同种异体肝细胞腹腔内移植联合 ALR 治疗大鼠急性肝衰竭的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 结果 |
| 2.1 大鼠急性肝衰竭模型 |
| 2.2 原代肝细胞分离及培养结果 |
| 2.3 大鼠存活情况 |
| 2.4 组织学 |
| 2.5 生化指标水平 |
| 2.6 TNF-α、IL-1β水平 |
| 2.7 免疫组化结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 肝细胞移植治疗急性肝衰竭的进展 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（10）腹腔内移植微载体贴附共培养肝细胞与肝星状细胞治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 微载体贴附肝星状细胞与肝细胞共培养对肝细胞生物学特性的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片Ⅰ |
| 第二部分 腹腔内移植微载体贴附共培养肝星状细胞与肝细胞治疗大鼠急性肝衰竭的疗效观察 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 照片Ⅱ |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读硕士期间发表文章 |
四、微载体粘附培养的肝细胞腹腔内移植治疗急性肝功能衰竭大鼠的实验研究（论文参考文献）
- [1]ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究[D]. 焦智慧. 东北农业大学, 2020(04)
- [2]胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的作用与机制研究[D]. 陈笑艳. 南京医科大学, 2019(04)
- [3]超声靶向微泡破坏介导BMSCs修复大鼠急性肝损伤的实验研究[D]. 孙婷. 上海交通大学, 2019(06)
- [4]骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究[D]. 袁淑芳. 新疆医科大学, 2013(02)
- [5]丝素蛋白基大孔微载体共培养C3A细胞治疗大鼠急性肝衰竭的实验研究[D]. 郭伟. 南方医科大学, 2013(03)
- [6]人源性生物人工肝的制备及临床前研究[D]. 房青. 北京协和医学院, 2010(07)
- [7]骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养的实验研究[D]. 顾劲扬. 南京医科大学, 2009(12)
- [8]微囊化罗非鱼肝细胞移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验观察[D]. 刘妍芳. 同济大学, 2007(10)
- [9]同种异体肝细胞腹腔内移植联合ALR治疗大鼠急性肝衰竭的研究[D]. 张艳. 重庆医科大学, 2007(02)
- [10]腹腔内移植微载体贴附共培养肝细胞与肝星状细胞治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究[D]. 林建扬. 福建医科大学, 2007(01)