一、双位点核酶抑制细胞内乙型肝炎病毒表达的研究（论文文献综述）
蒲春文[1]（2011）在《优化选择的串联序列amiRNA表达载体抗乙肝病毒的研究》文中指出RNA干扰为治疗人类疾病提供了一个很有前景的方法。前期已有一些学者对于RNAi抗HBV做过研究,但是每个研究小组设计的siRNA分子对病毒的抑制效果有明显的差异,因此还需在HBV的干扰靶点上做大量的工作；另外大多研究进行的都是siRNA的瞬时转染,未构建稳定的转染体系,不能观察清除HBV RNA的远期效果；目前临床应用的抗病毒药物也都需要进行长期治疗,包括干扰素、核苷酸类似物,RNA干扰的作用亦需持久。病毒基因突变是RNA干扰抗病毒失败的重要原因,针对病毒可逃逸RNAi作用的特点,我们设计了可在体内同时表达两个microRNA,靶向不同位点的串联序列amiRNA。即便是病毒一个基因位点的突变就可以逃逸siRNA,而并不能逃逸miRNA的干扰作用。miRNA在体内之所以能广泛存在并发挥作用,是因为它的特点是只要骨架与靶RNA相同,单一一个位点的变化不会影响其发挥作用。目前对于乙肝病毒的研究已从最初的化学合成siRNA、shRNA质粒载体等向应用性较强的microRNA的研究过渡。尽管有学者用化学合成的多个siRNA同时作用于一个细胞,证实了靶向多个区域基因的可行性,但其为剂量依赖性的,需经常向体内注入siRNA。通过质粒等载体在细胞内表达miRNA或siRNA不仅经济方便,还可进行稳定转染,使小干扰RNA持续表达,延长对目的基因的抑制时间。质粒载体能介导更长期的干扰效果,而过多的质粒载体可能对细胞造成一定的影响。串联序列表达载体的优点就在于只需导入一个质粒载体就可发挥作用。amiRNA使得导入的外源性基因在体内自然形成miRNA成为可能,并可同时表达多条miRNA。有学者利用polⅡ启动子表达多个串联的shRNAs,从而抑制了多个基因的表达,其对应蛋白的表达都有明显降低。但有研究提出siRNA可诱导IFN反应,从而存在一些安全性问题。相对于siRNA,由polⅡ启动子介导的amiRNA技术被证实不会引起宿主的免疫反应,亦没对miRNA的内源性途径产生影响,安全有效。有研究采用该种方法将2个串联序列amiRNA导入细胞,但未取得更好的干扰效果,可能是因为并没有找到最佳的干扰序列。另外,关于串联序列amiRNA在HBV DNA水平的干扰效果,尤其是cccDNA方面的干扰效率未见报道。HBV是一个DNA病毒,但必须经过前基因组RNA进行逆转录,使得RNA干扰得以发挥作用,临床中HBV DNA的检测更为实用。cccDNA是HBV的源泉,使得对它的观察更为重要。因为其半衰期较长,所以稳定转染更能接近临床研究情况。目的：本文结合以往研究的经验,针对HBV容易变异的特点,力图寻找针对HBV基因组保守区域的多个有效干扰位点；将构建的质粒瞬时转染入HepG2.2.15,检测各个序列在RNA水平对HBV的干扰效率；挑选干扰效果好的序列,优化设计并构建针对不同位点的串联序列amiRNA表达载体；通过瞬时转染和稳定筛选,全面研究单一序列及串联序列amiRNA表达载体在抑制HBV RNA、DNA和蛋白质表达及cccDNA方面的效果。方法：1.针对病毒容易变异而逃逸RNAi作用的特点,我们首先利用生物信息学软件找到不同基因型HBV基因的保守区域,避开临床常见的病毒变异位点选取4个HBV的RNAi靶位点,分别靶向HBV的S区或X区。2.利用microRNA设计软件,设计4条microRNA序列,并构建四个以CMV为启动子的内源性miR155为骨架的amiRNA表达质粒,分别命名为amiHBV-1、amiHBV-2、amiHBV-3和amiHBV-4。3.将构建成功的4个amiHBV表达载体分别瞬时转染到含有HBV-DNA全基因的人肝母细胞瘤HepG2.2.15细胞株,从mRNA水平研究单一序列amiHBV对HBV mRNA干扰效果,筛选干扰效率高的amiRNA序列,将其中2条干扰效率较高的单一序列串联,构建串联序列amiRNA表达质粒（amiHBV-3-4）。4.将串联序列amiHBV表达质粒瞬时转染入HepG2.2.15细胞,因为ami-HBVI和ami-HBV2在HBV mRNA水平的抑制效率低,在下一步的实验中将其舍去。采用实时定量荧光PCR法分别检测细胞培养上清液和细胞内的HBV DNA；采用CMIA法（Chemiluminescent Microparticle Immunoassay）定量检测分泌蛋白HBsAg和HBeAg的水平变化。5.通过转染后稳定细胞株的筛选,建立amiRNA稳定转染的HepG2.2.15细胞株,采用荧光实时定量检测试剂盒,对amiRNA干扰HBV的复制根源cccDNA的效果进行了研究。结果1.本研究中4个不同靶位的amiRNA载体被构建,4个单一序列及1条串联序列amiHBV表达载体均经测序验证构建成功。2.4个单一序列amiHBV表达质粒以amiHBV-4对HBV mRNA的抑制率最高可达75.6%, amiHBV-3对HBV mRNA的抑制率为61.2%；而amiHBV-1和amiHBV-2对HBVmRNA的抑制率仅为29.3%及14.9%；其中串联序列amiHBV 3-4的干扰效率为87.2%,串联序列组的干扰效率高于单一序列组。3.各组质粒对培养细胞上清中HBV DNA的干扰效率以串联序列质粒组最高可达到94.3%,单一序列组中干扰效率最高的分别为amiHBV-3组60.5%和amiHBV-4组68.0%。对细胞内HBV DNA的干扰效率amiHBV-3组、amiHBV-4组和amiHBV 3-4组分别为71.6%、80.2%和79.7%。4.在转染后72h对细胞上清中HBsAg的抑制效果最好的为串联序列组达到67.4%,其次为amiHBV-4组达到64.6%,再次为amiHBV-3组。对HBeAg的抑制总体效果不及对HBsAg的抑制效果好,串联序列组抑制效果最好,但也只达到了31%。稳定转染后两组（amiHBV 3-4和amiHBV-4）对HBsAg和HBeAg的分泌,均显示了显着的抑制效果。对HBsAg的抑制率最高达97.18%,对HBeAg的抑制率最高达97.00%。5.对HBV cccDNA的干扰情况进行了研究,瞬时转染amiHBV-4组对HBV cccDNA的抑制率为21.9%,串联序列amiHBV3-4组的抑制率（58.4%）明显高于单一序列组。稳定转染后串联序列组HBV cccDNA的抑制率为99.65%,单一序列组的抑制率为93.78%。结论：1.分别靶向HBV S区基因256-276bp和672-692bp位点的单一序列amiRNA对HBV RNA、DNA和表面抗原（HBsAg）均有显着的干扰效果。2.同时靶向HBV S区基因256-276bp和672-692bp两个位点的串联序列amiRNA对HBV RNA、DNA和HBsAg的干扰效果均显着优于单一序列HBVamiRNA的干扰效果。3.瞬时转染靶向HBV S区的串联序列amiRNA对HBsAg的抑制效果显着,对HBeAg的抑制不明显；稳定转染串联序列amiRNA对HBsAg和HBeAg均有显着的抑制效果。4.稳定转染的单一序列或串联序列amiRNA对HBV DNA、cccDNA、HBsAg及HBeAg的抑制效果均优于瞬时转染的抑制效果。5.针对HBV S区基因的单一序列或串联序列amiRNA对HBV RNA、表面抗原（HBsAg）、DNA及cccDNA均有较好的干扰效果,提示HBV S区基因是RNA干扰的有效靶点之一。6.串联序列amiRNA介导的RNA干扰机制能极大程度的抑制HBV的复制、病毒蛋白的表达及复制根源cccDNA。7.本研究串联两个靶位点的amiRNA表达质粒构建成功并显示高效的抗病毒功能,提示针对多个靶基因或靶位点的amiRNA载体的构建和功能的实现具有可行性。
闪明海[2]（2011）在《HBVC1653T位点突变、A1762T/G1764A双位点突变与肝细胞癌关系的研究》文中研究说明目的探讨HBV C1653T点突变、1762T/G1764A双位点突变与肝细胞癌发生的关系。方法1、收集2009年1月—2010年5月在宁夏回族自治区五家医院住院的88例HBV相关肝细胞癌（HCC）患者和104例慢性乙肝（CHB）患者血清和一般病例资料。采用巢式PCR扩增目的基因片段（nt1606-2606）并直接测序,测序结果用ChromaS软件与Genbank上登记的标准序列比较,分析慢性乙肝组和肝细胞癌组HBV C1653T位点、A1762T/G1764A双位点突变情况;HBV标志物和HBV DNA定量分别采用酶联免疫法吸附法（ELISA）和PCR荧光探针法（PCR-FQ）检测。2、分析HBV C1653T点突变、1762T/G1764A双突变与HBV DNA和e抗原的关系。3、采用多因素LogistiC回归分析年龄、e抗原、伴有肝硬化、HBV DNA、HBV C1653T点突变、1762T/G1764A双位点突与肝细胞癌的发生是否相关,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、C1653T点突变率在肝细胞癌组和慢性乙肝组中分别为35.25%（31/88）和12.5%（13/104）,肝细胞癌组明显高于慢性乙肝组（P=0.00）。2、A1762T/G1764A双位点突变率在肝细胞癌组和慢性乙肝组中分别为67.05%（59/88）和49.04%（51/104）,肝细胞癌组明显高于慢性乙肝组（P=0.00）。3、C1653T点突变患者组与无突变患者组HBV DNA定量值比较没有统计学差异性（5.446±1.075copies/mL Vs 5.821±1.163copies/mL,P=0.068）;A1762T/G1764A双突变患者HBV DNA定量值明显高于无突变患者,差异有统计学意义（6.135±1.186 copies/mL Vs 5.034±1.432 copies/mL,P=0.00 ）。4、HBeAg阴性组中C1653T位点的突变率明显高于HBeAg阳性组（32.71% Vs 10.59%,P=0.00）;HBeAg阴性组A1762T/G1764A双位点突变率明显高于HBeAg阳性组（69.16% Vs 42.46%,P=0.00）。5、多因素LogistiC回归分析提示C1653T点突变、A1762T/G1764A双突变是肝细胞癌发生的危险因素（P=0.001,OR=4.686;P=0.007,OR=2.848）。结论1、HCC组HBV C1653T位点突变率显着高于CHB组,多因素logistic回归分析该位点突变是肝癌发生的危险因素,这一结果或许可作为HBV感染者临床结局的可预测性分子标记。2、HCC组HBV A1762T/G1764A双位点突变率显着高于CHB组,多因素logistic回归分析BCP区双位点突变是肝细胞癌发生的危险因素,该结果或许可作为HBV感染者发展为肝癌的早期预警信号3、HBV C1653T位点突变对HBV的复制可能没有影响;HBV A1762T/G1764A双突变可能提高了HBV的复制能力。4、HBV C1653T位点突变、A1762T/G1764A双位点突变可能抑制HBeAg的表达。
厉海妮[3]（2008）在《靶向C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨靶向作用于乙型肝炎病毒C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的作用。方法:通过扩增、提取及酶切鉴定表达M1GS RNA核酶的真核表达质粒pEGFP-GS和对照空质粒pEGFP-C1;制备转染用表达质粒。应用脂质体Lipofectamine TM 2000将表达载体转染进HepG2.2.15细胞内,以ELISA法检测细胞培养液中病毒抗原,以逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测细胞内病毒mRNA,以荧光定量PCR法检测分泌入培养液的HBV DNA含量,用MTT法检测核酶对细胞增殖活性的影响。结果:质粒载体表达的M1GS RNA核酶能明显抑制细胞培养液中HBeAg的表达及病毒mRNA的表达,抑制率分别为31.58%,32.5%。但M1GS RNA核酶对培养液中的HBV DNA含量无明显影响,亦不影响HepG2.2.15细胞的增殖活性。结论:M1GS RNA核酶能特异性抑制HepG2.2.15细胞内HBV C区基因表达,是一种很有潜力的抗HBV基因治疗方法。
郜玉峰[4]（2008）在《外源性microRNA阻断HBV和HBV复制相关的宿主基因表达对HBV复制水平的影响》文中认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染是全球重要的公共卫生问题。目前全球慢性HBV感染人数己超过3.5亿,是导致肝硬化、重型肝炎及肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的主要原因。在中国,有大约10%的人口存在慢性HBV感染,直到目前,尚无有效的药物能完全达到理想的抗病毒效果或者清除病毒。因此,寻找一种新的治疗策略治疗慢性HBV感染是必要而且紧迫的。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一项新兴的基因沉默技术,主要通过siRNA和microRNA（miRNA）两种小RNA分子来发挥作用。siRNA介导的RNAi沉默基因表达是通过小片段双链RNA以序列特异性的方式与靶基因的mRNA相结合来实现的。但越来越多的研究发现,许多病毒在治疗选择压力下可以通过靶基因序列的突变或产生抑制因子来逃避RNAi,针对病毒的RNAi治疗效果因为病毒的变异而降低疗效,甚至失去治疗作用。miRNA作用方式很大程度上和siRNA介导的RNAi途径重叠。与siRNA相比,miRNA仅仅需要和靶基因部分的结合即可以发挥作用,因而可以在很大程度上避免因为病毒变异导致的RNAi治疗失败。这将对容易发生变异的病毒（如HCV, HBV, HIV）病的治疗更有优势。miRNA功能的研究可能有助于提出治疗病毒感染性疾病的新方法。另一种有效的病毒RNAi治疗途径将可能是针对病毒感染和复制所需要的宿主细胞因素进行RNA干扰研究。HBV在体内感染细胞和体内病毒复制需要宿主基因的参与,因此,以其为靶位进行RNA干扰降低宿主基因表达,可能会导致病毒复制水平的降低。以宿主基因为靶位RNAi治疗的优点是它不依赖于病毒的基因组,因而能避免病毒通过突变逃避RNAi的缺点。但目前国内外尚未见利用microRNA介导的RNA干扰技术对HBV和HBV复制所需的宿主基因进行基因治疗的研究报道。最近大量研究表明,通过借助于miRNA表达框架,可以实现将靶向特定基因的外源性人工合成的miRNA（artificial microRNA, amiRNA）导入细胞内,达到抑制靶基因的效果。因此,本实验研究分别构建了靶向HBV不同位点和靶向La蛋白基因和ASGPR1基因等宿主基因的外源性amiRNA表达载体,瞬时和稳定转染HepG2.2.15细胞,观察外源性amiRNA介导的RNA干扰能否阻断HBV和HBV复制相关的宿主基因表达,通过测定靶基因的抑制程度和HBV蛋白以及HBV DNA降低的程度,从而了解靶向HBV和相关宿主基因的外源性amiRNA表达对HBV复制水平的影响。目的:通过利用miRNA表达框架构建能够特异性靶向HBV和HBV感染和复制相关宿主基因的amiRNA表达载体,转染到HepG2.2.15细胞中,观察外源性amiRNA介导的RNA干扰对HBV复制水平的影响。方法:构建13个靶向HBV不同位点、La蛋白基因和ASGPR1基因的外源性amiRNA表达载体,测序证实插入序列的正确性。然后通过脂质体转染技术瞬时和稳定转染HepG2.2.15细胞,半定量RT-PCR方法观察靶基因mRNA的抑制程度;Western blotting方法观察La蛋白和ASGPR1蛋白的抑制程度;测定培养上清中的HBsAg、HBeAg浓度和HBV DNA的水平,观察靶向HBV、La蛋白基因和ASGPR1基因的外源性amiRNA对HBV复制和表达水平的影响。结果:1.瞬时转染amiRNA-HBV对HBsAg和HBeAg的抑制作用将构建的7个amiRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞,流式细胞仪检测转染效率在50%60%左右。在这种情况下,HBsAg和HBeAg测定结果显示:7个质粒均有不同程度的抑制作用,其中有3个质粒对HBsAg和HBeAg的表达具有显着的抑制作用。抑制效应在转染后48h抑制效果开始较明显,72h病毒抑制达到高峰,96h后抑制作用开始渐减弱。其中以amiRNA-HBV-S608对HBsAg的抑制作用最为明显,amiRNA-HBV-S608在转染后的48h、72h和96h三个时间点对HBsAg的平均抑制率分别为29.5%,49.8%和46.3%, P<0.01;amiRNA-P2227对HBeAg的抑制最显着,amiRNA-HBV-P2227在转染后的48h、72h和96h三个时间点对HBeAg的平均抑制率分别为36.4%,45.2%和40.3%, P<0.01。而阴性对照组对蛋白表达的影响与空白对照组相比无显着性差异, P>0.05。2.瞬时转染amiRNA-HBV对HBV DNA复制的抑制作用对瞬时转染各个时间点培养上清中的HBV DNA水平采用实时荧光定量PCR检测结果表明:与HBsAg和HBeAg抑制的作用相似,7个质粒对培养上清中的HBV DNA也均有不同程度的抑制作用,而阴性对照组载体与空白转染组相比对HBV DNA抑制无显着性差异, P>0.05。其中amiRNA-HBV-S608和amiRNA-HBV-P2227的抑制效果最为明显,但整体抑制率低于对HBsAg和HBeAg的抑制率。amiRNA-HBV-S608在转染后48h、72h和96h对HBV DNA的平均抑制率为27.8%,39.0%和36.5%,P<0.01。amiRNA-HBV-P2227在转染后48h、72h和96h对HBV DNA的平均抑制率为35.7%,48.2%和39.5%,P<0.01。3.稳定转染amiRNA-HBV对HBsAg和HBeAg的抑制作用检测结果显示,与2.2.15细胞相比,转染了阴性质粒得到的稳定株的HBsAg和HBeAg的分泌没有显着性变化,P>0.05,而转染的三个干扰HBV表达的质粒均显示了显着的抑制效果。其中amiRNA-HBV-P2227组对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为76.2%和74.9%,P<0.01。amiRNA-HBV-S608组对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为81.3%和58.2%,P<0.01。amiRNA-HBV-X402组对HBsAg和HBeAg的平均抑制率分别为70.2%和70.5%,P<0.01。4.稳定转染amiRNA-HBV对HBV DNA复制水平的影响在稳定转染的细胞株中,与瞬时转染相比,对HBV DNA的抑制率更高。荧光定量PCR （FQ-PCR）检测结果显示,amiRNA-HBV能够高效、特异地抑制HBV DNA的复制。amiRNA-HBV-S608组对培养上清中HBV DNA的平均抑制率为70.1%,P<0.01amiRNA-HBV-P2227对培养上清中HBV DNA的抑制率最高,达76.1%,P<0.01。amiRNA -HBV-X402的平均抑制率为67.9%,P<0.01。5.靶向宿主基因La蛋白的外源性amiRNA对HBV复制和表达水平的影响实验结果显示:转染amiRNA-La质粒后,HepG2.2.15细胞的细胞增殖和细胞形态与对照比较无显着差异;在La mRNA和蛋白水平上,结果显示3种amiRNA均能明显降低La mRNA和蛋白的表达,amiRNA-La-1130抑制效应最强,在转染后72h,La mRNA和蛋白的水平分别下降了58.6%和50.6%,P<0.01;但在病毒水平3种amiRNA-La质粒中仅有1个质粒能显着抑制相应细胞株中HBsAg和HBeAg的分泌,且抑制作用不强,其中以amiRNA-La-1130抑制作用最好,它对培养72h的细胞上清中的HBsAg和HBeAg平均抑制率分别为23.3%和25.8%,P<0.01,HBV DNA的平均抑制率为22.3%,P<0.01。6.靶向宿主基因ASGPR1的外源性amiRNA对HBV复制和表达水平的影响实验结果显示:转染amiRNA-ASGPR1质粒后,HepG2.2.15细胞的细胞增殖以及细胞生长速度与对照无显着差异,提示导入ASGPR1蛋白特异性amiRNA表达载体对HepG2.2.15细胞的生长无明显影响;在mRNA和蛋白水平上,RT-PCR结果证实3种amiRNA均能明显降低ASGPR1 mRNA和蛋白的表达;amiRNA-ASGPR1-610抑制效应最强,在转染后72h,ASGPR1 mRNA和蛋白的水平分别下降了57.3%和49.8%,P<0.01;在病毒水平3种amiRNA均能明显抑制相应细胞株中HBsAg和HBeAg的分泌,其中以amiRNA-ASGPR1-772抑制作用最强,它对培养72h的细胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分别为31.3%和33.6%, P<0.01,HBV DNA的抑制率为29.7%,P<0.01。结论1.外源性amiRNA介导的RNA干扰能够高效特异性的阻断HBV的复制和表达。2.外源性amiRNA介导的RNA干扰可以高效阻断La和ASGPR1宿主靶基因的表达。3.宿主基因La和ASGPR1的表达水平与HBV的复制和表达有密切关系,进一步证实两者在HBV的感染和复制中起着关键作用。与HBV感染和复制相关的宿主基因可以作为HBV基因治疗的一个候选靶位。4.在提高转染效率的情况下,外源性amiRNA能够作为一种新的抗HBV的基因治疗手段。
侯伟,刘克洲,沃健儿[5]（2005）在《提高核酶催化活性的相关策略》文中研究表明核酶（ribozyme）是一类具有催化活性的RNA分子,可通过碱基配对特异地与相应的RNA底物结合,并在特定的位点切割底物RNA分子。自美国科学家Cech和Altman等发现核酶至今的二十多年来,人们利用核酶可以特异性地切割靶RNA序列的特点,通过设计合适的核酶阻断特定基因的表达, 已相继对获得性免疫缺陷综合征、肿瘤、生殖系统疾病、病毒性肝炎、白血病、移植排斥反应等进
侯伟,沃健儿,刘克洲[6]（2005）在《核酶在抗病毒基因治疗中的设计策略》文中指出
张岩[7]（2005）在《应用RNAi技术抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究》文中提出乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原体之一。由HBV所引起的乙型肝炎是一种流行久远、传播广泛、危害严重的传染性疾病。目前全球慢性HBV感染者超过3亿5千万人。慢性HBV感染导致的肝炎肝硬化和肝癌等终末期肝病,已成为严重危害我国人民生命健康的主要疾病。乙肝疫苗的推广使用使乙肝免疫预防取得重大突破,但治疗上仍缺乏理想的抗病毒药物。目前在我国广泛应用的抗HBV药物主要有两类,α-干扰素和核苷类药物。但疗效均不理想,仍需探索新型有效的抗HBV的药物和方法。 HBV的基因组是一个带有部分单链区的环状双链DNA（dsDNA）分子,具有逆转录病毒的特性,其3.5kb前基因组RIgA既是DNA合成的模板,又是指导蛋白质合成的模板。HBV基因组高度重叠,因而针对HBV某一靶位点切割病毒的mRNA和前基因组RNA,可以有效阻断病毒蛋白质合成。在乙型肝炎基因治疗的探索中,应用反义寡核苷酸、核酶以及脱氧核酶抗HBV的研究曾经给人们带来令人鼓舞的结果,但终因许多难以克服的问题使深入研究难以继续。 近年RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术的出现,为各类慢性HBV感染的治疗开辟了新的途径。RNAi是指由双链RNA(double-stranded RNA,
王传玺,韩金祥,鲁艳芹[8]（2005）在《抗乙型肝炎病毒HDV核酶的研究新进展》文中研究表明乙型肝炎病毒 （HBV）是严重威胁人类健康的一种病毒 ,特别是在我国约有 1 2亿人为HBV携带者 ,占世界的 1 3。对已感染HBV者 ,常用的化学及免疫疗法通常无效。今年来 ,研究者试图利用反义技术 ,通过在基因表达水平上抑制HBV的复制 ,来达到治疗HBV感染的目的。核酶是具有RNA裂解活性的RNA分子 ,能特异地结合并切割靶RNA分子。HDV核酶是唯一在人体细胞天然具有裂解活性的核酶类型 ,研究将HDV核酶作为HBV的反义抑制剂可能有着其独特的优势。本文就HDV核酶靶位点的筛选、病毒载体导入系统、靶向性分子的构建等热点问题的研究新进展予以综述。
王玥[9]（2004）在《应用RNAi抑制乙型肝炎病毒复制和表达的研究》文中研究指明乙型肝炎病毒（HBV）感染是急慢性肝炎的主要原因，并与肝纤维化和肝细胞癌的发生密切相关。全世界约有3.5亿人感染该病毒，其中近15-25%的病人将死于该病的并发症。乙肝重组疫苗的推广使用使乙肝免疫预防取得重大突破，但治疗上仍缺乏理想的抗病毒药物。在乙型肝炎基因治疗的探索中，应用反义寡核苷酸、核酶以及脱氧核酶（DNAzyme）的技术研究屡见报导，但各自存在较多问题有待解决。HBV的基因组是一个带有部分单链区的环状双链DNA（dsDNA）分子，具有逆转录病毒的特性，其3.5kb前基因组RNA既是DNA合成的模板，又是指导蛋白质合成的模板。HBV基因组高度重叠，因而针对HBV某一靶位点切割病毒的mRNA和前基因组RNA，可以有效阻断病毒蛋白质合成。 RNA干涉（RNAi）是一种由双链RNA（dsRNA）引发的序列特异性基因沉默机制。在这一转录后基因沉默（PTGS）过程中，与双链RNA有同源序列的单链RNA（如mRNA）被降解，从而阻断基因表达。RNAi可介导相关基因特异性降解的特点，使其有望成为针对病毒基因，肿瘤基因以及疾病相关基因的一种基因治疗手段。 RNAi过程的关键是由双链RNA切割产生21-23nt长的小干涉RNA（siRNA），siRNA可介导对靶mRNA特异性的降解。直接合成siRNA用于哺乳动物细胞，可避免使用长的双链RNA（>30nt）所产生的非特异抗病毒反应。随着制备小干涉RNA的技术进步，RNAi用于抑制病毒感染的研究也取得一定进展，包括脊髓灰质炎病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒以及流感病毒等在内的病毒感染均可被特异性双链RNA抑制其复制和<WP=104>表达。而近来的研究显示，RNAi也可以在转录后水平上抑制HBV的复制和表达。 HepG2.2.15细胞系模拟了一种HBV已经感染并且HBV基因组整合到宿主细胞基因组中的状态，能够再现HBV的复制和表达，是一种用于抗HBV治疗研究的实验工具。应用PCR制备的siRNA表达框架体系（SECs）在此细胞系水平上进行RNAi抗病毒的研究国内外至今未见报道。本实验针对HBV S区、preC/C区设计合成siRNA表达框架体系在HepG2.2.15细胞内转录产生HBV特异性siRNA，观察siRNA在蛋白和核酸水平上对HBV表达和复制的抑制作用，为应用siRNA控制HBV感染提供理论依据。 实验中针对HBV S区、preC/C区设计合成引物进行PCR扩增，测序后根据该序列选择4个靶位点，设计合成siRNA表达框架体系的4对下游引物，PCR扩增后产物纯化并转染HepG2.2.15细胞，转染后不同时间观察该HBV siRNA产生体系的抗病毒效应，并筛选出具有最佳干涉效果的HBV siRNA产生体系，观察不同浓度、转染后不同时间该体系对HBV复制和表达的抑制作用。同时针对与HBV无任何同源性的序列设计产生siRNA表达框架体系，作为随机对照。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBV siRNA产生体系及随机对照对HBV蛋白表达的影响；Western blot 检测siRNA对荧光素酶基因表达的影响；斑点杂交法检测siRNA对HepG2.2.15细胞中HBV DNA水平的影响。所得结果如下： 1、HepG2.2.15细胞病毒抗原分泌规律：HepG2.2.15细胞接种后第1天在培养液上清中即可检测到抗原分泌，随着培养时间延长，病毒抗原分泌量逐渐增加，到接种后第7-8天达到高峰，此后抗原分泌逐渐稳定。 2、HBV S区、preC/C区测序结果：经与Gene Bank中HBV序列进行BLAST比对，HepG2.2.15细胞中的HBV基因序列为ayw1亚型。 3、HBV siRNA产生体系对病毒蛋白表达的特异性抑制作用：与对照组（未加入脂质体仅加入PCR产物的HepG2.2.15细胞）相比，设计合成的4个HBV siRNA产生体系中的3个（SECs-S1，SECs-S2，SECs-C1）使HepG2.2.15细胞培养液中的HBsAg和HBeAg分泌水平不同程度下降，3个体系抑制HBV<WP=105>表达的作用由强至弱为：SECs-S2＞SECs-S1＞SECs-C1。其中靶序列位于HBV基因S区第458-478bp核苷酸序列的体系（SECs-S2）对蛋白表达的抑制作用最明显，在转染后第6天细胞培养上清液中检测不到HBsAg分泌，而对HBeAg分泌的抑制率达64.78%。HBV siRNA产生体系SECs-S1同SECs-S2的抑制作用接近，而SECs-C1的抑制作用低于前二者，转染后第6天对HBsAg和HBeAg分泌的抑制率分别为74.88%和15.20%。以上结果提示，针对HBV S区的siRNA表达框架体系对HBV抗原分泌的抑制作用强于针对HBV preC/C的siRNA表达框架体系的抑制作用。3个HBV siRNA产生体系对HBsAg的抑制作用大于对HBeAg的抑制作用，对HBsAg的抑制率最高可达100%，而对HBeAg的最高抑制率为64.78%。SECs-C2和随机对照SECs-CON对抗原分泌的影响很小甚至没有。根据以上结果选择SECs-S2继续进一步的实验。 4、Western blot检测培养细胞中的荧光素酶表达水平变化：结果显示，各个细胞培养孔之间荧光素酶表达水平相同或接近，提示细胞之间转染效率大致相同，siRNA表达框架体系对HBV基因表达的抑制作用，即HBsAg和HBeAg分泌水平的下降并非来源于转染效率的影响；同单独转染荧光素酶质粒的细胞中荧光素酶表达水平相比，siRNA表达框架体系（SECs-S2、SECs-S1、SECs-C1、SECs-C2以及SECs-CON）对荧光素酶的表达没有影响。 5、SECs-S2剂量相关性抑制作用：在PCR产物0.5-2.0ng/ul的浓度范围内，SECs-S2对HBV基因表达的抑制?
李谨革,贾建新,周永兴,连建奇,贾战生,冯志华,郝从容[10]（2003）在《腺病毒介导核酶对细胞内HBV基因表达的抑制作用》文中研究表明目的观察针对HBV（乙型肝炎病毒）C区双位点核酶在细胞内阻断C区基因表达的作用。方法采用亚克隆技术,从pGEM—Rz123（含针对HBV C区双位点核酶）上切下双位点核酶的片段,定向克隆于腺病毒表达载体pAd-CMV中。利用Lipofectamine2000介导,将重组病毒pAdCMV—Rz及pAdCMV—laz感染2.2.15细胞中,采用打点杂交技术观察核酶的表达,采用ELISA（酶联免疫）、免疫荧光、共聚焦定量、图象分析法、Western blot分析Hbe/HBcAg的表达。结果感染的2.2.15细胞2周后,打点杂交证实可表达针对HBV C区双位点核酶。ELISA方法检测发现核酶抑制HBeAg表达68.6％,用免疫荧光、免疫组化、图象分析法、Western blot分析证实核酶可抑制HBV细胞内表达。结论该双位点核酶通过针对HBV C区基因的剪切作用,阻断C区基因表达,抑制了HBe/HBcAg的表达。
二、双位点核酶抑制细胞内乙型肝炎病毒表达的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、双位点核酶抑制细胞内乙型肝炎病毒表达的研究（论文提纲范文）
（1）优化选择的串联序列amiRNA表达载体抗乙肝病毒的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）HBVC1653T位点突变、A1762T/G1764A双位点突变与肝细胞癌关系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
（3）靶向C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 主要材料和仪器 |
| 1.2 试剂配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 重组质粒的扩增、提取和酶切鉴定 |
| 1.3.2 转染用表达载体的制备 |
| 1.3.3 细胞培养与转染 |
| 1.3.4 酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液中HBsAg和HBeAg的含量 |
| 1.3.5 总RNA的抽提、定量及RT-PCR实验分析HBV C mRNA的水平 |
| 1.3.6 实时荧光定量PCR法检测培养液中HBV DNA的含量 |
| 1.3.7 MTT实验测定核酶对细胞增殖活性的影响 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 重组质粒pEGFP-GS的酶切鉴定结果 |
| 2.2 转染用质粒的浓度和纯度 |
| 2.3 脂质体介导的肝癌细胞转染 |
| 2.4 M1GS RNA核酶对HBSAg和HBeAg表达的抑制作用 |
| 2.5 M1GS RNA核酶对HBV C mRNA表达的影响 |
| 2.6 M1GS RNA核酶对HBV DNA水平的影响 |
| 2.7 核酶对细胞增殖活性的影响 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）外源性microRNA阻断HBV和HBV复制相关的宿主基因表达对HBV复制水平的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩写词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 第一部分 外源性MICRORNA阻断HBV表达对HBV复制水平的影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 细胞株的培养 |
| 2.2 菌种、质粒和DNA 合成 |
| 2.3 引物序列 |
| 2.4 主要试剂与仪器 |
| 2.5 质粒的构建、纯化和转染 |
| 2.6 半定量RT-PCR |
| 2.7 乙肝五项定量的检测 |
| 2.8 HBV-DNA 的荧光定量 PCR 检测 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 靶基因HBV amiRNA 序列的筛选及载体的构建结果 |
| 3.2 重组质粒的构建及鉴定 |
| 3.3 优化转染条件 |
| 3.4 瞬时转染amiRNA-HBV 对HBsAg 和HBeAg 的抑制作用 |
| 3.6 瞬时转染amiRNA-HBV 对HBV DNA 的抑制作用 |
| 3.7 瞬时转染amiRNA-HBV 对HBV mRNA 的抑制作用 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 microRNA 介导的RNA 干扰和外源性amiRNA 干扰技术 |
| 4.2 外源性amiRNA 抑制HBV 靶基因的表达 |
| 4.3 影响RNA 干扰疗效的因素 |
| 5. 小结 |
| 第二部分 外源性MICRORNA 稳定转染HEPG2.2.15 细胞对HBV 复制水平的影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和试剂配制 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 引物序列 |
| 2.4 质粒的构建、纯化 |
| 2.5 确定杀稻瘟菌素的最佳抑制浓度 |
| 2.6 质粒的稳定转染 |
| 2.7 半定量RT-PCR |
| 2.8 乙肝五项定量的检测 |
| 2.9 HBV-DNA 的检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 杀瘟稻霉素浓度的确定及细胞克隆的筛选 |
| 3.2 稳转细胞株的筛选 |
| 3.3 稳定转染AMIRNA-HBV 对HBSAG 和HBEAG 的抑制作用 |
| 3.4 稳定转染AMIRNA-HBV 对HBV DNA 的抑制作用 |
| 3.5 稳定转染AMIRNA-HBV 对HBV MRNA 的抑制作用 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 第三部分 外源性MICRORNA 阻断HBV 复制相关的宿主基因表达对HBV 复制的影响 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要试剂配制 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 引物序列 |
| 2.5 质粒的构建、纯化和转染 |
| 2.6 半定量RT-PCR |
| 2.7 乙肝五项定量的检测 |
| 2.8 HBV-DNA 的检测 |
| 2.9 Western blotting 实验 |
| 2.10 细胞增殖检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 靶基因La amiRNA 和ASGPR1 amiRNA 序列的筛选及载体的构建结果 |
| 3.2 重组质粒的构建及鉴定 |
| 3.3 瞬时转染amiRNA-La 对La mRNA 的抑制作用 |
| 3.4 瞬时转染amiRNA-La 对La 蛋白的抑制作用 |
| 3.5 瞬时转染amiRNA-La 对HBsAg 和HBeAg 的抑制作用 |
| 3.6 瞬时转染amiRNA-La 对HBV DNA 的抑制作用 |
| 3.7 瞬时转染amiRNA-ASGPR1 对ASGPR1 mRNA 的抑制作用 |
| 3.8 瞬时转染amiRNA-ASGPR1 对ASGPR1 蛋白的抑制作用 |
| 3.9 瞬时转染amiRNA-ASGPR1 对HBsAg 和HBeAg 的抑制作用 |
| 3.10 瞬时转染amiRNA-ASGPR1 对HBV DNA 的抑制作用 |
| 3.11 amiRNA-La 和amiRNA-ASGPR1 转染对细胞增殖的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 个人简历 |
| 附录二 致谢 |
| 附录三 慢性乙型肝炎基因治疗的研究进展 |
| 1. 引言 |
| 2.H BV 的基因组特点和感染机制 |
| 2.1 HBV 的基因组特点 |
| 2.2 HBV 感染宿主细胞的机制 |
| 2.3 HBV 复制循环中所需要的肝细胞宿主因素 |
| 2.3.1 La 蛋白(La protein) |
| 2.3.2 肝富集转录因子(liver-enriched transcription factors,LETFs) |
| 3. 反义RNA、核酶与RNAI 等基因治疗技术的比较 |
| 4. 抗HBV 基因治疗的现状 |
| 5. 病毒逃避SIRNA 介导的RNAI 治疗的研究现状及可能的解决办法 |
| 5.1 病毒逃避RNAI 的研究现状 |
| 5.2 针对宿主细胞基因的基因治疗研究 |
| 5.3 MICRORNA 介导的RNAI 可能是一种潜在的解决病毒逃避RNAI 的方法 |
| 6. 展望 |
| 参考文献 |
（6）核酶在抗病毒基因治疗中的设计策略（论文提纲范文）
| 1 设计合成特异的核酶 |
| 1.1 多位点核酶 |
| 1.2 U1嵌合体核酶 |
| 1.3 M1GS核酶 |
| 1.4 HDV反式作用核酶 |
| 2 选择恰当的切割靶点 |
| 2.1 根据结构和功能学研究确定靶位点 |
| 2.2 根据随机RNA库法确定靶位点 |
| 3 选择合适的表达载体 |
| 3.1 逆转录病毒载体 |
| 3.2 腺病毒载体 |
| 4 结 语 |
（7）应用RNAi技术抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验研究 |
| 第一部分 HepG2.2.15细胞的培养及鉴定 |
| 1 实验材料和实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 抗乙型肝炎病毒siRNA重组表达载体的构建 |
| 1 实验材料和实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 siRNA对HBV的抑制作用 |
| 1 实验材料和实验方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表和待发表的文章 |
| 致谢 |
（8）抗乙型肝炎病毒HDV核酶的研究新进展（论文提纲范文）
| 一、靶位点的筛选 |
| 二、导入系统 |
| 三、改善和提高核酶的活力 |
| 四、展望 |
（9）应用RNAi抑制乙型肝炎病毒复制和表达的研究（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 第一篇 绪论 |
| 第一章 RNA干涉及其在抗病毒治疗中的应用研究进展 |
| 第二章 乙型肝炎基因治疗策略的研究进展 |
| 第三章 前言 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 HepG2.2.15细胞培养及序列测定 |
| 第一节 实验材料和实验方法 |
| 一、 实验材料 |
| 二、 实验方法 |
| (一) HepG2.2.15细胞的传代与培养 |
| (二) HepG2.2.15细胞内HBV S区序列测定 |
| (三) HepG2.2.15细胞内HBV preC/C区序列测定 |
| 第二节 结果 |
| 一、 HepG2.2.15细胞培养及病毒抗原分泌规律 |
| 二、 HepG2.2.15细胞内HBV S、preC/C区PCR结果 |
| 三、 酶切结果 |
| 四、 测序结果 |
| 第二章 应用siRNA表达框架体系抑制HBV基因表达 |
| 第一节 实验材料和实验方法 |
| 一、 实验材料 |
| 二、 实验方法 |
| (一) siRNA表达框架体系 |
| (二) PCR产物转染HepG2.2.15细胞 |
| (三) ELISA法检测HBsAg和HBeAg |
| (四) Western Blot检测荧光素酶表达 |
| (五) 斑点杂交检测HBV DNA |
| 第二节 结果 |
| 一、 实验设计 |
| 二、 靶位点选择及作用位点 |
| 三、 siRNA表达框架体系的下游引物设计 |
| 四、 PCR及产物纯化结果 |
| 五、 转染条件的优化 |
| 六、 siRNA抑制HBV基因表达和复制的检测 |
| 七、 siRNA与脱氧核酶的抑制作用比较 |
| 八、 细胞毒检测结果 |
| 第三篇 讨论 |
| 结论 |
| 创新点与意义 |
| 参考文献 |
| 攻读期间发表论文 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 吉林大学博士学位论文原创性声明 |
四、双位点核酶抑制细胞内乙型肝炎病毒表达的研究（论文参考文献）
- [1]优化选择的串联序列amiRNA表达载体抗乙肝病毒的研究[D]. 蒲春文. 大连医科大学, 2011(06)
- [2]HBVC1653T位点突变、A1762T/G1764A双位点突变与肝细胞癌关系的研究[D]. 闪明海. 宁夏医科大学, 2011(05)
- [3]靶向C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的实验研究[D]. 厉海妮. 青岛大学, 2008(07)
- [4]外源性microRNA阻断HBV和HBV复制相关的宿主基因表达对HBV复制水平的影响[D]. 郜玉峰. 安徽医科大学, 2008(05)
- [5]提高核酶催化活性的相关策略[A]. 侯伟,刘克洲,沃健儿. 2005年浙江省感染病、肝病学术会议论文汇编, 2005
- [6]核酶在抗病毒基因治疗中的设计策略[J]. 侯伟,沃健儿,刘克洲. 医学综述, 2005(05)
- [7]应用RNAi技术抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究[D]. 张岩. 第四军医大学, 2005(06)
- [8]抗乙型肝炎病毒HDV核酶的研究新进展[J]. 王传玺,韩金祥,鲁艳芹. 国外医学.病毒学分册, 2005(01)
- [9]应用RNAi抑制乙型肝炎病毒复制和表达的研究[D]. 王玥. 吉林大学, 2004(04)
- [10]腺病毒介导核酶对细胞内HBV基因表达的抑制作用[J]. 李谨革,贾建新,周永兴,连建奇,贾战生,冯志华,郝从容. 实用肝脏病杂志, 2003(01)