一、脂蛋白脂肪酶外显子9基因突变研究（论文文献综述）
方明华[1]（2021）在《APOB基因突变c.12581T>C致家族性高胆固醇血症的分子机制研究》文中研究说明目的:通过分析一例高胆固醇患者中发现的APOB基因突变位点,结合患者的临床资料及基因检测,追溯患者家族成员的血脂情况,并探讨突变位点c.12581T>C的可能致病机制,为家族性高胆固醇血症（Familial Hypercholesterolemia,FH）的临床诊断提供新的诊断依据。方法:1、资料收集:根据FH常用的诊断评分标准收集患者家系信息,绘制家谱图,采集先证者空腹血样送检,进行全外显子测序,寻找突变位点并进行突变功能及蛋白结构预测。2、位点获取:通过设计包含突变位点的APOB基因截短体片段,根据片段序列设计引物,进行PCR扩增,将扩增产物凝胶电泳,并对条带进行纯化及测序验证。3、质粒构建:构建只表达绿色荧光蛋白GFP基因的空载体质粒、同时表达GFP与LDLR-HA基因的野生型LDLR质粒、同时表达GFP基因和APOB-Flag基因的野生型截短APOB质粒及同时表达GFP基因和APOB-Flag基因的突变型截短APOB质粒。4、质粒转染:通过体外培养人正常肝细胞（HL-7702）,分为三组进行质粒共转染:空载体组（只表达绿色荧光蛋白GFP基因的空载体质粒及同时表达GFP与LDLR-HA基因的野生型LDLR质粒）,WT组（同时表达GFP基因和APOB-Flag基因的野生型截短APOB质粒及同时表达GFP与LDLR-HA基因的野生型LDLR质粒）,Mut组（同时表达GFP基因和APOB-Flag基因的突变型截短APOB质粒及同时表达GFP与LDLR-HA基因的野生型LDLR质粒）培养48h,使各组中的截短APOB蛋白及LDLR蛋白充分表达并结合。5、功能验证:收集各组细胞,提取蛋白后利用琼脂糖珠（Protein G beads）及抗Flag抗体对各组中的截短APOB蛋白进行免疫沉淀,并保留部分蛋白样品为Input组;利用Western blotting方法检测各Ip组中LDLR蛋白的表达情况,以及各Input组中的截短APOB蛋白及LDLR蛋白的表达情况,并使用β-actin做内参。结果:1、通过三代家系研究,筛选出几名可疑FH患者,其中先证者生化常规提示其总胆固醇（TC 9.82mmol/L）和低密度脂蛋白（LDLC 7.59mmol/L）水平明显升高,符合高胆固醇血症特征。2、先证者血样测序结果提示存在两个未报道过的APOB基因突变:c.12581T>C（编码区第12581号核苷酸由胸腺嘧啶变异为胞嘧啶）,导致氨基酸改变p.I4194T（第4194号氨基酸由异亮氨酸变异为苏氨酸）,其位于第29号外显子上,为错义突变;c.4538G>A（编码区第4538号核苷酸由鸟嘌呤变异为腺嘌呤）,导致氨基酸改变p.R1513Q（第1513号氨基酸由精氨酸变异为谷氨酰胺）,其位于第26号外显子上,为错义突变。通过蛋白预测软件预测c.12581T>C可能为致病性突变,突变后I4194与第4190位氨基酸之间增加了一个氢键,可能会影响蛋白的空间结构域。3、设计包含c.12581T>C突变位点的目的基因片段引物,经扩增及测序提示目的片段提取成功。4、构建了包含c.12581T>C突变位点的突变型截短APOB过表达质粒与包含目的序列的野生型截短APOB过表达质粒,测序提示与目的基因m RNA序列对比,突变型质粒构建成功。5、质粒转染后经Image J测量,对三组绿色荧光值进行统计,提示三组细胞转染质粒后基因的表达水平相当。6、Western blotting实验结果提示野生型及突变型截短APOB质粒的Input组可以正常表达截短APOB蛋白和LDLR蛋白;Ip组的突变型截短APOB蛋白的分子量与野生型截短APOB蛋白的分子量相当,蛋白结合水平仅略微降低（P>0.05）,经检验差异无统计学意义。结论:1、通过对一个FH家系的临床病史资料收集,以及对先证者的血脂指标和基因测序分析,发现了两个与FH临床表型高度相关的APOB基因编码区的突变:c.12581T>C和c.4538G>A。两者均能导致氨基酸发生改变,其中突变c.12581T>C可能是引起FH的影响因素。2、通过体外细胞实验成功构建过表达截短体质粒,利用免疫共沉淀技术模拟受体结合结构域上的突变型截短APOB蛋白及野生型截短APOB蛋白分别与LDLR结合,验证了突变位点是否通过影响截短APOB蛋白与LDLR结合能力而致病。3、从截短APOB蛋白的功能上验证了c.12581T>C突变位点未引起APOB基因表达异常,对截短APOB蛋白与LDLR的结合也无明显影响,初步证实该位点不影响截短APOB蛋白的分泌与结合功能。
陈佳欢[2]（2021）在《Lp-PLA2敲除兔模型的构建及其对动脉粥样硬化影响的研究》文中研究指明动脉粥样硬化是心血管疾病（如心肌梗死、中风）的主要原因。由于其广泛的流行性和高死亡率,已成为全球最主要的公共卫生问题。脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）曾广泛被认为可作为心血管疾病风险的生物标志物和极具潜力的治疗靶点。一种口服的、选择性的Lp-PLA2抑制剂（Darapladib）被广泛应用于多项动物实验及临床试验中,以评估是否具有抵抗动脉粥样硬化的作用。临床前实验及二期临床试验结果表明,Darapladib可有效抵抗动脉粥样硬化的发展,阻止晚期坏死核心的扩张。然而两个大规模的三期临床试验结果表明,Darapladib并不能显着降低未来心血管事件的发生风险。因此,明确Lp-PLA2在生理及病理状态下具体的生物学功能及作用机制十分重要。首先,我们通过高胆固醇饮食诱导兔动脉粥样硬化的发生。生理指标监测结果显示,随着动脉粥样硬化的发展,兔血浆Lp-PLA2活性显着升高。通过对诱导终点动脉组织Lp-PLA2 m RNA表达情况的检测,我们发现与对照组（基础饮食）相比,发生动脉粥样硬化个体（高胆固醇饮食）主动脉组织中Lp-PLA2 m RNA表达显着增加;且在发生动脉粥样硬化的个体中,斑块处Lp-PLA2 m RNA的表达明显高于无斑块处动脉组织。此外,我们利用快速蛋白液相色谱技术（FPLC）分离了诱导不同阶段的血浆脂蛋白,并对胆固醇及Lp-PLA2在各种脂蛋白组分中的分布情况进行了检测。结果显示,随着兔动脉粥样硬化的发展,极低密度脂蛋白（VLDL）及中间密度脂蛋白/低密度脂蛋白（IDL/LDL）中的胆固醇含量急剧增加,且Lp-PLA2与VLDL及IDL/LDL的结合比例也明显上升。为了明确Lp-PLA2在动脉粥样硬化过程中的作用及作用机制,我们利用CRISPR/Cas9技术制备出Lp-PLA2基因敲除兔。血浆Lp-PLA2活性检测结果显示,杂合敲除导致Lp-PLA2活性减半,纯合敲除导致Lp-PLA2活性完全缺失。Lp-PLA2基因敲除兔（包括杂合敲除和纯合敲除）表现出明显的低血脂表型,即总胆固醇（TC）,低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）,甘油三酯（TG）及游离脂肪酸（NEFA）的水平都显着下降。FPLC的结果进一步证明了Lp-PLA2缺失使血浆IDL/LDL组分中的胆固醇被降到较低的水平。对Lp-PLA2调节血脂代谢机制的初步研究结果显示,Lp-PLA2缺失并不会影响肝脏对LDL的清除,但在纯合敲除兔中会通过降低VLDL的初始量来影响LDL的产出。此外,Lp-PLA2缺失会加速甘油三酯的分解代谢。接下来,我们利用高胆固醇饮食同时诱导雄性野生型兔(Lp-PLA2+/+)、Lp-PLA2杂合敲除兔(Lp-PLA2+/-)和Lp-PLA2纯合敲除兔(Lp-PLA2-/-)发生动脉粥样硬化。结果显示,随着诱导时间延长,Lp-PLA2+/-兔血浆中的Lp-PLA2活性以较低水平持续增长,并逐渐丧失其降低TC及LDL-C的功能;而Lp-PLA2-/-兔血浆中始终无Lp-PLA2活性存在,并一直保持着低TC、低LDL-C的状态。诱导终点病变情况的检测结果显示,Lp-PLA2-/-兔主动脉粥样硬化面积明显减小,且未发现晚期病变的发生,如钙化,坏死核心形成。而Lp-PLA2+/-兔的动脉粥样硬化病变情况表现出较大个体差异,不具有明显抵抗动脉粥样硬化的作用。通过对动脉斑块处炎症基因表达的检测分析,我们发现Lp-PLA2完全缺失具有明显的抗炎作用。且体外细胞实验证实,Lp-PLA2杂合或完全缺失会影响参与动脉粥样硬化的关键细胞行为,如单核细胞与内皮细胞间的黏附作用,巨噬细胞或内皮细胞对低密度脂蛋白（LDL）及氧化型低密度脂蛋白（ox LDL）的摄取。综上所述,本研究以Lp-PLA2基因敲除兔为载体,确定了在基础饮食状态下,Lp-PLA2杂合或完全缺失会显着降低血浆脂质水平。且Lp-PLA2完全缺失后,肝脏对LDL的清除能力不受影响,而LDL的产出量显着降低。此外,Lp-PLA2缺失会加速甘油三酯分解代谢。在高胆固醇饮食状态下,Lp-PLA2完全缺失可起到抵抗动脉粥样硬化的作用,且明显抑制斑块内炎症基因的表达;而Lp-PLA2杂合缺失并不能有效抑制动脉粥样硬化发展。本研究为Lp-PLA2是否能作为心血管疾病的治疗靶标提供了新的见解。
许锦平,白海涛,姚拥华,陈先睿[3]（2021）在《脂蛋白脂酶基因突变致儿童高三酰甘油血症性胰腺炎一例报道并文献复习》文中提出高三酰甘油血症性胰腺炎（HTGP）常发生在伴有血脂异常（包括Ⅰ型、Ⅳ型及Ⅴ型血脂异常）的患者中,或继发于其他疾病。虽然HTGP的临床症状与其他病因引起的急性胰腺炎相似,但HTGP常与更严重的临床症状和并发症有关,因此需加强对该病的认识。本文报道了1例脂蛋白脂酶基因突变所致儿童HTGP病例并复习了相关文献,建议对疑似该病患者早期进行基因检测,以为临床早期诊治提供参考及更好地改善患者预后。
黄静[4]（2021）在《LIPG通过激活PI3k/Akt/mTOR信号通路促进宫颈癌发生发展的机制分析》文中研究指明研究背景:内皮型脂肪酶（LIPG）是LIPG基因编码的一种磷脂酶,主要位于细胞膜和细胞质中。它通常在代谢率高和血管化的组织中大量表达,从而提供脂质前体,如ATP、脂肪酸、脂质和核苷酸,这些前体可以保持细胞能量,促进快速生长、增殖、迁移和凋亡。迄今为止,对LIPG的研究侧重于代谢综合征,如动脉粥样硬化、心血管疾病和炎症。然而,LIPG在为细胞提供脂质前体方面的作用表明,它可能在癌细胞的新陈代谢中起基本作用,如细胞增殖、血管生成和能量供应。这引起了肿瘤研究者的关注。就女性肿瘤而言,目前仅有研究报道其在乳腺癌中高表达并促进增殖,肿瘤形成和转移。然而,LIPG在宫颈癌中是否存在潜在作用及其机制仍然未知。本研究的初衷是阐明LIPG是否参与宫颈癌的发生和发展。研究方法:1.免疫组织化学法评估正常宫颈组织（例数:19例）与宫颈鳞癌组织（例数:81例）LIPG表达量。2.逆转录聚合酶链反应检测宫颈鳞癌细胞（2个细胞系:Caski和Siha）和组织标本（正常宫颈:例数:30例,宫颈鳞癌:例数:87例）中LIPG的表达量及LIPG siRNA的转染效率,再进一步验证其与HPV16 E6和miR-148a-3p之间的关系。3.进行了蛋白质印迹分析及蛋白芯片分析技术,以测量蛋白质表达的变化,一是阐明HPV16 E6与LIPG之间的联系（目标蛋白:HPV16 E6,LIPG）,二是验证磷脂蛋白醇-4,5-双磷酸盐3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/拉帕霉素激酶（mTOR）信号通路的机械靶点中的潜在作用（目标蛋白:mTOR,PPI3K,PI3K,PAKT,AKT）。4.双荧光素酶报告基因检测miR-148a-3p与LIPG之间的关联。5.通过细胞划痕试验进行细胞迁移检测。6.通过3-（4,5-二甲基乙酰醇-2-yl）-2,5-二苯甲酰溴化物检测细胞增殖情况。7.使用细胞凋亡试验分析了LIPG变化对细胞凋亡情况的影响。8.通过细胞侵袭实验证实了LIPG变化对癌细胞侵袭性的影响。以上所有实验重复三遍。研究结果:1.通过免疫组化、RT-PCR和Western blotting验证,结果显示LIPG在宫颈癌中表达,而且表达量较正常宫颈组织高。2.下调LIPG的表达导致宫颈癌m RNA和蛋白表达的改变,可以抑制细胞的增殖,迁移,侵袭和细胞集落的形成,但可促进细胞凋亡的增加（P均<0.05）。3.另外,我们的研究结果表明,LIPG可能受到HPV E6/miR-148a-3p的调控,并通过PI3k/Akt/mTOR信号通路促进宫颈癌的进展。研究结论:宫颈感染HPV病毒后,HPV E6蛋白可能通过降低miR-148a-3p的表达,解除miR-148a-3p对LIPG表达的抑制作用,并通过PI3k/Akt/mTOR信号通路促进宫颈癌的进展。
韩思兰[5]（2021）在《鱼类脂滴自噬与脂滴水解在脂代谢调控中的互作机制研究》文中研究指明胞质脂滴是一种复杂的动态变化的细胞器,表面包裹着磷脂单层膜,其核心由中性脂组成,包括甘油三酯和胆固醇酯。通过调节脂质的储存和释放,脂滴在能量代谢中发挥着重要作用。目前,脂滴水解和脂滴自噬被公认为哺乳动物细胞内分解脂滴的两条主要途径。前者通过甘油三酯脂肪酶（ATGL）-激素敏感脂肪酶（HSL）-单酰甘油脂肪酶（MGL）级联反应降解甘油三酯。后者则是一个更为复杂的生物学过程:脂滴先被双层囊泡膜包裹形成自噬体,随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体,最后溶酶体中的酸性脂肪酶将脂滴分解为甘油和游离脂肪酸。近年来,这两条通路在鱼类脂代谢工作中先后得到证实,但两者对鱼类营养代谢、能量供应方面的作用并不清楚。同时,即使在哺乳动物中,脂滴水解和脂滴自噬至今尚无详细的比较研究,尤其在活体水平,它们在脂分解中的地位仍有待商榷。此外,已有文献报道在特定细胞类型或环境条件下,脂滴水解和脂滴自噬存在一定的相互作用,而类似的互作研究在鱼类中至今尚不明确、鲜有涉及。因此,本研究首先通过药物分别抑制罗非鱼或斑马鱼的自噬/脂解途径,探究它们对鱼体生长代谢的重要性,并运用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别建立脂滴水解关键酶基因（atgl/pnpla2）和脂滴自噬关键酶基因（lal/lipf）的斑马鱼敲除模型。通过分析组织表达、幼鱼表型、生化检测数据、全鱼转录组,并运用薄层层析、气相色谱、肝脏H&E染色、免疫荧光、透射电镜观察、RT-PCR、Western blot、ELISA等多种检测方法,试图从中性/酸性脂肪酶缺失的角度探究脂滴水解和脂滴自噬在鱼类脂代谢中行使的具体功能,以及一方受阻对另一方造成的影响。另外,本研究还在基因敲除斑马鱼的基础上额外添加了自噬抑制剂或脂解抑制剂,即将脂滴水解与脂滴自噬同时抑制,探究鱼体的应对方式。本论文的主要结果如下:1.自噬受抑制罗非鱼的三大代谢变化研究本实验室已利用模式生物斑马鱼,首次证明鱼类肝脏中亦存在脂滴自噬这一生物学现象。然而,自噬与鱼类（尤其是经济鱼类）代谢疾病之间的关系尚未得到较好的阐述。为检验自噬受损可能是鱼类脂肪过度沉积的重要因素这一猜想,本研究首先安排了为期一周的预实验,设置三种浓度摸索出自噬抑制剂氯喹（CQ）的合理添加剂量为100mg/kg饲料。随后,进行了长达8周的尼罗罗非鱼养殖实验,经过驯化且初重均匀的健康罗非鱼随机分成两组,分别投喂对照饲料以及额外添加CQ的实验饲料。该实验检测了罗非鱼生长、自噬以及糖、脂、蛋白三大代谢的生化和分子指标。结果表明,CQ能够显着抑制自噬并阻碍鱼体生长,且CQ通过抑制m TOR的基因与蛋白表达,使得全鱼蛋白含量下降,这说明自噬损伤会减少蛋白质的合成。在糖代谢方面,自噬受阻促进了鱼体糖原分解,不同组织的基因表达结果表明CQ处理所提高的糖酵解主要发生在肌肉中,其次是脂肪组织,且CQ还降低了肝脏糖异生能力。因此,由CQ引起的自噬抑制减少了脂来源的能量供应,作为补偿,糖酵解总体上得到了增强。此外,抑制自噬会使原本健康的鱼代谢状况恶化,具体表现为脂质积累、抗氧化能力减弱和炎症反应增加。具体分析不同组织的脂代谢数据,发现CQ处理显着抑制了肝脏和肌肉的脂肪生成基因,这可能是脂肪沉积的负反馈调节。在肌肉中,CQ组dgat和脂分解代谢基因不断下调,而在脂肪组织中,CQ对这些基因没有影响。该结果表明:与对照组相比,CQ会造成一定程度的脂代谢紊乱,且不同组织对此的反应敏感性由强到弱依次为肝脏、肌肉和脂肪组织。本实验提示自噬受损可能是水产养殖中常见的代谢性疾病发生的原因之一,且抑制自噬可以显着影响鱼类的糖、脂、蛋白质代谢。因此,自噬在维持养殖鱼类营养代谢的稳态方面具有重要作用,它很可能是调节三大营养素代谢的一个有效靶标。2.脂滴水解受阻斑马鱼的能量代谢机制研究已有研究证实,编码ATGL的基因在硬骨鱼类中是高度保守的,且鱼类的脂滴水解同样经历ATGL-HSL-MGL的过程。然而,ATGL在鱼类代谢中的确切作用尚未得到阐明。此外,相比哺乳动物,鱼类对碳水化合物的利用能力普遍较低,先前的研究表明,脂代谢的改变会影响葡萄糖和蛋白质的代谢,从而影响能量稳态。然而,ATGL介导的脂滴水解在鱼类能量稳态中的具体作用鲜有报道。Atglistatin（AI）是第一个合成的ATGL强效抑制剂,其对鱼类脂解的抑制效果尚不明确。本研究选择斑马鱼作为实验对象,首先进行了一周的预实验,摸索出AI的适宜添加浓度为80mg/kg饲料（无明显毒性效应）,然后挑选雄性斑马鱼随机分为两组（对照组和AI处理组）,开展为期5周的养殖实验。养殖结束后,检测了脂沉积,脂质组成,血糖和组织糖原含量,鱼体耗氧率、脂肪酸β氧化以及脂酶活性等指标。结果显示,AI处理组斑马鱼的肥满度、全鱼总脂、血浆甘油三酯明显升高,且在鱼体解剖过程中,该组发现了明显的白色脂肪组织,而对照组斑马鱼没有观察到类似现象。此外,AI组斑马鱼耗氧率较低,且肝脏和肌肉的β-氧化效率显着减少,全鱼总脂中TG和PL含量显着增加,而FFA,DG和MG含量显着下降。总之,抑制ATGL造成了斑马鱼严重的脂肪累积,改变了脂质组成,减弱了脂分解代谢,并引发了一定程度的氧化应激和炎症反应。此外,AI处理组斑马鱼肝脏组织HSL功能的部分增强无法逆转ATGL的抑制作用,也未观察到自噬的补偿性升高。全鱼转录组数据进一步揭示了抑制ATGL改变了斑马鱼系统的营养代谢。从营养素利用的角度来看,脂解受阻也导致了糖原分解和蛋白更新的加速,但不影响鱼体的蛋白含量,反而降低了糖酵解相关基因的表达。综上所述,ATGL在鱼类的代谢稳态中起着至关重要的作用,且抑制ATGL导致的脂源性供能障碍并不能通过激活HSL和自噬,或者提高其他营养物质的分解供能来弥补。3.Atgl和Lal敲除斑马鱼的代谢特征比较研究为排除抑制剂处理造成的靶标不确定性,本研究利用CRISPA/Cas9基因编辑技术分别构建了全身性Atgl或Lal敲除斑马鱼纯合品系（AKO或LKO）,并对这两个基因在野生型斑马鱼不同组织中的表达情况进行了检测。结果发现atgl和lal在斑马鱼全身表达均较为广泛,尤其是atgl的组织分布,区别于哺乳动物仅在脂肪组织或乳腺组织极端高表达,这两个基因在鱼类各个组织的表达量差异并不特别显着。幼鱼表型探索实验发现:较野生型斑马鱼,Atgl敲除纯合斑马鱼运动活力更强,摄食量更多,且全鱼在第16天已经出现明显的脂肪累积;而Lal敲除纯合子运动活性显着降低,虽然食欲旺盛,但脂肪沉积的效果不如Atgl敲除纯合子明显。此外,经过长达7周的养殖实验,虽然AKO和LKO斑马鱼均出现了生长缓慢、蛋白质减少、耗氧率降低以及运动活力减弱的现象,但两者有着截然相反的全鱼总脂和甘油三酯含量差异,且脂质组成也明显不同。具体而言,与WT相比,AKO全鱼总脂显着增加,其中甘油三酯所占的比例更高,且AKO斑马鱼的C16:1、C18:1n-9和C18:3n-6的百分比高于野生型,而C24:1和C22:6n-3的百分比低于WT鱼。另一方面,相较野生型斑马鱼,LKO全鱼总脂含量显着减少,其中甘油三酯所占百分比降低,CE、PE和PC的比例增加,且LKO鱼中超长链多不饱和脂肪酸,如C20:5n-3和C22:6n-3的百分比高于WT。除了生化差异,Atgl敲除斑马鱼和Lal敲除斑马鱼还表现出明显不同的组织学差异。比如活体解剖后,两者肝脏呈现出来的颜色相差甚远,前者偏白,后者偏黄;H&E染色显示两者的肝脏空泡形态也有所区别,AKO大而多,LKO小而密。随后,通过转录组数据的整理与分析,发现斑马鱼无论是敲除Atgl还是Lal,都对代谢产生了重大影响,且前者影响更为显着,尤其是脂代谢方面,这不仅表现在差异基因个数上,还表现在对甘油三酯、胆固醇以及PE/PC合成或分解通路的调控上。转录组数据进一步揭示了AKO和LKO确实存在脂代谢模式上的差异,且以中性脂肪酶Atgl为代表的脂滴水解和以酸性脂肪酶Lal为代表的脂滴自噬在维持鱼类机体内稳态方面发挥关键作用。4.斑马鱼肝脏脂滴自噬与脂滴水解关系研究考虑到AKO和LKO斑马鱼解剖后,肝脏部分引人注目的特征差异,以及鉴于脂解相关基因在鱼类肝脏中高表达（相比于哺乳动物）,后续涉及脂滴水解和脂滴自噬相互关系的研究则聚焦于斑马鱼的肝脏组织。首先,利用AKO雄性斑马鱼和对应的F3代WT开展了4周养殖实验,并在饲料中额外添加了自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA）来抑制AKO斑马鱼的自噬,进一步探索两种脂滴分解过程的相互关系,即Atgl缺陷是否会影响脂滴自噬功能的发挥。目前的结论是:Atgl敲除严重阻碍了斑马鱼肝脏的脂滴水解,但脂滴自噬并没有被激活,且3MA处理进一步加剧了AKO斑马鱼肝脏甘油三酯的积累,这意味着当Atgl被阻断时,脂滴自噬仍然起着较为基础的降解脂滴的作用。透射电镜图片以及生化数据表明AKO斑马鱼肝脏中积累着大量的大脂滴,且这些脂滴富含甘油三酯。其次,利用LKO雄性斑马鱼及其对应的F3代野生型同样进行了4周养殖实验,试图于酸性脂肪酶缺失的条件下再度检测肝脏中脂滴水解和脂滴自噬的变化情况。与此同时,还在饲料中添加了AI来抑制LKO斑马鱼的脂解,以期探索Lal缺陷是否会影响鱼类脂滴水解功能的发挥。结果发现,LKO斑马鱼肝脏积累大量小脂滴,且这些脂滴富含胆固醇而非甘油三酯。这部分结果验证了溶酶体酸性脂肪酶降解CE的功能在脊椎动物中是较为保守的,同时也说明,脂滴水解和脂滴自噬在调节甘油三酯和胆固醇代谢方面分别发挥着不同的作用。此外,相较WT,LKO组肝脏脂滴水解相关基因均极显着上调,说明Lal的缺失激活了脂滴水解,尤其是Atgl功能的增强。令人惊讶的是,额外的AI处理诱导了LKO斑马鱼肝脏非Lal依赖的自噬途径。透射电镜照片提示当脂滴水解和脂滴自噬同时受阻时,很可能引发了线粒体自噬。随后,检测了上述六组肝脏样品（WT/AKO/AKO+3MA;WT/LKO/LKO+AI）中有关细胞凋亡、炎症、内质网应激等的基因表达以及重点关注了线粒体相关指标,如线粒体DNA拷贝数,肝细胞线粒体形态学分析等。数据表明,线粒体肿胀在AKO+3MA组格外严重,且LKO+AI组肝损伤相关基因显着高表达。溶酶体标志蛋白Lamp1和线粒体标志蛋白Hsp60的免疫荧光共定位进一步证实了LKO+AI组肝脏存在线粒体自噬现象。因此,当细胞内的两种脂滴降解途径被同时阻断时,可能通过线粒体自噬为机体供能,这暗示着脂滴水解和脂滴自噬在鱼类能量供应中存在协同作用。
贾林·阿布扎力汗[6]（2021）在《APLP2基因变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究》文中认为目的:本研究旨在寻找淀粉样肽前体样蛋白2（APLP2）调控相关基因及新的变异位点,从基因/蛋白/环境多层次水平上研究其参与调控胆固醇代谢的机制与功能,为以他汀类药物为基础的高脂血症的治疗、降低心脑血管疾病的患病率和死亡率提供理论依据及新的治疗策略。1)采用极端表型策略结合二代测序技术在新疆地区人群中检测APLP2基因非同义突变位点,使用Methyltarget高通量测序法检测APLP2基因甲基化水平。2)探讨淀粉样肽前体样蛋白2（APLP2）新的变异体参与胆固醇代谢过程中的分子机制。3)探讨APLP2基因单核苷酸多态性（SNP）与新疆人群中血脂异常发生率间的关联性。方法:1)采用极端表型策略,选取新疆地区维吾尔族和哈萨克族共60例研究对象,分析APLP2基因与血脂谱的关联性。采用病例对照的研究方法,分析APLP2基因在冠心病组和对照组中的甲基化水平。2)在细胞水平上,构建APLP2基因新变异体的真核过表达质粒,采用蛋白质免疫印迹、实时定量PCR、免疫沉淀、免疫共沉淀等实验手段研究APLP2蛋白表达、稳定性、降解等本身特点及对靶蛋白Apo E/LRP1、PCSK9/LDLR的影响,探究APLP2参与调控胆固醇代谢的机制和功能。3)选择新疆地区汉族、维吾尔族及哈萨克族年龄≥35岁的人群1738例,利用Taqman技术对APLP2基因标签SNPs进行扩大样本量验证,阐述与血脂代谢的相关性。结果:1)本研究中入选的60例血脂极高和极低人群进行APLP2基因全外显子组测序,共发现11个新的未曾报道的非同义变异体（Q194E、G42E、G295S、M323I、D329N、S447N、R468C、H534Q、V535M、D573Y及P601A）,其中Q194E、G42E、M323I、S447N、R468C、及P601A非同义变异体出现在LDL-C极高组人群中,其余的均出现在LDL-C极低组人群中。冠心病患者中APLP2基因甲基化水平明显高于健康对照组研究对象。2)在细胞水平上进行机制研究结果显示:与野生型APLP2相比,APLP2 G42E变异体的蛋白表达水平明显减少,APLP2 Q194E变异体的蛋白表达水平明显增加,然而在mRNA水平上的表达与野生型无明显差异。APLP2 G42E突变体的半衰期相对较短,降解速度较快,APLP2 Q194E突变体的半衰期相对较长,降解相对缓慢。野生型APLP2能够与ApoE相互作用,与野生型相比,APLP2 G42E和APLP2 Q194E与ApoE的结合没有显着区别。APLP2野生型与LDLR有相互作用,并且是剂量依赖性增加。与野生型相比,APLP2 G42E和APLP2Q194E与PCSK9介导LDLR的降解实验无明显结果差异。3)APLP2基因rs2054247多态性位点与血清总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平相关（P<0.05）。APLP2基因rs2054247位点多态性与血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）相关（P<0.05）。然而,rs2054247位多态性与血清甘油三酯（TG）水平无关（P>0.05）。APLP2基因rs3740881多态性位点与血清TC、LDL-C、HDL-C和TG水平均无关（P>0.05）。APLP2 rs747180多态性位点只与TC、LDL-C水平相关（P<0.05）。结论:1)本研中在新疆地区哈萨克族和维吾尔族人群中共筛选出APLP2基因11个非同义突变位点,新疆地区人群冠心病患者中APLP2基因甲基化水平较健康对照组高。2)对APLP2基因新变异体G42E和Q194E在细胞水平上进行机制研究后发现G42E和Q194E变异体不影响胆固醇水平。同时,该两个变异体不影响与ApoE/LRP1结合,也不影响PCSK9介导LDLR的降解。3)APLP2基因rs2054247和rs747180位点多态性在新疆人群中可能与高TC和高LDL-C水平相关。ApoE基因rs429358多态性位点在新疆维吾尔族人群中可能与冠心病的发病相关。
于海滨[7]（2020）在《线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响》文中研究指明随着畜牧业的快速发展和人类生活水平的提高,消费者对牛乳品质的需求也逐渐增加,对乳品质的要求也越来越高。牛乳品质性状是复杂经济性状,多基因共同调控其表型变化。随着后基因组学时代的到来,筛查与挖掘奶牛乳脂性状相关且具有重大遗传效应的候选功能基因,成为当前奶牛遗传育种科研工作者的主要挑战。甘油-3-磷酸酰基转移酶线粒体（GPAM）基因,属于GPAT基因家族,该基因定位在牛第26q22号染色体上。有研究表明,GPAM基因催化磷脂和甘油三酯（TG）生物合成的第一步反应。基于课题组前期组学分析结果,GPAM基因可能对牛乳脂代谢具有重要影响。本研究以GPAM为候选基因,在敲除细胞水平验证目的基因与牛脂质代谢的功能,同时在模式动物的基础上,解析GPAM基因对乳脂代谢的调控作用机制。利用CRISPR-Cas9技术,以牛乳腺上皮细胞为研究对象,构建GPAM基因敲除细胞系,同时利用本课题组前期构建的GPAM基因过表达和干扰载体,分别检测目的基因过表达、干扰和敲除后,基因m RNA和蛋白水平的表达情况,检测细胞内甘油三酯、胆固醇和脂肪酸含量,并利用RT-q PCR和Western-blot技术,在m RNA和蛋白水平上验证GPAM基因对牛乳脂代谢相关基因的调控作用。研究结果表明:目的基因敲除后,细胞内GPAM在m RNA和蛋白水平的表达均降低;GPAM基因敲除细胞系内的甘油三酯和胆固醇的含量相对于野生型细胞均显着降低;细胞内脂肪酸含量检测结果显示:GPAM基因过表达能够降低细胞内丁酸的含量,沉默GPAM基因能够促进细胞内丁酸和辛酸含量显着升高;GPAM基因敲除能够促进辛酸的含量增加;乳脂代谢相关基因表达量的检测结果显示:敲除GPAM基因能够降低细胞内脂代谢相关基因ACSL5、FABP3、HSL、PRSS2、AGPAT4的表达,进而调控乳脂代谢通路。GPAM基因转录组测序共获得360个上调基因和570个下调基因;差异基因中的352个基因共富集在3196个GO terms,其中613个GO terms显着富集,包括402个生物过程的GO terms,72个细胞成分GO terms和139个分子功能GO terms;差异表达基因中共富集237个Pathway,其中139个Pathway显着富集（P<0.05）,下调基因富集在78个通路中,上调基因富集在61个通路中。GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析结果表明,GPAM敲除后在对糖代谢信号通路的作用,主要是通过影响丙酸（PATH:00640）和丙酮酸（PATH:00620）代谢通路,使其表达水平上调,提示GPAM基因可能对丙酸和丙酮酸起调控作用,从而对细胞内糖酵解产生一定的影响。同时在转录组测序结果中也发现GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。根据转录组的数据分析结果表明;GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。转录组数据分析发现,GPAM基因参与丙酸、丙酮酸代谢进程,该基因敲除后细胞内丙酸、丙酮酸代谢发生了变化,预测可能对线粒体能量代谢和糖酵解产生影响。同时,GPAM基因作为一种线粒体基因,研究其表达对细胞线粒体功能的影响具有重要意义,根据以上推断我们展开了敲除细胞内线粒体能量代谢的研究。以牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系为研究对象,研究GPAM基因敲除后细胞中线粒体数量、线粒体呼吸能力、线粒体糖酵解速率、细胞对ATP需求的变化。线粒体能量代谢实验结果表明:在GPAM基因敲除细胞系中,细胞内线粒体呼吸能力降低。同时,GPAM敲除后导致线粒体糖酵解所需的重要调节酶活性降低,从而最终导致细胞线粒体糖酵解过程受到显着抑制。同时影响了细胞内Na+/K+的转运;敲除GPAM基因后细胞内线粒体含量减少。实验表明,敲除细胞中GPAM含量的降低导致了细胞线粒体氧化磷酸化和三羧酸循环过程受到显着抑制。以上这些结果都说明,GPAM的敲除能够影响乳腺上皮细胞的线粒体能量代谢。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,建立GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上验证基因表达调控作用。结果表明:GPAM基因敲除小鼠的生长、发育和繁殖无明显的变化。血清学检测结果发现:GPAM基因敲除小鼠的血清中甘油三酯含量显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）,而血清中胆固醇的含量变化并不显着;组织中甘油三酯和胆固醇的检测结果发现:敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织中甘油三酯、胆固醇的含量均显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）;小鼠乳汁甘油三酯酶联免疫吸附实验结果显示:与野生鼠相比,GPAM基因敲除小鼠乳汁中的甘油三酯含量明显降低（p<0.05）;组织形态学观察表明,敲除小鼠脂肪组织中脂肪细胞的胞体直径略小于野生型小鼠,肌间脂肪含量明显少于与野生型小鼠,乳腺组织中野生型小鼠的脂肪细胞的直径略大于敲除型小鼠,其他组织无明显形态学变化;乳腺组织的脂肪酸含量检测结果显示:敲除小鼠乳腺组织中肉豆蔻酸、棕榈硬脂酸、花生四烯酸盐和亚麻酸盐上显着高于野生型小鼠。本研究在前期转录组学分析的基础上,以GPAM为候选基因,在敲除细胞系水平上验证GPAM基因对细胞内脂肪酸、甘油三酯、胆固醇含量的影响,并对GPAM基因敲除细胞系进行转录组分析,解析该基因敲除后对乳脂代谢相关基因的分子机制;同时检测了敲除GPAM基因乳腺上皮细胞内线粒体活性及能量代谢改变情况,阐明GPAM基因是参与线粒体能量代谢的重要基因,并对糖酵解产生影响;构建了GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上进一步验证GPAM基因对乳脂代谢的调控作用。为奶牛乳脂性状的改良和新品种的培育提供优质的基因资源和理论基础。
周杰[8]（2016）在《鲤鱼两种脂蛋白脂肪酶基因的cDNA克隆、表达及催化活性研究》文中进行了进一步梳理脂肪是生物体重要的储能物质,其分解产物脂肪酸又是生物体重要的结构物质和活性物质。脂蛋白脂肪酶能够分解脂肪,在生物体脂肪代谢及其相关脂类调控中发挥着重要的作用。在鱼类中存在着两种脂蛋白脂肪酶（LPL1、LPL2）。目前对于鲤鱼LPL结构及功能方面的研究还没有报道,所以本文选取鲤鱼为研究对象,阐明了鲤鱼LPL基因的表达及其功能情况。利用RT-PCR的方法分离了鲤鱼LPL1和LPL2编码区cDNA全长序列,克隆结果表明,鲤鱼LPL1和LPL2开放阅读框（ORF）分别为1524 bp和1503 bp,分别编码507个和500个氨基酸。同源分析结果表明,LPL1和LPL2氨基酸序列相似性为45.51%。氨基酸功能位点分析表明,LPL1、LPL2的N-糖基化位点分别为85N、401N和400N,肝素结合域分别为321R-323N和319R-321N,催化活性位点分别为174S、198D、283H和172S、196D、281H,二聚体形成的保守疏水残基位点分别为218A、230G、237G和216A、228G、235G。系统进化分析表明,鲤鱼LPL1、LPL2与不同纲动物的LPL1、LPL2之间的遗传距离与分类地位基本一致,进化树很好的显示了鱼纲不同科、目的系统发育水平。利用实时荧光定量PCR检测了 iPL1、LPL2在鲤鱼不同组织中的表达情况,结果显示,LPL1和LPL2在不同组织中均有表达,在肝脏中表达量最高,其次为心脏、脂肪、肌肉、脑、中肾,在前肠中表达量最低,在所有组织中,LPL1的表达量始终高于LPL2的表达量。利用酶联免疫法和BCA全蛋白测定法测定了鲤鱼心脏、脂肪、肌肉、肝脏等组织中的脂蛋白脂肪酶含量,结果发现,这与LPL在mRNA水平上的表达量一致。LPL1和LPL2原核表达蛋白成功地在大肠杆菌中获得且使用Ni柱纯化。使用对硝基苯酚法（pNP）测定了 LPL1和LPL2酶活,结果表明,LPL1和LPL2酶活的最适温度均为35℃,最适pH均为8.0,在最适温度和pH条件下,LPL1和LPL2的酶活分别为22.69U/g、17.4U/g。很显然,两者序列差异导致了蛋白酶活不同。
邢成锋,阎萍,梁春年,裴杰[9]（2008）在《脂蛋白脂肪酶基因的研究进展》文中研究指明脂蛋白脂酶是脂质代谢的关键酶,主要催化乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯水解。产生供组织利用的脂肪酸和单酰甘油。笔者综述了LPL基因的结构、功能、表达调控以及基因突变的研究进展。
赵莉莉,汪军梅,穆云翔,杨宇虹,赵郁,刘新宇,解用虹[10]（2006）在《国人脂蛋白脂肪酶基因突变的筛查》文中研究表明目的筛查天津地区脂蛋白脂肪酶基因突变情况,并探讨其对血脂水平的影响。方法利用聚合酶链反应—单链构象多态性分析技术对386例样本（血脂正常组278例,血脂异常组108例）的脂蛋白脂肪酶基因进行突变筛查,对可疑突变的扩增样品进行DNA序列测定。对于频率较高的多态性位点,引入限制性核酸内切酶位点利用聚合酶链反应限制片长多态性进行鉴定。结果在386例样本中,共检出4种突变,检出率为14.5%,其中1例为目前国内外未见报道的外显子3 Leu103→Leu同义突变杂合子,1例为目前亚洲首报的外显子5 Pro207→Leu突变杂合子,3例内含子3受位剪接点上游6 bp的C→T转换的突变杂合子,1例Ser447→stop突变纯合子,50例Ser447→stop突变杂合子。结论我国天津地区人群存在着广泛的脂蛋白脂肪酶基因变异,既具有与大多数国家相同的Ser447→stop多态性位点,也具有自身的特点。
二、脂蛋白脂肪酶外显子9基因突变研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脂蛋白脂肪酶外显子9基因突变研究（论文提纲范文）
（1）APOB基因突变c.12581T>C致家族性高胆固醇血症的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1、临床资料收集 |
| 2、基因测序 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 方法步骤 |
| 2.2.1 基因组DNA的提取 |
| 2.2.2 DNA全基因组文库制备 |
| 2.2.3 目标基因捕获及高通量测序 |
| 2.2.4 生物信息学分析 |
| 2.2.5 数据筛选 |
| 2.2.6 一代验证 |
| 3、质粒构建 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 方法步骤 |
| 3.2.1 目的基因及工具载体信息 |
| 3.2.2 载体酶切 |
| 3.2.3 目的基因片段获取 |
| 3.2.4 PCR扩增目的基因片段 |
| 3.2.5 PCR产物与载体进行交换 |
| 3.2.6 转化 |
| 3.2.7 质粒抽提 |
| 3.2.8 菌液PCR鉴定 |
| 3.2.9 测序 |
| 4、细胞转染实验 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 人正常肝细胞HL-7702 复苏及培养 |
| 4.2.2 质粒转染预实验 |
| 4.2.3 质粒转染正式试验 |
| 5、蛋白功能实验 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.2 免疫共沉淀 |
| 5.2.1 蛋白提取 |
| 5.2.2 共沉淀反应 |
| 5.3 Western blotting |
| 5.3.1 溶液配制 |
| 5.3.2 SDS-PAGE胶的制备 |
| 5.3.3 电泳 |
| 5.3.4 转膜 |
| 5.3.5 封闭及抗体孵育 |
| 5.3.6 显影 |
| 6、统计分析 |
| 结果 |
| 1、临床资料分析 |
| 2、基因测序及突变位点功能预测 |
| 3、APOB突变型质粒阳性克隆构建及鉴定 |
| 4、过表达质粒分组转染结果 |
| 5、截短APOB蛋白与LDLR结合情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 APOB基因突变致家族性高胆固醇血症研究进展 |
| 一、FH的分型 |
| 二、FH的致病基因 |
| 三、FH的临床表现 |
| 四、FH的临床诊断 |
| 五、FH的临床治疗 |
| 六、APOB蛋白的结构与功能 |
| 七、APOB基因突变的研究现状 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 致谢 |
（2）Lp-PLA2敲除兔模型的构建及其对动脉粥样硬化影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 动脉粥样硬化研究概述 |
| 1.1 动脉粥样硬化的发生 |
| 1.2 动脉粥样硬化的发展 |
| 1.3 炎症与动脉粥样硬化 |
| 1.4 血脂与动脉粥样硬化 |
| 第2章 Lp-PLA_2研究概述 |
| 2.1 Lp-PLA_2概述 |
| 2.2 Lp-PLA_2与动脉粥样硬化 |
| 2.3 Lp-PLA_2的基因多态性 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 Lp-PLA_2在兔动脉粥样硬化进程中的变化 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 Lp-PLA_2对血脂代谢的影响及作用机制研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 Lp-PLA_2对动脉粥样硬化的影响及作用机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）脂蛋白脂酶基因突变致儿童高三酰甘油血症性胰腺炎一例报道并文献复习（论文提纲范文）
| 1 病例简介 |
| 2 讨论 |
| 2.1 LPL基因及其突变情况 |
| 2.2 HTGP的临床特点 |
| 2.3 HTGP的发病机制 |
| 2.4 病例反思及HTGP的临床诊疗思路 |
（4）LIPG通过激活PI3k/Akt/mTOR信号通路促进宫颈癌发生发展的机制分析（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 实验材料 |
| 第二部分 实验方法 |
| 第三部分 实验结果 |
| 第四部分 实验讨论 |
| 第五部分 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 LIPG 目前的研究领域与在癌症中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）鱼类脂滴自噬与脂滴水解在脂代谢调控中的互作机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 鱼类脂滴自噬研究进展 |
| 1.1 脂滴自噬的定义和发生过程 |
| 1.2 脂滴自噬在鱼类营养领域的研究进展 |
| 1.3 鱼类脂滴自噬与哺乳动物研究现状的简要比较 |
| 第二节 鱼类脂滴水解研究进展 |
| 2.1 脂滴水解的概念和关键步骤 |
| 2.2 脂滴水解在不同鱼类中的作用与调控 |
| 2.3 鱼类脂滴水解与哺乳动物研究现状的简要比较 |
| 第三节 哺乳动物脂滴自噬与脂滴水解关系研究进展 |
| 3.1 脂滴水解与自噬/脂滴自噬的互作研究 |
| 3.2 调控脂滴水解与脂滴自噬的信号通路 |
| 第四节 本研究的科学问题 |
| 第五节 本论文研究目的和意义 |
| 第二章 自噬与脂解对鱼类生长代谢的重要性研究 |
| 第一节 抑制自噬对尼罗罗非鱼整体营养代谢的影响研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二节 抑制脂解对斑马鱼生长代谢的影响研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 斑马鱼脂滴水解与脂滴自噬关键基因敲除品系的建立 |
| 第一节 斑马鱼脂滴水解关键基因atgl纯合品系的构建 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 Atgl敲除斑马鱼建系过程 |
| 1.3 atgl基因组织分布情况 |
| 1.4 atgl~(-/-)幼鱼表型 |
| 1.5 小结 |
| 第二节 斑马鱼脂滴自噬关键基因lal纯合品系的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 Lal敲除斑马鱼建系过程 |
| 2.3 lal基因组织分布情况 |
| 2.4 lal~(-/-)幼鱼转录组以及表型摸索 |
| 2.5 小结 |
| 第四章 Atgl和 Lal敲除斑马鱼的代谢模式探索 |
| 第一节 Atgl敲除斑马鱼的整体表型 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论和小结 |
| 第二节 Lal敲除斑马鱼的整体表型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论和小结 |
| 第三节 Atgl和 Lal敲除斑马鱼的成鱼转录组比较 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论和小结 |
| 第五章 从中性脂肪酶和酸性脂肪酶角度探究鱼类脂滴自噬与脂滴水解之间的关系 |
| 第一节 敲除斑马鱼Atgl对肝脏脂解与自噬的影响 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论和小结 |
| 第二节 敲除斑马鱼Lal对肝脏脂解与自噬的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论和小结 |
| 第三节 脂解与自噬同时受阻对斑马鱼肝损伤和线粒体稳态的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论和小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 第一节 主要结论 |
| 第二节 论文创新点 |
| 第三节 研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在研期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）APLP2基因变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 新疆地区人群胆固醇代谢相关基因APLP2 新突变位点的筛查及甲基化水平检测 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂、耗材和仪器设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学方法 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 APLP2 基因新变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂耗材及仪器设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 胆固醇代谢相关基因APLP2 与血脂异常的关联性研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计学分析 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 APLP2在胆固醇代谢中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（7）线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 GPAM基因的研究进展 |
| 1.1 GPAM基因家族基因 |
| 1.2 GPAM基因的生物学作用 |
| 1.3 线粒体GPAM的功能 |
| 1.4 酵母中的GPAT表达 |
| 1.5 GPAM在甘油三酯合成中的调控作用 |
| 1.6 结语 |
| 第二章 影响乳品质的重要因素及乳脂代谢通路的研究进展 |
| 2.1 甘油三酯的在乳品质评价中意义 |
| 2.2 哺乳动物乳腺中的甘油三酯合成 |
| 2.3 乳脂代谢相关基因的简介 |
| 2.4 多不饱和脂肪酸在乳脂中的调控作用 |
| 2.5 乳汁中的甘油三酯表达 |
| 2.6 结语 |
| 第三章 线粒体基因及线粒体能量代谢的研究进展 |
| 3.1 线粒体的主要功能 |
| 3.2 线粒体在生命活动中的重要意义 |
| 3.3 线粒体在细胞死亡过程中的作用 |
| 3.4 线粒体能量代谢 |
| 3.5 结语 |
| 第四章 基因编辑技术的研究进展 |
| 4.1 转基因技术概况 |
| 4.2 精原干细胞技术 |
| 4.3 原始生殖细胞技术 |
| 4.4 胚胎干细胞基因打靶技术 |
| 4.5 条件基因靶向技术 |
| 4.6 诱导多能干细胞技术 |
| 4.7 CRISPR-CAS9 技术 |
| 4.8 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系的建立及其对细胞内乳脂代谢的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验用酶 |
| 1.1.4 其他药品及试剂 |
| 1.1.5 试剂的配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.2.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆及鉴定 |
| 1.2.3 GPAM基因敲除靶位点的设定以及sg RNA的设计 |
| 1.2.4 gRNA的体外筛选 |
| 1.2.5 GPAM基因g RNA表达载体的构建 |
| 1.2.6 细胞培养及传代 |
| 1.2.7 敲除载体的的转染 |
| 1.2.8 细胞内编辑效率验证 |
| 1.2.9 敲除细胞的筛选、培养及鉴定 |
| 1.2.10 实时荧光定量PCR和 Western Blot检测候选基因的表达 |
| 1.2.11 GPAM基因表达载体与干扰载体鉴定 |
| 1.2.12 细胞内甘油三酯和胆固醇含量检测 |
| 1.2.13 细胞内脂肪酸含量的测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.3.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆和鉴定 |
| 1.3.3 gRNA浓度的测定 |
| 1.3.4 gRNA的体外筛选结果 |
| 1.3.5 敲除载体的构建及细胞转染 |
| 1.3.6 细胞内敲除效率验证 |
| 1.3.7 阳性细胞测序验证 |
| 1.3.8 GPAM过表达和干扰载体鉴定与检测结果 |
| 1.3.9 牛GPAM基因敲除后细胞内m RNA和蛋白表达的检测 |
| 1.3.10 GPAM基因表达对细胞内甘油三酯含量的影响 |
| 1.3.11 GPAM基因表达对细胞内胆固醇含量的影响 |
| 1.3.12 GPAM基因表达对细胞内脂肪酸含量的影响 |
| 1.3.13 GPAM敲除对脂代谢相关基因的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 其他药品及试剂 |
| 2.1.4 试剂的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA提取及质量检测 |
| 2.2.2 文库建立及测序 |
| 2.2.3 原始数据质量控制 |
| 2.2.4 Mapping结果统计及基因结构分析 |
| 2.2.5 差异基因表达分析 |
| 2.2.6 差异基因GO富集和KEGG分析 |
| 2.2.7 差异基因表达水平验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细胞总RNA提取及检测 |
| 2.3.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序数据筛选及分析 |
| 2.3.3 差异表达基因分析 |
| 2.3.4 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3.5 差异基因蛋白互作预测分析 |
| 2.3.6 GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析 |
| 2.3.7 基因共表达网络关系预测分析 |
| 2.3.8 差异基因的表达水平验证 |
| 2.3.9 GPAM基因对甘油三酯合成相关基因的调控作用 |
| 2.3.10 GPAM基因对脂肪酸合成相关基因的调控作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛GPAM基因对乳腺上皮细胞线粒体能量代谢的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 其他药品及试剂 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞线粒体的提取 |
| 3.2.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体呼吸的检测 |
| 3.2.3 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.2.4 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.2.5 敲除细胞对ATP 需求的影响 |
| 3.2.6 细胞线粒体数量的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敲除细胞中线粒体呼吸的检测 |
| 3.3.2 敲除细胞中线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.3.3 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.3.4 GPAM基因敲除后细胞内线粒体数量的改变 |
| 3.3.5 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中三羧酸循环检测分析 |
| 3.3.6 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中氧化磷酸化检测分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于敲除小鼠模型验证GPAM基因对脂肪代谢的调控作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 其他药品及试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 分析软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 GPAM基因敲除小鼠模型的制备 |
| 4.2.2 GPAM基因敲除小鼠的扩繁 |
| 4.2.3 GPAM基因敲除小鼠的鉴定 |
| 4.2.4 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.2.5 目的基因敲除小鼠相关生长性状的测定 |
| 4.2.6 组织形态学的检测 |
| 4.2.7 敲除小鼠血清学相关指标的检测 |
| 4.2.8 敲除小鼠组织中甘油三酯和胆固醇含量的检测 |
| 4.2.9 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的检测 |
| 4.2.10 敲除小鼠组织中脂肪酸成分及含量的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 敲除小鼠的阳性鉴定 |
| 4.3.2 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.3.3 目的基因敲除小鼠相关生长性状测定 |
| 4.3.4 目的基因敲除小鼠各组织形态学分析 |
| 4.3.5 敲除小鼠血清中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.6 敲除小鼠血清中胆固醇含量的测定 |
| 4.3.7 敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织甘油三酯和胆固醇含量的测定 |
| 4.3.8 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.9 敲除小鼠乳腺脂肪酸含量的测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表的文章及专利 |
| 致谢 |
（8）鲤鱼两种脂蛋白脂肪酶基因的cDNA克隆、表达及催化活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 脂肪酶家族概述 |
| 3 脂蛋白脂肪酶研究进展 |
| 3.1 脂蛋白脂肪酶的发现 |
| 3.2 脂蛋白脂肪酶基因的结构和性质 |
| 3.3 脂蛋白脂肪酶基因的表达及其调控 |
| 3.4 脂蛋白脂肪酶基因突变性研究 |
| 3.5 催化活性测定方法 |
| 4 实验目的与意义 |
| 第二章 鲤鱼两种脂蛋白脂肪酶基因的cDNA克隆及组织表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用鱼 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂与引物 |
| 1.4 总RNA提取及cDNA合成 |
| 1.5 鲤鱼LPL1、LPL2基因编码区cDNA序列克隆 |
| 1.6 序列分析 |
| 1.7 LPL mRNA组织表达测定 |
| 1.8 LPL蛋白含量测定 |
| 1.9 遗传进化分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 鲤鱼LPLs基因序列及其结构分析 |
| 2.2 遗传进化分析 |
| 2.3 组织表达分析 |
| 2.4 LPL蛋白的组织分布 |
| 3 讨论 |
| 第三章 原核表达及蛋白纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料及试剂 |
| 1.2 重组质粒LPLs-pEASY-E2的构建及鉴定 |
| 1.3 重组质粒LPLs-pEASY-E2的原核表达 |
| 1.4 蛋白纯化 |
| 1.5 BCA蛋白浓度测定 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 重组质粒LPLs-pEASY-E2的构建与鉴定 |
| 2.2 重组质粒LPLs-pEASY-E2的原核表达 |
| 2.3 融合蛋白LPLs的纯化及其鉴定 |
| 2.4 BCA蛋白浓度测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 LPLs催化活性测定和分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验试剂及仪器 |
| 1.2 p-NPP底物和p-NP标准溶液的的配制 |
| 1.3 p-NP标准曲线的制作 |
| 1.4 LPLs在不同温度下的酶活 |
| 1.5 LPLs在不同pH下的酶活 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 温度对LPL1、LPL2酶活的影响 |
| 2.2 pH对LPL1、LPL2酶活的影响 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的论文 |
（9）脂蛋白脂肪酶基因的研究进展（论文提纲范文）
| 1 LPL基因的结构与性质 |
| 2 LPL基因的表达调控 |
| 3 LPL的遗传突变的研究进展 |
| 3.1 人类LPL遗传突变及与疾病的研究 |
| 3.2 牛的LPL基因 |
| 3.3 猪的LPL基因 |
| 3.4 鸡的LPL基因 |
| 4 讨论 |
（10）国人脂蛋白脂肪酶基因突变的筛查（论文提纲范文）
| 1 对象与方法 |
| 1.1 对象 |
| 1.2 基因组DNA的提取 |
| 1.3 目的基因的扩增 |
| 1.4 单链构象多态性分析 |
| 1.5 DNA测序 |
| 1.6 聚合酶链反应—限制片长多态性分析 |
| 2 结 果 |
| 2.1 脂蛋白脂肪酶外显子聚合酶链反应—单链构象多态性分析 |
| 2.2 异常DNA带型样品序列 |
| 2.2.1 外显子3 |
| 2.2.2 外显子4 |
| 2.2.3 外显子5 |
| 2.2.4 外显子9 |
| 2.3 聚合酶链反应—限制片长多态性分析 |
| 3 讨 论 |
四、脂蛋白脂肪酶外显子9基因突变研究（论文参考文献）
- [1]APOB基因突变c.12581T>C致家族性高胆固醇血症的分子机制研究[D]. 方明华. 青岛大学, 2021(02)
- [2]Lp-PLA2敲除兔模型的构建及其对动脉粥样硬化影响的研究[D]. 陈佳欢. 吉林大学, 2021(01)
- [3]脂蛋白脂酶基因突变致儿童高三酰甘油血症性胰腺炎一例报道并文献复习[J]. 许锦平,白海涛,姚拥华,陈先睿. 中国全科医学, 2021(21)
- [4]LIPG通过激活PI3k/Akt/mTOR信号通路促进宫颈癌发生发展的机制分析[D]. 黄静. 广州医科大学, 2021(02)
- [5]鱼类脂滴自噬与脂滴水解在脂代谢调控中的互作机制研究[D]. 韩思兰. 华东师范大学, 2021(12)
- [6]APLP2基因变异体参与胆固醇代谢的分子机制及功能研究[D]. 贾林·阿布扎力汗. 新疆医科大学, 2021(08)
- [7]线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响[D]. 于海滨. 吉林大学, 2020
- [8]鲤鱼两种脂蛋白脂肪酶基因的cDNA克隆、表达及催化活性研究[D]. 周杰. 南京农业大学, 2016(04)
- [9]脂蛋白脂肪酶基因的研究进展[J]. 邢成锋,阎萍,梁春年,裴杰. 华北农学报, 2008(S2)
- [10]国人脂蛋白脂肪酶基因突变的筛查[J]. 赵莉莉,汪军梅,穆云翔,杨宇虹,赵郁,刘新宇,解用虹. 中国动脉硬化杂志, 2006(08)