一、柔嫩艾美球虫重组质粒pVAX1-Mzp57的免疫保护性试验（论文文献综述）
程振扬[1]（2021）在《柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价》文中指出鸡球虫病是一种呈全球性分布的寄生性原虫病,其病原有7种,其中柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）和毒害艾美耳球虫（E.necatrix）的致病性最强,分别引起鸡的急性盲肠球虫病和小肠球虫病,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前,鸡球虫病的防治措施主要有在饲料或饮水添加药物和接种活虫苗两种方法。长期添加药物已引起耐药、污染环境和危害肉蛋品质等问题。活虫苗虽可产生较强的免疫保护效果,但存在着扩散病原、毒力返强等缺点,且生产成本较高,对免疫后鸡群的饲养管理要求较高。而基因工程疫苗可以解决这些难题。本实验室前期对柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白Etgam22和Etgam59基因进行了克隆与原核表达,获得的重组蛋白rEtGAM22和rEtGAM59能被柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染鸡的康复血清识别,可提高免疫鸡的平均增重、降低卵囊产量。在此基础上,本研究利用杆状病毒表达系统对Etgam22基因进行表达,通过动物试验评价其对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的免疫保护力,并与原核表达的重组蛋白进行比较,最后通过动物试验评价rEtGAM22和rEtGAM59联合免疫的保护效果,为研制重组配子体抗原亚单位疫苗奠定基础。1.柔嫩艾美耳球虫gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析将优化后的Etgam22基因插入转座载体pFastbac1构建重组质粒,命名为pFastbac1-Etgam22;然后将pFastbacl-Etgam22转化到DH1OBac感受态细胞,构建重组杆状病毒穿梭载体,命名为Bacmid-Etgam22;将Bacmid-Etgam22转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,命名为reBac-Etgam22。重组杆状病毒在Sf9细胞诱导表达,获得真核表达蛋白rEtGAM22-e,其大小约35 kDa。用IFA检测结果显示重组蛋白能被抗原核表达蛋白rEtGAM22-p多克隆抗体识别;Western blot检测结果显示重组蛋白可被鼠抗His单抗特异性识别,也可被鼠抗重组蛋白多克隆抗体,以及柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫感染的鸡阳性血清特异性识别,显示真核表达蛋白rEtGAM22-e具有良好的反应原性和交叉反应原性。2.真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析以黄羽鸡为试验动物,主要以成活率、平均增重、病变记分、卵囊减少率、抗球虫指数、血清抗体水平等为指标,评价杆状病毒表达蛋白rEtGAM22-e对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果,并与原核表达蛋白rEtGAM22-p和rEtGAM59相比较。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:免疫组成活率均为100%,未免疫攻虫组为90%;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e组平均增重稍次于重组蛋白rEtGAM59组,但高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组病变记分高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组和rEtGAM59组;真核表达蛋白rEtGAM22-e组卵囊减少率高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组;原核表达蛋白rEtGAM59组ACI最高,为158.83;真核表达蛋白rEtGAM22-e组血清抗体水平显着高于原核表达蛋白rEtGAM22-p组,但低于rEtGAM59组。（2）对毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但ACI值要低。结论:rEtGAM22和rEtGAM59对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫能产生一定的免疫保护力;真核表达的重组蛋白rEtGAM22-e免疫保护力稍高于原核表达的重组蛋白rEtGAM22-p;重组蛋白rEtGAM59免疫保护效力高于重组蛋白rEtGAM22。3.重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析按上一章方法,评价rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫对柔嫩艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫的免疫保护效果。结果显示:（1）对柔嫩艾美耳球虫的免疫保护力:各试验组存活率均为100%;除rEtGAM22-e单免组外,其余各免疫组的平均增重均显着大于未免疫攻虫组（P<0.05）,且与未免疫未攻虫组相比差异不显着（P>0.05）;联合免疫低剂量组病变记分最低;联合免疫组卵囊减少率相近,分别为46.21%和44.70%,高于单免组;联合免疫组的抗球虫指数分别为153.43和157.65,高于单免组;联合免疫组的血清抗体水平显着高于单免组（P<0.05）。（2）对攻毒害艾美耳球虫的免疫保护力:与对柔嫩艾美耳球虫的相似,但抗球虫指数分别为158.28和160.34。结论:rEtGAM22-e和rEtGAM59联合免疫保护效力高于单一重组蛋白免疫,联合免疫剂量100 μg（50+50）的保护效力要好于200 μg（100+100）剂量。
刘剑华,袁橙,张光际,张步彩,韩贵龄,李长乐[2]（2020）在《鸡柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1（AMA1）的免疫保护效果评估》文中认为为评估顶膜抗原1（AMA1）对柔嫩艾美耳球虫感染的免疫保护效果,试验提取纯化了柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊总RNA,利用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫AMA1基因（EtAMA1）膜外区片段。将EtAMA1基因膜外区片段克隆入pVAX1.0中,获得真核表达重组质粒pVAX-EtAMA1。用柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊人工接种雏鸡,考察接种前后雏鸡体重变化、肠道病变记分及排出卵囊的减少量,评估重组质粒pVAX-EtAMA1对柔嫩艾美耳球虫感染的免疫保护效果。结果表明:EtAMA1基因膜外区片段为1 281 bp,编码427个氨基酸。用pVAX-EtAMA1免疫后,各试验组之间的平均增重1差异不显着（P>0.05）,pVAX-EtAMA1质粒免疫试验组和非免疫感染对照组、非免疫非感染对照组之间平均增重2差异显着（P<0.05）,且pVAX-EtAMA1质粒免疫试验组盲肠病变记分、克盲肠内容物卵囊数均低于3个对照组,pVAX-EtAMA1质粒免疫试验组、pVAX1.0空质粒免疫感染对照组、非免疫感染对照组、非免疫非感染对照组的抗球虫指数分别为176.90,134.55,106.81,200。pVAX-EtAMA1质粒免疫试验组鸡体重显着增加（P<0.05）,盲肠损伤减轻,卵囊产量也明显下降。说明顶膜抗原1（AMA1）可对柔嫩艾美耳球虫感染提供一定的免疫保护力,并有望成为研制抵抗柔嫩艾美耳球虫野外感染疫苗的候选抗原。
刘亭岐[3]（2018）在《巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是家禽的肠道胞内寄生原虫病。该病严重影响饲料转化效率,所以造成严重的损失。鸡球虫病目前基本通过使用化学药物进行预防治疗,然而,随着耐药性的产生和食品安全问题日益突出,有效的疫苗预防措施备受关注。本研究选取了四种巨型艾美耳球虫（Eimeria maxima）侵入过程相关的蛋白,进行克隆、表达并评价其免疫保护力,旨在为发现新抗原以及评价其对宿主在抗巨型艾美耳球虫感染过程中所产生的免疫保护力,提供新型疫苗候选保护性抗原。1.巨型艾美耳球虫表面蛋白基因的分子特性研究及免疫保护性研究评估本章研究成功扩增了E.maxima表面蛋白（EmSAG）的开放阅读框（ORF）,序列分析后发现该基因由645对碱基所组成,编码214个氨基酸。随后,将EmSAG基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。激光共聚焦试验结果证实,EmSAG在巨型艾美耳球虫的子孢子表面分布,试验结果同时发现EmSAG也存在于裂殖子的表面。动物实验证实,rEmSAG和pVAX1-SAG都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmSAG疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS,pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组的雏鸡相比,EmSAG免疫组中CD4+T和CD8+T细胞的百分含量均显着增高（P<0.05）。试验发现,与PBS,pET-32a（+）和pVAX1对照组相比,rEmSAG和pVAX1-SAG免疫组的雏鸡血清中抗EmSAG特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmSAG和pVAX1-SAG免疫组的雏鸡,血清中细胞因子IL-4、IL-17、IFN-y与TGF-β含量显着增加（P<0.05）。本章研究结果表明,EmSAG可作为诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫的保护性抗原,为研发巨型艾美耳球虫的新疫苗提供参考。2.巨型艾美耳球虫延伸因子2基因的克隆、表达及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima延伸因子2（elongation factor 2,EmEF2）完整的开放阅读框（ORF）,序列分析后发现该基因由2499对碱基组成,编码832个氨基酸。随后,将EmEF2基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。动物实验证实,rEmEF2和pVAX1-EF2都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmEF2疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS,pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组的雏鸡相比,EmEF2免疫组中CD4+T细胞的百分含量显着增高（P<0.05）。试验发现,与PBS、pET-32a（+）和pVAX1对照组相比,rEmEF2和pVAX1-EF2免疫组的雏鸡血清中抗EmEF2特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmEF2和pVAX1-EF2免疫组的雏鸡,血清中IFN-γ,TGF-β含量显着增加（P<0.05）。这些结果表明,EmEF可作为诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫的保护性抗原,为研发巨型艾美耳球虫的新疫苗提供备选抗原。3.巨型艾美耳球虫14-3-3基因的克隆、表达及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima14-3-3基因（Em14-3-3）完整的开放阅读框（ORF）,序列分析发现该基因由861bp对碱基组成,编码286个氨基酸。随后,将Em14-3-3基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。使用激光共聚焦试验对Em14-3-3进行亚细胞定位,试验结果表明Em14-3-3在巨型艾美耳球虫的子孢子和裂殖子阶段都有表达。动物试验证实,rEm14-3-3和pVAX1-14-3-3都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。Em14-3-3疫苗可增加雏鸡的卵囊减少率,使其ACI值超过160。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组相比,Em14-3-3免疫组中CD4+T细胞的百分含量显着增高（P<0.05）。与 PB S、pET-32a（+）和 pVAX 1 对照组雏鸡相比,rEm 14-3-3 和 pVAX 1-14-3-3免疫组的雏鸡,抗Em14-3-3特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEm14-3-3和pVAX1-14-3-3免疫组的雏鸡,血清中IFN-γ和TGF-β水平显着增加（P<0.05）。这些结果表明,Em14-3-3可诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫,为新型巨型艾美耳球虫疫苗的研发打下基础。4.巨型艾美耳球虫棒状体蛋白基因分子特性及免疫保护性研究本研究成功扩增了E.maxima棒状蛋白（EmRON）的开放阅读框（ORF）,序列分析发现该基因由2475对碱基组成,编码824个氨基酸。随后,将EmRON基因全长分别亚克隆到pET-32a（+）和pVAX1中。RT-PCR和免疫印迹分析证实靶基因成功转录并在雏鸡体内表达。动物实验证实,rEmRON和pVAX1-RON都可以明显减轻空肠病变,提高相对增重率。EmRON疫苗可减少雏鸡的卵囊排出量,使其ACI值超过160。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1免疫对照组雏鸡相比,EmRON免疫组中CD4+T细胞的的百分含量显着增高（P<0.05）。与PBS、pET-32a（+）和pVAX1对照相比,rEmRON和pVAX1-RON免疫组的雏鸡,抗EmRON特异性抗体水平明显升高（P<0.05）。与各对照组相比,rEmRON和pVAX1-RON免疫组的雏鸡,血清中细胞因子IFN-γ,TGF-β和IL-4水平显着增加（P<0.05）。这些结果表明,EmRON可诱导雏鸡产生体液免疫和细胞免疫,为巨型艾美耳球虫疫苗的研发提供候选抗原。
刘连瑞[4]（2016）在《三种鸡球虫的免疫蛋白组学研究及共同抗原的确定》文中指出鸡球虫病是养禽生产中一种分布广泛、危害严重的原虫病。目前为止鸡球虫病的防控主要以化学药物为主。但随着这些抗球虫药的普遍使用,新的问题不断暴露出来,鸡球虫的耐药性、抗球虫药的药物残留、动物源食品安全问题让兽医科技工作者陷入了更大的困扰。随着科对球虫免疫机理研究的不断深入,研究人员将眼光放在了球虫疫苗的研发上。本研究通过免疫蛋白质组学的方法研究不同种鸡球虫的免疫原性抗原,旨在发现一批具有良好免疫原性的,3种球虫之间的共同抗原,并对这些共同抗原抵抗多种球虫混合感染的效果进行评估,为临床上鸡球虫的混合感染的预防提供参考。1柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫孢子化卵囊的免疫蛋白组学分析采用免疫蛋白组学的方法,对E.tenella（柔嫩艾美耳球虫）、E.acervulina.（堆型艾美耳球虫）和E.maxima（巨型艾美耳球虫）三种鸡球虫的可溶性蛋白进行了免疫蛋白组学的分析。通过对3种球虫孢子化卵囊蛋白的2-D电泳分析,分别检测到626个E.acervulina蛋白点,632个E.maxima蛋白点和629个E.tenella蛋白点。通过Western blot 分析,E.tentlla、E.anervulina和E.maxina 分别有 50 个、64 个和 57 个蛋白点能被鸡球虫抗血清识别。质谱分析结果显示112个蛋白点对应了 96种蛋白,其中烯醇化酶2,延长因子2,乳酸脱氢酶,3-磷酸甘油醛脱氢酶,14-3-3蛋白,微线蛋白2,遍在蛋白缀合酶结构域等一些已知蛋白被检索到。59个点检索没有结果。基于免疫原性蛋白的的在线分析与序列比对,将核苷酸序列同源性在3个种之间在91%以上的抗原确定为共同抗原,最终我们得到延长因子2、遍在蛋白缀合酶结构域、14-3-3蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶四种共同抗原。2两种共同抗原基因克隆及真核表达质粒的构建选取了 ubiquitin-conjugating enzyme domain-containing protein,putative[Eimeria acervulina]和14-3-3 protein,putative[Eimeria acervulina]两个蛋白的基因对其克隆。根据它们的GenBank中收录的核苷酸序列设计特异性引物。以堆型艾美耳球虫的cDNA作为模板,对上述共同抗原基因进行PCR扩增,分别扩增出了 444bp、837bp的片段,将扩增产物连接入pVAX1.0载体中,对阳性克隆进行双酶切鉴定,并送至公司进行序列测定,并将测序的结果进行在线比对。结果显示双酶切鉴定切下了 450、900bp左右的条带,与预期目的条带大小一致,序列测定结果显示所得的核苷酸序列与GenBank中登陆的核苷酸序列（XM013391686,XM013394831）同源性为100%,表明已经成功克隆出了共同抗原基因EaUCE和Ea14-3-3,并且成功构建了真核表达质粒 pVAX-EaUCE 和 pVAX-Ea14-3-3。3真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3诱导T淋巴细胞亚类反应和细胞因子变化用100μg真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3经腿部肌肉注射免疫14日龄雏鸡,一周后加强免疫。首次免疫后7天和加强免疫后7天,分别分离鸡脾脏淋巴细胞,用流式细胞术检测CD4+/CD3+、CD8+/CD3+的比例。结果发现首免后第7天和2次免疫后7天,重组质粒免疫组的的脾脏T淋巴细胞水平显着高于PBS和pVAX1空质粒对照组（P<0.05）。结果表明,共同蛋白真核表达质粒能够有效地诱导鸡T淋巴细胞反应。用实时荧光定量PCR方法,检测脾脏中IFN-γ、IL-2、IL-4、TNFSF15、IL-17D和TGF-βmRNA水平。结果发现,首免7天后和2次免疫第7天后,与PBS和空载体对照组相比,重组质粒免疫组鸡脾脏IFN-γ、IL-2、TNFSF15、IL-17D和TGF-βmRNA 水平显着升高（P<0.05）,表明共同抗原蛋白真核表达质粒能够有效地诱导鸡体内细胞因子分泌。4真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3诱导的抗体反应使用2种构建的pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3真核表达质粒免疫14日龄雏鸡,对照组为PBS组和pVAX1空质粒组。21日龄时,以同样剂量进行二免。一周后心脏采血,分离血清。每隔一周心脏采血一次,持续6周。用堆型艾美耳球虫孢子化卵囊可溶性蛋白作为包被抗原。通过间接ELISA方法检测血清中IgG水平。结果表明,加强免疫后第一周到第六周,pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3组抗体滴度显着高于PBS组和pVAX1空质粒组。免疫组抗体滴度从第一周到第三周缓慢上升,并在第四周左右到达高峰,之后抗体滴度逐渐下降。而PBS组和pVAX1空质粒组均未检测到特异性抗体。试验表明,构建的真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3均能诱导鸡产生特异性抗体。5真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3的免疫保护性研究将本试验所构建的pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3分别于14日龄雏鸡腿部肌肉注射100μg真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3,21日龄加强免疫。对照组注射PBS和pVAX1空质粒。28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余分别经口接种新鲜的E.tenella、E.acervulina、E.maxima和混合孢子化卵囊。6天后剖杀所有实验鸡,对增重、肠道内容物卵囊数、肠道病变记分和抗球虫指数（ACI）等指标进行统计。结果发现 pVAX-Ea14-3-3 免疫组,在感染E.tenella、E.acervulina、E.maxima和混合孢子化卵囊后,每组的ACI均大于160,说明真核表达质粒pVAX-Ea14-3-3能够对E.tenella、E.acervulina、E.maxima和混合孢子化卵囊的感染起到良好的免疫保护效果;真核表达质粒pVAX-EaUCE免疫组相比对照组,肠道病变值、卵囊数有所降低,鸡的相对增重率比对照组要高,这说明我们构建的真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3不仅能够抵抗单种鸡球虫的感染,而且能够抵抗三种球虫的混合感染。
黄经纬[5]（2016）在《巨型艾美耳球虫四种微线蛋白的免疫保护性及与鸡肠上皮细胞的结合能力》文中提出鸡球虫病是由细胞内寄生的原虫——艾美耳属球虫（Eimeria）引起的全球性兽医卫生问题。鸡球虫病导致鸡群体重增长缓慢,料肉比降低和高死亡率,给养殖户收益和市场上的禽肉供给带来了巨大损害。目前世界上得到普遍公认的鸡球虫种有七个,其中E.acervulina、E.nectrix、Emaxima和E.tenella最普发。鸡艾美耳球虫在鸡肠道内寄生的部位体现出高度的特异性,比较典型的有E.acervulina主要寄生于十二指肠,E.maxima主要寄生于空肠,E.tenella主要寄生于盲肠,而E.brunetti则主要寄生于直肠。已有研究指出E.tenella微线蛋白3 （EtMIC3）是决定E.tenella寄生于盲肠的关键分子,然而决定E.maxima寄生部位的关键分子尚未见报道。因此研究E.maxima与鸡空肠上皮细胞之间互作的分子机制有利于更深入的掌握E.maxima入侵的分子机制也有助于制定防控鸡球虫感染的策略。本研究鉴定了鸡空肠上皮细胞E.maxima子孢子结合蛋白,并选取四种E.maxima微线蛋白进行克隆、表达并评价其免疫保护力,旨在阐明决定E.maximE入侵部位特异性的关键分子,并为研发新型抗E.maxima疫苗筛选理想的候选抗原。1.巨型艾美耳球虫子孢子空肠上皮细胞结合蛋白的鉴定本研究旨在鉴定E.maxima子孢子空肠上皮细胞结合蛋白并分析其蛋白功能。应用免疫共沉淀方法收集E.maxima子孢子空肠上皮细胞结合蛋白,鸟枪测序法-液相色谱质谱/质谱联用（shotgunLC-MS/MS）对蛋白进行质谱鉴定并进行生物信息学分析。试验结果显示共有35种unique peptide count ≥ 2的E.Emaxima子孢子蛋白被鉴定,其中包括入侵相关蛋白MIC2、MIC7和MIC3。生物信息学分析结果显示该35种蛋白均被成功注释,其中22种（62.86%）蛋白被预测有结合活性,15种（42.86%）蛋白被预测有催化活性。这些蛋白可能参与E.maxima入侵宿主细胞的过程以及宿主靶细胞的功能调节过程。本篇研究结果为我们进一步探明E.maxima和鸡空肠上皮细胞之间的相互作用提供基础,同时也为更好的阐释E.maxima致病的分子机理提供依据。2.巨型艾美耳球虫微线蛋白3基因的克隆、表达及免疫保护性研究本章研究运用快速扩增 cDNA 末端（rapid-ampilification of cDNA ends,RACE）技术获得巨型艾美耳球虫微线蛋白3基因（EmMIC3）的完整ORF。分别从主动免疫和被动免疫两方面评价重组MIC3蛋白（rEmMIC3）对E.maxima感染的免疫保护作用,并测定rEmMIC3免疫鸡的血清特异性抗体、细胞因子及脾脏淋巴细胞增殖能力的变化。免疫保护试验结果显示rEmMIC3免疫组在空肠病变记分、OPG和相对增重方面均与各对照组的差异均显着（P<0.05）,其ACI为186.02;被动免疫试验结果显示三个不同稀释浓度的大鼠抗rEmMIC3血清免疫相比于各对照组均能够显着减轻空肠病变,减少卵囊排出并提高相对增重率（P<0.05）,且试验组的ACI均高于于183。血清特异性抗体检测结果表明rEmMIC3免疫鸡血清特异性抗体浓度在首免疫一周后得到显着提高,并在整个试验期间试验组特异性抗体浓度均显着高于对照组。血清细胞因子检测结果显示rEmMIC3免疫能够显着上调血清细胞因子IL-2与IL-4（P<0.05）。CCK-8试验结果表明rEmMIC3能够显着增强鸡脾脏淋巴细胞的增殖效应（P<0.05）。综上结果表明EmMIC3基因免疫原性较好,能够诱导鸡体产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,对E.maxima感染提供优秀的免疫保护力,可作为理想的E.maxima疫苗候选抗原。3.巨型艾美耳球虫微线蛋白2基因的克隆、表达及免疫保护性研究本章应用PCR技术扩增第三章鉴定的EmMIC2基因（FR718971.1）,构建了重组原核表达质粒pET-32a（+）-MIC2和真核表达质粒pVAX1-MIC2。动物免疫保护试验被应用于评估rEmMIC2和pVAX1-MIC2对E.maxima感染的免疫保护力,同时检测了rEmMIC2和pVAX1-MIC2免疫鸡血清特异性抗体、细胞因子和脾脏淋巴细胞增殖效应。免疫保护试验结果显示空肠病变记分、OPG和相对增重等指标方面,rEmMIC2和pVAX1-MIC2组与各对照组差异均显着（P<0.05）,rEmMIC2组和pVAX1-MIC2组的ACI均大于165。血清特异性抗体检测结果表明rEmMIC2和pVAX1-MIC2均能在首次免疫一周后提高鸡体血清特异性抗体浓度,在加强免疫一周后特异性抗体水平达到最大值,并且均显着高于各对照组的特异性抗体水平（P<0.05）。血清细胞因子检测结果显示rEmMIC2和pVAX 1-MIC2免疫均能引起鸡体产生更高水平的IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ、TGF-β与IL-4,且与对照组差异显着（P<0.05）。MTT试验结果显示rEmMIC2和pVAX1 -MIC2免疫鸡脾脏淋巴细胞增殖能力均显着高于对照组（P<0.05）。上述结果表明EmMIC2免疫能够诱导鸡体产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,具有中等的免疫保护性,可作为理想的E.maxima疫苗候选抗原。4.巨型艾美耳球虫微线蛋白7基因的克隆、表达及免疫保护性研究本章应用PCR技术扩增第三章鉴定的EmMIC7基因（FR718975）,构建了原核表达质粒pET-32a（+）-MIC7和真核表达质粒pVAX1-MIC7。应用动物保护试验评价rEmMIC7和pVAX1-MIC7对E.maxima感染的免疫保护力,同时也测定了 rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫鸡的血清特异性抗体、细胞因子和脾脏淋巴细胞增殖能力。免疫保护试验结果显示相比于对照组,rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫均能够显着减轻空肠病变记分、减少OPG并提高相对增重率（P<0.05）。rEmMIC7和pVAX1-MIC7组的ACI均大于167。血清特异性抗体检测结果表明rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫一周后提高鸡体血清特异性抗体浓度,在加强免疫一周后特异性抗体浓度达到最大值,并且均显着高于各对照组（P<0.05）。血清细胞因子检测结果显示rEmMIC7和pVAXI-MIC7 免疫均能显着上调鸡体 IL-2、IL-10、IL-17、IFN-γ、TGF-β 与 IL-4 浓度（P<0.05）。MTT试验结果显示rEmMIC7和pVAX1-MIC7免疫鸡脾脏淋巴细胞增殖能力均得到显着提高（P<0.05）。综上结果表明EmMIC7免疫能够诱导鸡体产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,具有中等的免疫保护性,可作为理想的E.maxima疫苗候选抗原。5.巨型艾美耳球虫顶膜抗原1基因的克隆、表达及免疫保护性研究本章应用PCR技术扩增EmAMA1基因（FN813221.1）,构建了串联EmAMA1基因功能域的重组原核表达质粒pET-32a（+）-EmAMA1FD和真核表达质粒pVAX1-EmAMA1FD。应用动物免疫保护试验评价rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD的免疫保护力同时也检测了 rEmAMA1FD和pVAX1- EmAMA1FD免疫鸡的血清特异性抗体、细胞因子和脾脏淋巴细胞增殖效应。免疫保护试验结果显示,rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD免疫组在空肠病变记分、OPG和相对增重等方面均与对照组的差异均显着（P<0.05）,rEmAMA1FD 免疫组的 ACI 为 176.68,pVAX1-EmAMA1FD免疫组的ACI为180.35。血清特异性抗体检测结果表明rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD免疫均能在首次免疫一周后提高鸡血清特异性抗体浓度,在整个采样期间试验组特异性抗体浓度均显着高于各对照组（P<0.05）。血清细胞因子检测结果显示rEmAMA1FD和pVAX1-EmAMA1FD免疫能够显着提高血清细胞因子引起鸡体产生显着高水平的IL-2、TGF-β与IL-4 （P<0.05）。CCK-8试验结果表明rEmAMA1FD能够显着增强鸡脾脏淋巴细胞增殖效应（P<0.05）。综上结果表明EmAMA1FD免疫原性较强,能够诱导鸡体产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,对E.maxima感染具有较好的免疫保护性,可作为理想的E.maxima疫苗候选抗原。6.重组MIC蛋白与鸡肠上皮细胞的结合能力本章旨在检测已获得的四种重组E.maxima微线蛋白与不同鸡肠段的结合能力。取无球虫鸡不同的肠段（十二指肠、空肠、盲肠和直肠）制备冰冻切片,应用免疫荧光方法检测前述表达并纯化的四种重组E.maxima微线蛋白——rEmMIC3、rEmMIC2、rEmMIC7和rEmAMA1FD与不同鸡肠段的结合能力。试验结果显示rEmMIC3只与鸡空肠结合,与十二指肠、盲肠和直肠均不结合,而rEmMIC2、rEmMIC7和rEmAMA1FD与各肠段均不结合。该结果提示仅鸡空肠上皮细胞上存在EmMIC3基因受体,EmMIC3可能是决定E.maxima侵入部位特异性的关键分子,在E.maxima入侵宿主靶细胞的过程中发挥重要功能。
赵胜杰[6]（2012）在《鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫程序及其稳定性试验》文中认为鸡球虫病是严重危害养禽业发展的重要疾病之一,危害比较严重的主要有柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫4个种,临床上往往为混合感染,因此研制抵抗这4种鸡球虫混合感染的多价疫苗显得十分迫切,本实验室已经构建了抵抗4种球虫的混合多价DNA疫苗和多价多表位DNA疫苗,初步显示了良好的免疫保护效果,为了比较球虫DNA疫苗和弱毒苗及抗球虫化学药物的保护效果以及进一步提高多价DNA疫苗的免疫保护效果,本研究比较了DNA疫苗、弱毒苗COCVAC和抗球虫化学药物地克珠利对单种球虫感染和多种球虫混合感染保护效果,对混合DNA疫苗的免疫程序和稳定性进行了研究。本研究第一部分用本实验室之前构建的5种重组质粒（pVAX1.0-TA4-IL-2、 pVAX1.0-NA4-IL-2、pVAX1.0-EM8-IL-2、pVAX1.0-LDH-IL-2、pVAX1.0-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2）、抗球虫化学药物地克珠利和弱毒苗COCVAC进行单种球虫感染和多种球虫混合感染的保护性比较试验。弱毒苗试验组按照使用说明在6日龄通过饮水进行免疫；DNA疫苗试验组在14日龄通过腿部肌肉注射分别接种相应的质粒,在21日龄加强免疫。在28日龄,除非免疫非攻虫组外,其余分别经口接种新鲜的E.tenella、E.necatrix、E.maxima、E.acervulina和混合孢子化卵囊5×104个/羽、5×104个/羽、10×104个/羽、10×104个/羽、5×104个／羽。在攻虫的同时,地克珠利实验组按使用说明在饮水中添加地克珠利（1mg/L,连续给药3天）。7天后,剖杀所有试验鸡,对增重、每克肠道内容物卵囊数、肠道病变计分和抗球虫指数（ACI）等指标进行统计,检测其保护效果。结果发现,对于柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫以及混合攻虫（含柔嫩、毒害、巨型和堆型4个虫种）,DNA疫苗的保护力均高于弱毒苗COCVAC和化学药物地克珠利；对于堆型艾美耳球虫,DNA疫苗的保护力高于弱毒苗COCVAC,但略低于化学药物地克珠利。本研究第二部分是将本实验室构建的免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-TA4-IL-2、 pVAX1.0-NA4-IL-2、pVAX1.0-EM8-IL-2、pVAX1.0-LDH-IL-2按1：1：1：1混合后进行免疫程序筛选,在此基础上再进行稳定性实验。主要包括以下几个方面：1四种鸡艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫剂量的筛选将免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-TA4-IL-2、pVAX1.0-NA4-IL-2、pVAX1.O-EM8-IL-2、pVAX1.0-LDH-IL-2按1：1：1：1混合后,分别以2μg、10μg、25μg、50μg、100μg.200μg免疫雏鸡,各剂量组分别以柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫攻虫。每个虫种分别设立非免疫攻虫对照组和非免疫非攻虫对照组,共29组。结果发现,柔嫩艾美耳球虫组免疫保护效果最好的免疫剂量为10μg, ACI为191.63。毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫免疫保护效果最好的免疫剂量均为ACI分别为177.31、168.84、165.49。2鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫途径的筛选将混合DNA疫苗分别经肌肉注射、静脉注射、皮下注射、口服、滴鼻滴眼五个途径免疫雏鸡,各途径分别以柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫攻虫,每个虫种设立非免疫攻虫对照组和非免疫非攻虫对照组,共25组。结果发现,各免疫攻虫组中腿部肌肉注射组ACI均最高。其中柔嫩艾美耳球虫攻虫组ACI为162.89；毒害艾美耳球虫攻虫组ACI为179.54；巨型艾美耳球虫攻虫组ACI为174.94；堆型艾美耳球虫攻虫组ACI为167.10。腿部肌肉注射组免疫效果优于其他免疫途经组。3鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫首免日龄及免疫次数的筛选本试验设计了一周龄首免不加强免疫组、一周龄首免二周龄加强免疫组、二周龄首免不加强免疫组和二周龄首免三周龄加强免疫组四个实验组,分别免疫混合DNA疫苗。各试验组分别以柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫攻虫,同时设立了非免疫攻虫对照组和非免疫非攻虫对照组,共21组。结果发现,加强免疫组比非免疫组免疫保护效果好,除毒害艾美耳球虫攻虫组外,所有加强免疫组的ACI都大于160；二周龄首免组比一周龄首免组免疫保护效果好,二周龄首免三周龄加强免疫组效果最好。4鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫稳定性实验将混合DNA疫苗在不同的温度（-20℃、4℃和室温）下分别保存1个月、3个月、6个月,分别免疫雏鸡。各温度组分别以柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫攻虫,同时设立非免疫攻虫对照组和非免疫非攻虫对照组,共41组。结果发现,绝大多数免疫组的ACI都大于160,说明各保存条件下混合DNA疫苗都具有免疫保护效果,且在三个不同温度和不同保存时间内能保持相对稳定性。
高云路[7]（2012）在《鸡四种艾美耳球虫重组蛋白免疫保护性研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）球虫寄生于鸡肠道上皮细胞内而引起的寄生性原虫病。该病呈世界性分布,对养鸡业危害巨大。目前防治该病仍以抗球虫药为主,但由于耐药虫株的不断增多和化学药物残留问题的日益严重,使动物源性食品安全问题逐渐成为国际性的问题。重组亚单位疫苗是利用DNA重组技术,将编码保护性抗原的基因导入受体菌或细胞,使其在受体中高效表达,分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原肽链,加入佐剂即可制成重组亚单位疫苗。本实验室已经从E.tenella、E.necatrix和E.acervulina中分别克隆得到多种免疫保护性抗原基因,并成功构建了原核表达重组质粒。同时也已从E. maxima孢子化卵囊中克隆得到免疫保护性抗原基因EmTFP250的全长8个片段。本研究在此基础上展开,主要包括以下几个方面：1鸡巨型艾美耳球虫Em6和Em8基因的原核表达与纯化应用DNA重组技术,将Em6和Em8基因克隆到原核表达载体pET32a（+）中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达重组Em6和Em8蛋白。SDS-PAGE电泳显示,pET32a（+）-Em6和pET32a（+）-Em8在大肠杆菌中得到成功表达,其分子量分别在68和71kDa左右。菌体经超声破碎后的沉淀与上清的SDS-PAGE分析结果表明,2种重组蛋白均存在于上清,为可溶性蛋白。经Western blot检测,上述2种重组蛋白均可被人工感染E. maxima的鸡血清所识别。2鸡艾美耳球虫的不同重组蛋白免疫效果比较将柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）重组蛋白pET28b（+）-TA4和pET32a（+）-SO7;毒害艾美耳球虫（E.necatrix）重组蛋白pET28a（+）-NA4和pET32a（+）-NPmz19;堆型艾美耳球虫（E.acervulina）重组蛋白pET28a（+）-LDH. pET28a（+）-3-1E和pET28a（+）-MIF;巨型艾美耳球虫（E.maxima）重组蛋白pET32a（+）-Em6和pET32a（+）-Em8单独或混合免疫,14日龄经腿部肌肉注射相应的重组蛋白200μg,21日龄加强免疫,对照组注射PBS。28日龄,除白对照组外,其余各组分别经口感染新鲜的E. tenella、E. necatrixx、 E.acervulina、E.maxima孢子化卵囊5×104个/羽、5×104个/羽、10×104个/羽和10×104个/羽。各组于首免,攻虫和剖杀时逐只称重。攻虫后7d（35日龄）剖杀并逐只进行肠道病变记分和卵囊计数,并计算抗球虫指数（ACI）,检测各重组蛋白的免疫效果。结果显示：各重组蛋白对同源鸡球虫均具有免疫保护效果,并且混合蛋白的免疫效果均优于各重组蛋白单独免疫的保护效果；E. tenella、E. necatrix、E.acervulina、 E.maxima各组分别以TA4、NA4、LDH和Em8重组蛋白的免疫保护效果最佳。3鸡四种艾美耳-球虫重组蛋白交叉免疫保护性研究本实验对之前筛选出的E. tenella、E. necatrix、E.acervulina、E.maxima各组免疫保护效果最佳的重组蛋白TA4、NA4、LDH和Em8的交叉免疫保护性进行了研究。14日龄经腿部肌肉注射相应的重组蛋白200μg,21日龄加强免疫,对照组注射PBS。28日龄,除白对照组外,其余各组分别经口感染新鲜的E. tenella、E. necatrix、 E.acervulina、E.maxima孢子化卵囊5×104个/羽、5×104个/羽、10×104个/羽和10×104个/羽。各组于首免,攻虫和剖杀时逐只称重。攻虫后7d（35日龄）剖杀并逐只进行肠道病变记分和卵囊计数,并计算抗球虫指数（ACI）,检测各重组蛋白的交叉免疫效果。结果显示：TA4重组蛋白除对E. necatrix具有部分交叉免疫保护效果外（ACI=176.12）,对E.acervulina和E.maxima没有交叉免疫保护作用；NA4重组蛋白对E. tenella和E.acervulina感染具有部分交叉免疫保护作用,对E.maxima不具有交叉免疫保护作用；LDH重组蛋白对E. tenella和E. necatrix具有部分交叉免疫保护作用,而对E.maxima没有交叉免疫保护作用；Em8重组蛋白对E. tenella和E.acervulina具有部分交叉免疫保护作用对E. necatrix没有交叉免疫保护作用。4鸡四种艾美耳球虫重组蛋白混合免疫的免疫保护性研究将上述4种重组蛋白TA4、NA4、LDH和Em8等比混合后,14日龄经腿部肌肉注射相应的重组蛋白200μg,21日龄加强免疫,对照组注射PBS。28日龄,除白对照组外,其余各组分别经口感染新鲜的E.tenella、E.necatrix、E.acervulina、E.maxima孢子化卵囊5×104个/羽、5×104个/羽、10×104个/羽和10×104个/羽。各组于首免,攻虫和剖杀时逐只称重。攻虫后7d（35日龄）剖杀并逐只进行肠道病变记分和卵囊计数,并计算抗球虫指数（ACI）,检测该混合重组蛋白的免疫效果。结果显示：该混合蛋白对E.tenella、E.necatrix、E.acervulina和E. maxima均具有部分免疫保护作用,其180<ACI<170,分别为ACI=174.69、173.10、171.10和177.90。
刘颖丽[8]（2012）在《RepairPSⅡ基因重组蛋白和DNA疫苗抗柔嫩艾美耳球虫保护效果》文中研究指明鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）球虫引起的严重危害养鸡业发展的寄生虫病之一，其中柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）致病力最强。目前，本病的防治主要依赖化学药物和活虫苗，但存在药物残留、耐药虫株、高成本及活虫苗散毒等弊端，难以大规模应用。鸡球虫基因工程疫苗仍是当前鸡球虫免疫预防研究的热点和趋势，但目前报道的该类疫苗保护效果尚不理想。因此，本研究克隆新的鸡球虫疫苗候选基因，然后利用该基因制备亚单位疫苗和核酸疫苗，最后探讨制备的疫苗刺激鸡体产生的免疫应答和抗鸡球虫保护效果，对鸡球虫基因工程疫苗开发和研制具有重要意义。柔嫩艾美耳球虫RepairPSII基因克隆及原核表达：利用cDNA文库测序技术从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中筛选获得一个新基因，含有一个816bp的开放阅读框，编码271个氨基酸，具有RepairPSII蛋白家族的保守结构域，是一个跨膜蛋白。用原核表达技术成功表达重组REPAIRPSII蛋白，以可溶形式表达，可被抗柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊多抗识别，IFA显示RepairPSII在柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段表达。重组RepairPSII蛋白抗柔嫩艾美耳球虫保护效果：用重组RepairPSII蛋白经不同免疫途径免疫雏鸡，观察其诱导的免疫应答和抗柔嫩艾美耳球虫攻击的保护效果。结果表明皮下免疫组和口服工程菌组可刺激鸡体产生特异性抗体和细胞介导的免疫应答（IL-2和IFN-γ、CD4+与CD8+T淋巴细胞、T淋巴细胞刺激指数与对照组相比差异显着）。攻虫实验表明，皮下免疫组和口服工程菌组鸡卵囊数减少，盲肠病变减轻，体重增加。综合评价ACI值分别为173.2和165.6。pVAX1-RepairPSII真核表达质粒构建及抗柔嫩艾美耳球虫保护效果：将RepairPSII基因亚克隆到pVAX1中构建真核表达质粒并在Hela细胞表达。结果成功构建pVAX1-RepairPSII真核表达质粒，IFA、SDS-PAGE和Western blot确定RepairPSII蛋白得到表达。用pVAX1-RepairPSII重组质粒肌注免疫雏鸡，观察其诱导的免疫应答和抗柔嫩艾美耳球虫攻击的保护效果。结果表明RepairPSII核酸疫苗可刺激鸡体产生特异性抗体和细胞介导的免疫应答（IL-2和IFN-γ、CD4+与CD8+T淋巴细胞、T淋巴细胞刺激指数与对照组相比差异显着）。攻虫实验表明，免疫RepairPSII核酸疫苗可以减少卵囊数，减轻盲肠病变，增加体重。综合评价ACI值为178.7。本研究克隆了一个新的柔嫩艾美耳球虫疫苗候选基因RepairPSII，RepairPSII重组蛋白和RepairPSII核酸疫苗均显示了良好的抗柔嫩艾美耳球虫效果，对鸡球虫病免疫预防具有重要理论意义和应用前景。
姜荣芝[9]（2012）在《四种鸡球虫多价DNA疫苗免疫程序及其稳定性研究》文中研究表明鸡球虫病是严重危害养禽业发展的重要疾病之一,危害比较严重主要有柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫4个种,临床上往往为这4个种的混合感染,因此研制抵抗这4种鸡球虫混合感染的多价疫苗显得十分迫切,本实验室已经构建了抵抗4种球虫的混合多价DNA疫苗和多价多表位DNA疫苗,初步显示了良好的免疫保护效果,为进一步提高多价DNA疫苗的免疫保护效果,本研究对混合多价DNA疫苗的配比进行了优化,对多价多表位DNA疫苗的免疫程序和稳定性进行了研究,如下：本研究第一部分首先在对四种鸡艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗p VAX1.0-TA4-IFN-γ、pVAX1.0-NA4-IL-2、pVAX1.0-Em8-IL-2和pVAX1.0-3-1E-IFN-γ混合免疫程序基础上,对其免疫剂量的最佳配比再进行筛选。将柔嫩艾美耳球虫（E. tenella）免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-TA4-IFN-γ,毒害艾美耳球虫（E. necatrix）免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-NA4-IL-2、巨型艾美耳球虫（E. maxima）免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-Em8-IL-2和堆型艾美耳球虫（E. acervulina）免疫调节型DNA疫苗pVAX1.0-3-1E-IFN-γ按5μg:5μg:5μg:5μg、25μg:25μg:10μg、15μg:35μg:35μg15μg、20μg:50μg:50μg:20μg的剂量混合后免疫雏鸡,试验对各配比剂量设计了感染柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和四种混合感染各5个试验组及相应的5个非免疫攻虫对照组与一个非免疫非攻虫对照组,共26组。结果发现免疫剂量混合组15μg:35μg:35μg:15μg组在减少E. tenella、E. necatrix. E. acervulina和四个虫种种混合的免疫保护效果最好,ACI分别为188.50,180.50,180.91和174.59。免疫剂量混合组10μg:25μg:25μg:10μg组对E. maxima感染组的免疫保护效果较好,ACI为181.69。本研究第二部分是将本实验室构建的免疫调节型多价多表位DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2进行免疫程序筛选,在此基础上再进行稳定性实验。主要包括以下几个方面：1四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗免疫剂量的筛选将免疫调节型多价多表位DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2分别以2gg、10μg、25μg、50μg、100μg、200μg免疫雏鸡,各剂量分别设计了感染柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫各4个试验组及相应的4个非免疫攻虫对照组与一个非免疫非攻虫对照组,共29组。结果发现,柔嫩艾美耳球虫组免疫保护效果最好的免疫剂量为25μg,ACI为184.5。毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫免疫保护效果最好的免疫剂量均为10μg,ACI分别为184.58、181.27、181.48。2四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗免疫途径的筛选将免疫调节型多价多表位DNA疫苗p VAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2分别以肌肉注射、静脉注射、皮下注射、口服、滴鼻滴眼五个途径免疫雏鸡,各途径分别设计了感染柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫各4个试验组及相应的4个非免疫攻虫对照组与一个非免疫非攻虫对照组,共25组。结果发现,各免疫攻虫组中腿部肌肉注射组ACI均最高。其中腿部肌肉注射攻柔嫩艾美耳球虫组ACI为183.24；攻毒害艾美耳球虫的ACI为184.76；攻巨型艾美耳球虫ACI为181.96；攻堆型艾美耳球虫ACI为174.79。腿部肌肉注射组免疫效果优于其他免疫途经组。3四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗首免日龄和免疫次数的筛选设计了一周龄首免不加强免疫、一周龄首免二周龄加强免疫、二周龄首免不加强免疫和二周龄首免三周龄加强免疫四个实验组,分别免疫DNA疫苗pVAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2。各程序设计了感染柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫各4个试验组及相应的4个非免疫攻虫对照组与一个非免疫非攻虫对照组,共21组。结果发现,加强免疫组比非免疫组免疫保护效果好,所有加强免疫组的ACI都大于160；二周龄首免组比一周龄首免组免疫保护效果好,二周龄首免三周龄加强免疫组效果最好。4四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗免疫稳定性实验将免疫调节型多价多表位DNA疫苗p VAX1-TA4-1-NA4-1-LDH-2-EMCDPK-1-IL-2分别在不同的温度（-20℃、4℃和室温）下分别保存1个月、3个月、6个月,分别免疫雏鸡,各温度组分别设计了感染柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和毒害艾美耳球虫各4个试验组及相应的4个非免疫攻虫对照组与2个非免疫非攻虫对照组,共42组。结果发现,所有免疫组的ACI都大于160,说明各保存条件下多价多表位DNA疫苗都具有免疫保护效果,且在三个不同温度和不同保存时间内能保持相对稳定性。
张恒[10]（2011）在《鸡堆型艾美尔球虫免疫增强型核酸疫苗构建及其免疫效应》文中进行了进一步梳理鸡球虫病（Coccidiosis）是由一种以肠道病变为主的寄生虫病,给养鸡业造成了巨大经济损失。目前鸡球虫病主要以药物防治为主,但由于药物残留和耐药性问题,使得一些药物难以发挥其有效的疗效。球虫疫苗的研究,特别是新型球虫核酸疫苗研究,逐渐成为球虫病防治研究的新焦点。本试验根据已发表的堆型艾美尔球虫（E. acervulina） Ea1A基因序列设计引物,成功克隆上海株堆型艾美尔球虫的部分Ea1A基因,大小为1256 bp。同时构建Ea1A和ChIL-18的原核表达质粒,表达大小分别为51 KDa和26 KDa的Ea1A和ChIL-18蛋白,利用镍离子亲和树脂纯化后免疫新西兰白兔,制备兔抗Ea1A和ChIL-18多克隆抗体。经间接免疫荧光试验和Western blot证明制备的多克隆抗体均具有良好的反应性。本研究利用一段编码（G4S）3多肽的碱基linker序列将3-1E与Ea1A基因进行连接,成功构建了一个融合基因真核表达载体质粒,即PVAX-3-1E-linker-Ea1A质粒。融合基因质粒体外瞬时转染和体内接种试验表明表达的融合蛋白可以被Ea1A多克隆抗体和3-1E多克隆抗体检测出来,进一步证明了融合基因表达的蛋白具有两段基因各自的生物活性,为后续动物免疫试验提供了理论基础。动物免疫试验分为7个组,即PBS组（PBS对照组）、PVAX组（PVAX空质粒免疫组）、IL-18组（PVAX-IL-18真核质粒免疫组）、3-1E组（PVAX-3-1E真核质粒免疫组）、Ea1A组（PVAX-Ea1A真核质粒免疫组）、LK组（PVAX-3-1E-linker-Ea1A融合基因真核质粒免疫组）,以及LK+组（PVAX-3-1E-linker-Ea1A融合基因真核质粒和PVAX-IL-18真核质粒免疫组）。利用淋巴细胞增殖试验、酶联免疫吸附试验、免疫器官指数对不同处理组雏鸡的各项免疫指标进行检测,评价真核表达质粒的免疫效应。结果表明,5组疫苗免疫组各日龄雏鸡的免疫指标均高于组对照组,其中有ChIL-18、LK、LK+三组免疫组免疫应答反应尤为突出。其中T、B淋巴细胞增殖功能、外周血液中抗3-1E和Ea1A特异性抗体水平以及免疫器官指数与对照组相比较都有明显的提高,而且以LK+组最为显着。综上所述,3-1E与Ea1A融合基因真核表达质粒不但能刺激机体的细胞免疫应答,而且能够刺激机体体液免疫应答,ChIL-18基因可以提高3-1E与Ea1A融合基因真核表达质粒刺激机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答能力,进而提高机体抵抗球虫攻击的能力。本试验研究为进一步研究ChIL-18的生物学活性提供了试验依据,同时为探讨开发研制新型免疫增强型抗球虫核酸疫苗提供了理论基础。
二、柔嫩艾美球虫重组质粒pVAX1-Mzp57的免疫保护性试验（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、柔嫩艾美球虫重组质粒pVAX1-Mzp57的免疫保护性试验（论文提纲范文）
（1）柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 鸡球虫免疫机理 |
| 2 鸡球虫病疫苗类型 |
| 3 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫配子体蛋白gam22基因真核表达载体的构建及其反应原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 真核表达重组配子体蛋白rEtGAM22-e的免疫保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 重组配子体蛋白rEtGAM22-e与rEtGAM59联合免疫的保护效力分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）鸡柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1（AMA1）的免疫保护效果评估（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物与虫株 |
| 1.2 菌种、质粒与主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 EtAMA1基因扩增与鉴定 |
| 2.3 免疫保护效果评估 |
| 2.3.1 增重效果 |
| 2.3.2 OPG的计算 |
| 2.3.3 盲肠病变记分 |
| 2.3.4 ACI的计算 |
| 2.4 数据的统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 EtAMA1基因的RT-PCR 扩增与测序 |
| 3.2 真核表达重组质粒pVAX-EtAMA1的构建与鉴定 |
| 3.3 pVAX-EtAMA1的免疫保护性 |
| 3.3.1 体重的变化情况 |
| 3.3.2 OPG和盲肠病变记分 结果见表4。 |
| 3.3.3 ACI 结果见表5。 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
（3）巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 巨型艾美耳球虫的危害及防控现状 |
| 1 巨型艾美耳球虫(Eimeria. maxima)生活史 |
| 2 巨型艾美耳球虫的流行情况 |
| 3 巨型艾美耳球虫病的症状及病理变化 |
| 4 鸡球虫病的防治现状 |
| 5 鸡球虫DNA疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 巨型艾美耳球虫4种侵入相关抗原研究进展 |
| 1 鸡艾美耳球虫表面蛋白 |
| 2 鸡艾美耳球虫延伸因子2 |
| 3 鸡艾美耳球虫14-3-3蛋白 |
| 4 鸡艾美耳球虫棒状体蛋白 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 巨型艾美耳球虫表面蛋白基因的克隆表达以及免疫保护性研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmSAG基因的生物信息学分析 |
| 2.2 EmSAG基因的克隆结果 |
| 2.3 重组质粒pMD19-T-SAG的鉴定 |
| 2.4 重组表达质粒pET-32a(+)-SAG的构建和鉴定 |
| 2.5 重组SAG蛋白的诱导表达以及纯化 |
| 2.6 Wester blot分析 |
| 2.7 DNA疫苗pVAX-EmSAG的构建和鉴定 |
| 2.8 DNA疫苗pVAX-EmSAG在鸡体内表达的检测 |
| 2.9 EmSAG蛋白在E.maxima各阶段的定位分析 |
| 2.10 EmSAG基因免疫保护试验结果 |
| 2.11 EmSAG免疫诱导血清抗体水平检测 |
| 2.12 EmSAG免疫诱导血清细胞因子水平检测 |
| 2.13 EmSAG免疫诱导鸡脾脏T淋巴细胞亚类变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文章 |
| 第四章 巨型艾美耳球虫延伸因子2基因的克隆表达以及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmEF2基因的生物信息学分析 |
| 2.2 EmEF2基因PCR扩增结果 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-EF2的构建和鉴定 |
| 2.4 重组EF2蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 DNA疫苗pVAX-EmEF2的构建和鉴定 |
| 2.7 真核表达质粒pVAX-EmEF2在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 EmEF2免疫保护试验结果 |
| 2.9 EmEF2免疫诱导血清抗体、细胞因子及脾脏T淋巴细胞亚群变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 巨型艾美耳球虫14-3-3基因的克隆、表达以及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Em14-3-3基因的生物信息学分析 |
| 2.2 14-3-3 PCR扩增和克隆 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-14-3-3的构建 |
| 2.4 重组14-3-3蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 DNA疫苗pVAX-Em14-3-3的构建和鉴定 |
| 2.7 DNA疫苗pVAX-Em14-3-3在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 Em14-3-3蛋白在E.maxima各阶段的定位分析 |
| 2.9 Em14-3-3的免疫保护试验结果 |
| 2.10 Em14-3-3免疫诱导血清抗体水平检测 |
| 2.11 Em14-3-3免疫诱导血清细胞因子水平检测 |
| 2.12 Em14-3-3刺激鸡脾脏T淋巴细胞百分含量 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 巨型艾美耳球虫棒状体蛋白基因的克隆、表达及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmRON基因的克隆和序列分析 |
| 2.2 EmRON基因PCR扩增结果 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-RON的构建和鉴定 |
| 2.4 重组RON蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western blot分析 |
| 2.6 真核表达质粒pVAX-EmRON的构建和鉴定 |
| 2.7 真核表达质粒pVAX-EmRON在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 EmRON免疫保护试验结果 |
| 2.9 EmRON免疫诱导血清抗体和细胞因子 |
| 2.10 鸡脾脏T淋巴细胞亚类变化检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文章发表情况 |
| 致谢 |
（4）三种鸡球虫的免疫蛋白组学研究及共同抗原的确定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 鸡球虫病概述及防治现状 |
| 1 鸡球虫病的危害及其生活史 |
| 2 鸡球虫的免疫研究进展 |
| 2.1 鸡球虫的免疫原性 |
| 2.2 体液免疫 |
| 2.3 细胞免疫 |
| 3 鸡球虫病的防治现状 |
| 3.1 药物防治 |
| 3.2 鸡球虫DNA疫苗研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二章 蛋白质组学的研究进展 |
| 1 蛋白质组学概述 |
| 2 蛋白质组学技术 |
| 2.1 蛋白质分离技术 |
| 2.2 蛋白质鉴定技术 |
| 2.3 免疫蛋白质组学 |
| 3 蛋白质组学在寄生虫学中研究进展 |
| 参考文献 |
| 第三章 柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫孢子化卵囊的免疫蛋白组学分析 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 鸡球虫卵囊的收集 |
| 1.2 鸡球虫抗血清的制备 |
| 1.3 试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 孢子化卵囊可溶性蛋白的制备 |
| 2.2 SDS-PAGE |
| 2.3 孢子化卵囊蛋白的双向凝胶电泳 |
| 2.4 鸡球虫孢子化卵囊蛋白的双向电泳Western blot |
| 2.5 图像分析 |
| 2.6 质谱鉴定和数据库检索 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗球虫血清的Western Blot验证 |
| 3.2 孢子化卵囊蛋白的双向凝胶电泳结果分析 |
| 3.3 孢子化卵囊蛋白的双向电泳Western blot |
| 3.4 免疫原性蛋白的质谱鉴定 |
| 3.5 免疫原性蛋白的生物信息学分析 |
| 3.6 鸡球虫共同抗原的确定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 共同抗原基因克隆及真核表达质pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EaUCE基因和Ea14-3-3基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2 真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3构建 |
| 2.3 真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3在鸡体内转录情况的RT-PCR检测 |
| 2.4 真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3在鸡体内表达情况的western blot检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3诱导T淋巴细胞亚类反应和细胞因子变化 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 免疫分组 |
| 1.3 淋巴细胞的分离 |
| 1.4 流式细胞术检测T淋巴细胞亚群 |
| 1.5 实时荧光定量PCR检测细胞因子mRNA水平 |
| 2 结果 |
| 2.1 CD4~+/CD3~+、CD8~+/CD3~+水平的变化 |
| 2.2 真核表达质粒免疫诱导的细胞因子变化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 真核表达质粒pVAX-EaUCE和pVAX-Ea14-3-3诱导的抗体反应 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 真核表达质粒pVAX- EaUCE和pVAX- Ea14-3-3的免疫保护性研究 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 增重变化 |
| 2.2 卵囊计数与肠道病变计分 |
| 2.3 抗球虫指数 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附表 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
（5）巨型艾美耳球虫四种微线蛋白的免疫保护性及与鸡肠上皮细胞的结合能力（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 巨型艾美耳球虫研究进展和鸡球虫病的防控现状 |
| 1 E.maxima研究进展 |
| 1.1 E.maxima的发现 |
| 1.2 E.maxima的发育 |
| 1.3 E.maxima卵囊形态 |
| 1.4 流行病学 |
| 1.5 E.maxima的致病性 |
| 1.6 E.maxima的免疫学特征 |
| 1.7 同工酶研究 |
| 1.8 E.maxima基因序列研究 |
| 2 鸡球虫的防控现状 |
| 2.1 抗球虫产品的应用 |
| 2.2 疫苗 |
| 2.3 其他鸡球虫病防控策略 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡艾美耳球虫微线蛋白研究进展 |
| 1 鸡艾美耳球虫微线体蛋白概述 |
| 2 各种鸡艾美耳球虫微线体蛋白的研究进展 |
| 2.1 鸡艾美耳球虫微线蛋白1 |
| 2.2 鸡艾美耳球虫微线蛋白2 |
| 2.3 鸡艾美耳球虫微线蛋白3 |
| 2.4 鸡艾美耳球虫微线蛋白4 |
| 2.5 鸡艾美耳球虫微线蛋白5 |
| 2.6 鸡艾美耳球虫顶膜抗原1 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 巨型艾美耳球虫子孢子空肠上皮细胞结合蛋白的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 巨型艾美耳球虫子孢子和鸡空肠上皮细胞的分离与纯化 |
| 2.2 巨型艾美耳球虫子孢子可溶性全蛋白及其抗血清的制备 |
| 2.3 Western blot方法分析巨型艾美耳球虫子孢子可溶性蛋白与鸡空肠上皮细胞的结合 |
| 2.4 LC-MS/MS分析和鉴定结合鸡空肠上皮细胞的E.maxima子孢子可溶性蛋白 |
| 2.5 生物信息学分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 巨型艾美耳球虫微线蛋白3基因的克隆、表达及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmMIC3基因的5'和3'端扩增及序列生物信息学分析 |
| 2.2 重组表达质粒pET-32a(+)-MIC3的构建和鉴定 |
| 2.3 重组MIC3蛋白的诱导表达和纯化 |
| 2.4 大鼠抗MIC3多克隆抗体的效价及特异性检测 |
| 2.5 EmMIC3免疫保护试验结果 |
| 2.6 被动免疫试验结果 |
| 2.7 EmMIC3免疫诱导血清抗体水平检测 |
| 2.8 EmMIC3免疫诱导血清细胞因子水平检测 |
| 2.9 EmMIC3免疫诱导鸡脾脏淋巴细胞增殖水平检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 巨型艾美耳球虫微线蛋白2基因的克隆、表达及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmMIC2基因PCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒pMD19-T-MIC2的构建和鉴定 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-MIC2的构建和鉴定 |
| 2.4 重组MIC2蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western Blot分析 |
| 2.6 真核表达质粒pVAX1-MIC2的构建和鉴定 |
| 2.7 真核表达质粒pVAX1-MIC2在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 EmMIC2免疫保护试验结果 |
| 2.9 EmMIC2免疫诱导血清抗体、细胞因子及脾脏淋巴细胞增殖水平 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 巨型艾美耳球虫微线蛋白7基因的克隆、表达及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmMIC7基因PCR扩增结果 |
| 2.2 重组质粒pMD19-T-MIC7的构建和鉴定 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-MIC7的构建和鉴定 |
| 2.4 重组MIC7蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western Blot分析 |
| 2.6 真核表达质粒pVAX1-MIC7的构建和鉴定 |
| 2.7 真核表达质粒pVAX1-MIC7在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 EmMIC7免疫保护试验结果 |
| 2.9 EmMIC7免疫诱导血清抗体、细胞因子及脾脏淋巴细胞增殖水平 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 巨型艾美耳球虫顶膜抗原1基因的克隆、表达及免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EmAMA1基因的克隆和序列分析 |
| 2.2 AMA1功能域的PCR扩增和克隆 |
| 2.3 重组质粒pET-32a(+)-AMA1FD的构建 |
| 2.4 重组AMA1FD蛋白的表达和纯化 |
| 2.5 Western Blot分析 |
| 2.6 DNA疫苗pVAX1-AMA1FD的构建和鉴定 |
| 2.7 DNA疫苗pVAX1-AMA1FD在鸡体内表达的检测 |
| 2.8 AMA1FD的免疫保护试验结果 |
| 2.9 AMA1FD免疫诱导血清抗体水平检测 |
| 2.10 EmAMA1FD免疫诱导血清细胞因子水平检测 |
| 2.11 EmAMA1FD免疫诱导鸡脾脏淋巴细胞增殖水平检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 重组MIC蛋白与鸡肠上皮细胞的结合能力 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 rEmMIC3与不同鸡肠段结合试验结果 |
| 2.2 rEmMIC2与不同鸡肠段结合试验结果 |
| 2.3 rEmMIC7蛋与不同鸡肠段结合试验结果 |
| 2.4 rEmAMA1FD蛋白与不同鸡肠段结合试验结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 博士期间论文发表情况 |
（6）鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫程序及其稳定性试验（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 鸡球虫病的免疫研究进展 |
| 1 鸡球虫的生活史 |
| 2 鸡抗球虫感染免疫特点 |
| 2.1 球虫的免疫原性 |
| 2.2 非特异性免疫 |
| 2.3 特异性免疫 |
| 3 鸡四种常见艾美尔球虫重要保护性抗原的研究进展 |
| 3.1 柔嫩艾美耳球虫 |
| 3.2 毒害艾美耳球虫 |
| 3.3 堆型艾美耳球虫 |
| 3.4 巨型艾美耳球虫 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡球虫DNA疫苗研究进展 |
| 1 DNA疫苗的研究史 |
| 2 DNA疫苗的免疫机理 |
| 3 DNA疫苗的特点 |
| 4 鸡球虫DNA疫苗研究进展 |
| 5 影响鸡球虫DNA疫苗免疫效果的主要因素 |
| 5.1 免疫途径 |
| 5.2 免疫剂量 |
| 5.3 免疫次数 |
| 6 细胞因子佐剂在鸡球虫DNA疫苗中的应用 |
| 7 展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡球虫DNA疫苗和弱毒苗COCVAC及化学药物地克珠利保护效果的比较 |
| 摘要 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 增重影响 |
| 2.2 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的肠道病变的影响 |
| 2.3 DNA疫苗免疫对鸡球虫感染的卵囊计数的影响 |
| 2.4 抗球虫指数统计结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第四章 鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫剂量筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 增重影响 |
| 2.2 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的卵囊计数的影响 |
| 2.3 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的肠道病变的影响 |
| 2.4 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的抗球虫指数 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第五章 鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫途径筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 增重影响 |
| 2.2 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的卵囊计数的影响 |
| 2.3 免疫鸡对球虫感染的肠道病变的影响 |
| 2.4 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的抗球虫指数 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第六章 鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫首免日龄及免疫次数筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 增重影响 |
| 2.2 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的卵囊计数的影响 |
| 2.3 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的肠道病变的影响 |
| 2.4 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的抗球虫指数 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第七章 鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫稳定性试验 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 对增重的影响 |
| 2.2 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的卵囊计数的影响 |
| 2.3 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的肠道病变的影响 |
| 2.4 DNA疫苗免疫鸡对球虫感染的抗球虫指数 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（7）鸡四种艾美耳球虫重组蛋白免疫保护性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫疫苗研究进展 |
| 1 活疫苗 |
| 1.1 强毒活苗 |
| 1.2 弱毒活苗 |
| 1.3 耐药活苗 |
| 2 亚单位疫苗 |
| 3 基因工程亚单位疫苗 |
| 4 核酸疫苗 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡球虫疫苗交叉免疫保护研究进展 |
| 1 鸡球虫疫苗交叉免疫保护 |
| 1.1 传统鸡球虫疫苗的交叉免疫保护研究 |
| 1.2 鸡球虫重组亚单位疫苗的交叉免疫保护研究 |
| 1.3 鸡球虫核酸疫苗的交叉免疫保护研究 |
| 2 其他寄生虫疫苗的交叉免疫作用 |
| 参考文献 |
| 下篇 实验研究 |
| 第三章 鸡巨型艾美耳球虫Em6和Em8基因的原核表达与纯化 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 pcDNA4.0-Em6和pMD18-T-Em8质粒的酶切 |
| 2.2 重组质粒的构建 |
| 2.3 重组质粒在E.coli BL21中的表达 |
| 2.4 重组蛋白在E.coli中的分布 |
| 2.5 重组蛋白的纯化 |
| 2.6 Western blot分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第四章 鸡艾美耳球虫的不同重组蛋白免疫效果比较 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白的纯化 |
| 2.2 增重影响 |
| 2.3 重组蛋白免疫对鸡球虫感染的卵囊计数和肠道病变影响 |
| 2.4 重组蛋白免疫对鸡球虫感染的抗球虫指数 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第五章 4种鸡艾美耳球虫重组蛋白交叉免疫保护性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 柔嫩艾美耳球虫pET28b(+)-TA4蛋白的交叉免疫保护作用 |
| 2.2 毒害艾美耳球虫pET28a(+)-NA4蛋白的交叉免疫保护作用 |
| 2.3 堆型艾美耳球虫pET28a(+)-LDH蛋白的交叉免疫保护作用 |
| 2.4 巨型艾美耳球虫pET32a(+)-Em8蛋白的交叉免疫保护作用 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第六章 4种艾美耳球虫重组蛋白混合免疫的免疫保护性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 增重影响 |
| 2.2 混合蛋白免疫对鸡球虫感染的卵囊计数和肠道病变影响 |
| 2.3 混合蛋白免疫对鸡球虫感染的抗球虫指数 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（8）RepairPSⅡ基因重组蛋白和DNA疫苗抗柔嫩艾美耳球虫保护效果（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫病免疫机制的研究 |
| 1 鸡球虫保护性免疫机制 |
| 2 鸡肠道免疫系统的防御机制 |
| 3 艾美耳球虫的先天性免疫和获得性免疫应答 |
| 第二章 鸡球虫疫苗研究 |
| 1 鸡球虫疫苗 |
| 2 提高鸡抗球虫免疫水平的策略 |
| 3 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫 Repair_PSII 基因克隆及原核表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 重组 Repair_PSII 蛋白抗柔嫩艾美耳球虫保护效果 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 pVAX1-Repair_PSII 真核表达质粒构建及抗柔嫩艾美耳球虫保护效果 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（9）四种鸡球虫多价DNA疫苗免疫程序及其稳定性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫病的免疫研究进展 |
| 1 鸡球虫病的生活史 |
| 2 鸡抗球虫免疫感染特点 |
| 2.1 球虫的免疫原性 |
| 2.2 艾美耳球虫的先天性免疫和获得性免疫应答 |
| 3 球虫保护性抗原的研究进展 |
| 3.1 表面抗原 |
| 3.2 虫体细胞器阶段的抗原 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 鸡球虫DNA疫苗研究进展 |
| 1 DNA疫苗的构建 |
| 2 DNA疫苗作用机制 |
| 3 DNA免疫接种的途径和程序 |
| 3.1 免疫途径 |
| 3.2 免疫剂量 |
| 3.3 DNA疫苗的免疫次数 |
| 4 细胞因子基因佐剂在鸡球虫DNA疫苗中的应用 |
| 4.1 INF-γ |
| 4.2 IL-2 |
| 4.3 肿瘤坏死因子(TNF) |
| 5 鸡球虫疫苗交叉免疫保护研究 |
| 6 展望 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第三章 四种鸡艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗免疫剂量最佳配比的筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第四章 四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗免疫剂量的筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第五章 四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗免疫途径的筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第六章 四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗首免日龄和免疫次数的筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第七章 四种鸡艾美耳球虫免疫调节型多价多表位DNA疫苗免疫稳定性实验 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（10）鸡堆型艾美尔球虫免疫增强型核酸疫苗构建及其免疫效应（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡堆型艾美尔球虫研究进展 |
| 1.1.1 堆型艾美尔球虫研究概况 |
| 1.1.2 堆型艾美尔球虫生物特性 |
| 1.1.3 堆型艾美尔球虫生活史及致病性 |
| 1.1.4 堆型艾美尔球虫疫苗 |
| 1.1.5 球虫体外培养 |
| 1.1.6 球虫耐药性及防治 |
| 1.1.7 小结 |
| 1.2 鸡球虫主要抗原基因研究进展 |
| 1.2.1 卵囊表面抗原 |
| 1.2.2 子孢子表面抗原 |
| 1.2.3 裂殖生殖阶段抗原 |
| 1.2.4 配子生殖阶段抗原 |
| 1.2.5 微线蛋白 |
| 1.2.6 折光体蛋白 |
| 1.2.7 其他抗原基因 |
| 1.2.8 小结 |
| 1.3 白细胞介素18 及鸡白细胞介素18 研究进展 |
| 1.3.1 白细胞介素18 研究进展 |
| 1.3.2 鸡IL-18 及其生物学活性 |
| 1.3.3 ChIL-18 在球虫病防治中的应用 |
| 1.4 目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 虫株、试验动物 |
| 2.1.2 菌株、载体及质粒 |
| 2.1.3 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂 |
| 2.1.4 主要生化试剂 |
| 2.1.5 主要试验仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 堆型艾美尔球虫Ea1A 基因克隆及序列分析 |
| 2.2.2 堆型艾美尔球虫Ea1A 基因和鸡IL-18 基因的原核蛋白表达及纯化 |
| 2.2.3 鸡IL-18 原核表达蛋白复性及生物活性检测 |
| 2.2.4 Ea1A 和ChIL-18 多克隆抗体制备和生物活性检测 |
| 2.2.5 重组真核表达质粒的构建 |
| 2.2.6 PVAX-3-1E-linker-Ea1A 真核表达质粒的构建 |
| 2.2.7 重组质粒体外和体内表达的检测 |
| 2.2.8 重组真核表达质粒在雏鸡体内免疫效果检测 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 鸡堆型艾美尔球虫Ea1A 基因克隆及序列分析 |
| 3.1.1 孢子化卵囊总RNA 的提取 |
| 3.1.2 堆型艾美尔球虫Ea1A 基因的扩增 |
| 3.1.3 重组质粒pMD18-T-Ea1A 鉴定 |
| 3.1.4 重组质粒pMD18-T-Ea1A 序列测定及二级结构预测分析 |
| 3.2 鸡堆型艾美尔球虫Ea1A 基因和鸡IL-18 基因的原核蛋白表达和纯化 |
| 3.2.1 重组表达质粒pET30a-Ea1A 的鉴定 |
| 3.2.2 重组表达质粒pET30a-IL-18 的鉴定 |
| 3.2.3 堆型艾美尔球虫Ea1A 原核蛋白表达及纯化 |
| 3.2.4 ChIL-18 原核蛋白表达及纯化 |
| 3.3 ChIL-18 原核表达蛋白复性及生物活性检测 |
| 3.4 Ea1A 和ChIL-18 的多克隆抗体生物活性 |
| 3.4.1 Ea1A 的多克隆抗体抗体效价 |
| 3.4.2 ChIL-18 的多克隆抗体抗体效价 |
| 3.4.3 Ea1A 多克隆抗体生物活性 |
| 3.4.4 ChIL-18 的多克隆抗体生物活性 |
| 3.5 重组真核表达质粒的构建和鉴定 |
| 3.5.1 重组质粒PVAX-3-1E 质粒PCR 和酶切鉴定 |
| 3.5.2 重组质粒PVAX-IL-18 质粒PCR 和酶切鉴定 |
| 3.5.3 重组质粒PVAX-Ea1A 质粒PCR 和酶切鉴定 |
| 3.6 PVAX-3-1E-linker-Ea1A 真核表达质粒的构建和鉴定 |
| 3.6.1 重组质粒PVAX-3-1E-1 的PCR 鉴定和酶切鉴定 |
| 3.6.2 重组质粒PVAX-3-1E-linker-Ea1A 的PCR 鉴定和酶切鉴定 |
| 3.6.3 PVAX-3-1E-linker-Ea1A 融合基因真核表达质粒二级结构的预测分析 |
| 3.7 重组质粒体外和体内表达 |
| 3.7.1 重组质粒PVAX-3-1E 体外瞬时表达 |
| 3.7.2 重组质粒PVAX-IL-18 外瞬时表达 |
| 3.7.3 重组质粒体PVAX-Ea1A 外瞬时表达 |
| 3.7.4 重组质粒体PVAX-3-1E-linker-Ea1A 外瞬时表达 |
| 3.7.5 RT-PCR 检测真核质粒在鸡体内表达 |
| 3.7.6 间接免疫荧光检测肌肉组织中抗原基因蛋白表达 |
| 3.7.7 Western-blot 检测肌肉组织中抗原基因表达 |
| 3.8 重组质粒免疫雏鸡后机体免疫效应 |
| 3.8.1 雏鸡胸腺T 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.8.2 雏鸡外周血液T 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.8.3 雏鸡脾脏T 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.8.4 雏鸡血液B 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.8.5 雏鸡脾脏B 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.8.6 雏鸡免疫器官指数动态变化 |
| 3.8.7 雏鸡体内抗体动态变化 |
| 3.8.8 雏鸡增重动态变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Ea1A 基因的克隆鉴定和表达及其多克隆抗体制备 |
| 4.1.1 Ea1A 抗原基因的选择以及基因的克隆 |
| 4.1.2 Ea1A 蛋白表达纯化 |
| 4.1.3 Ea1A 多克隆抗体制备及其生物活性检测 |
| 4.2 ChIL-18 蛋白的表达和多克隆抗体制备及其生物学活性 |
| 4.2.1 ChIL-18 蛋白的表达及复性 |
| 4.2.2 CHIL18 多克隆抗体生物活性检测 |
| 4.2.3 ChIL-18 的生物活性检测 |
| 4.3 PVXA1-3-1E-linker-Ea1A 融合基因真核表达质粒构建及体内外表达 |
| 4.3.1 PVXA1-3-1E-linker-Ea1A 融合基因真核表达质粒构建 |
| 4.3.2 PVXA1-3-1E-linker-Ea1A 融合基因真核载体表达质粒体外瞬时 转染鉴定结果及分析 |
| 4.3.3 真核表达质粒鸡体内注射免疫检测抗原基因表达分析 |
| 4.4 重组质粒免疫雏鸡后机体的免疫效应 |
| 4.4.1 雏鸡免疫后T 淋巴细胞增殖功能变化结果分析 |
| 4.4.2 雏鸡免疫后B 淋巴细胞增殖功能变化结果分析 |
| 4.4.3 雏鸡免疫器官指数分析 |
| 4.4.4 雏鸡外周血液抗体含量动态变化结果分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
四、柔嫩艾美球虫重组质粒pVAX1-Mzp57的免疫保护性试验（论文参考文献）
- [1]柔嫩艾美耳球虫配子体GAM22蛋白的真核表达及其免疫保护效力评价[D]. 程振扬. 扬州大学, 2021
- [2]鸡柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1（AMA1）的免疫保护效果评估[J]. 刘剑华,袁橙,张光际,张步彩,韩贵龄,李长乐. 黑龙江畜牧兽医, 2020(23)
- [3]巨型艾美耳球虫4种侵入相关蛋白分子特性及免疫保护性研究[D]. 刘亭岐. 南京农业大学, 2018(07)
- [4]三种鸡球虫的免疫蛋白组学研究及共同抗原的确定[D]. 刘连瑞. 南京农业大学, 2016(04)
- [5]巨型艾美耳球虫四种微线蛋白的免疫保护性及与鸡肠上皮细胞的结合能力[D]. 黄经纬. 南京农业大学, 2016(12)
- [6]鸡四种艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗混合免疫程序及其稳定性试验[D]. 赵胜杰. 南京农业大学, 2012(01)
- [7]鸡四种艾美耳球虫重组蛋白免疫保护性研究[D]. 高云路. 南京农业大学, 2012(04)
- [8]RepairPSⅡ基因重组蛋白和DNA疫苗抗柔嫩艾美耳球虫保护效果[D]. 刘颖丽. 吉林大学, 2012(09)
- [9]四种鸡球虫多价DNA疫苗免疫程序及其稳定性研究[D]. 姜荣芝. 南京农业大学, 2012(01)
- [10]鸡堆型艾美尔球虫免疫增强型核酸疫苗构建及其免疫效应[D]. 张恒. 东北农业大学, 2011(04)