一、定量分析铁代谢基因在血浆铜蓝蛋白缺陷小鼠中的表达（论文文献综述）
刘兴媛[1]（2021）在《电针通过长非编码RNA SNHG1调控细胞自噬、糖代谢和铁死亡延缓阿尔茨海默病进展及机制研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是临床常见神经退行性疾病,目前尚缺乏有效预防和治疗手段。大量事实表明表观遗传调控失常与AD的发生发展息息相关,但截至目前,AD发生的分子机制仍未完全阐明,因此,研究AD的发生发展分子机制对改善AD的临床诊疗具有重大意义。目前临床上采用电针治疗AD,取得了一部分临床效果,但电针作用于AD的治疗机制尚不清楚。研究电针对AD的治疗作用,以及影响AD进展的表观遗传调控因素,是增强电针治疗AD效果以及探索AD新治疗手段的必由之路。为联系传统电针治疗和表观遗传调控之间的关系,必须从更高纬度、更保守的水平上寻求分子机制的突破。方法:首先建立大鼠的AD模型,再将合格大鼠称重后随机分为假手术组、模型组与电针组。进行行为指标检测,在Morris水迷宫实验中,定位导航试验记录分析大鼠逃避潜伏期及轨迹,空间探索实验记录大鼠跨越平台期的次数。其次,建立AD细胞模型,进行SNHG1的检测及表型验证,采用实时荧光定量PCR检测SNHG1的表达水平;表型验证包括采用彗星电泳检测DNA损伤,利用CCK8和Edu增殖水平检测检测细胞增殖速率,利用克隆形成实验检测细胞的克隆形成能力。随后进行糖酵解相关指标的检测,指标包括葡萄糖摄取能力、ATP生成、乳酸生成、细胞外酸化（ECAR）以及耗氧量（OCR）等;最后进行铁死亡相关检测,包括铁、MDA和脂质活性氧（ROS）水平的检测。分析互作方面利用mRNA稳定性检测靶基因mRNA半衰期水平,利用RNA免疫共沉淀（RIP实验）检测RNA和蛋白质互作等。各组数据用SPSS22.0软件进行处理。先行正态性检验。符合正态分布者,行方差齐性检验,方差齐者用q检验,方差不齐者用Tamhane’s T2或Dunnett’s T3法;不符合正态分布者采用多个独立样本比较的秩和检验。结果:水迷宫实验发现,AD组大鼠的平均逃避潜伏期和平均游泳距离明显长于对照组;在空间探索实验中,AD组大鼠在目标象限的游泳时间和距离百分比明显低于对照组。在给予高频刺激（HFS）之前,先进行30min的测试刺激,观察基础f EPSP的波幅。结果表明,各组基础f EPSP始终保持稳定,f EPSP波幅无明显差异（P>0.05）;而AD模型组在0min、30min和60min时,f EPSP的波幅与对照组相比明显抑制。在H-SY5Y/Aβ-42神经元模型中,CCK8细胞增殖实验显示AD发生后神经元增殖活性明显降低,EDU活性细胞实验显示AD发生后EDU阳性神经元数量明显减少,集落形成能力也降低,证明AD发生后细胞神经元的增殖活性受到抑制。经过电针治疗后,电针组大鼠的平均逃避潜伏期和平均游泳距离均明显短于AD组,在空间探索实验中,电针组大鼠目标象限游泳时间和距离百分比明显高于AD组,说明电针组大鼠空间记忆能力明显改善和缓解。电针组在给药后0min、30min、60min与AD组相比,f EPSP波幅明显激活。为了探讨lncRNA表达谱在AD进展中的作用,利用H-SY5Y/Aβ-42神经细胞模型比较了AD发生时神经细胞和正常细胞转录产物的差异。结果表明,SNHG1在AD细胞中高表达。随后我们下调了SNHG1的表达,并对敲减前后RNA转录物的KEGG通路进行了分析。结果表明,SNHG1参与细胞的多种生物学过程,包括MAPK途径、药物代谢、糖代谢、氧化应激等。值得注意的是,SNHG1还影响自噬基因的富集。因此,SNHG1对自噬过程的影响是下一步的研究方向。同时,既往研究表明AD发生后正向调节自噬的关键蛋白Beclin1的表达下调。因此,需要研究SNHG1对Beclin1蛋白的影响。使用Starbase生物信息学分析数据库结果表明,RNA结合蛋白IGF2BP2可能同时与SNHG1和Beclin1相互作用,由此推测SNHG1通过IGF2BP2调控下游靶基因Beclin1。随后功能结果表明,AD发生后Beclin1蛋白的表达明显低于对照组,同时SNHG1能抑制Beclin1蛋白和mRNA的表达,此外,敲减SNHG1后,Beclin1 mRNA的稳定性和表达明显增强。双荧光素酶报告基因系统结果表明,SNHG1对Beclin1 mRNA的转录水平没有影响,SNHG1对Beclin1 mRNA的调控主要发生在转录后水平。生物信息学分析表明,RNA结合蛋白IGF2BP2可能同时与SNHG1和Beclin1相互作用。为了验证这一猜想,使用RNA结合蛋白免疫沉淀实验进行了验证。结果表明SNHG1通过与RNA结合蛋白IGF2BP2结合参与Beclin1 mRNA的调控。回复实验结果显示,自噬抑制剂组和SNHG1过表达组大鼠寻找水下平台的平均逃避潜伏期和平均游泳距离均显着高于电针组,说明自噬抑制剂和SNHG1过表达逆转了电针的治疗作用。在空间探索实验中,自噬抑制剂组和SNHG1高表达组大鼠在靶象限游泳的时间和距离百分比均短于电针组,说明自噬抑制剂组和SNHG1高表达组逆转了电针治疗大鼠的空间记忆能力。同时,自噬抑制剂和SNHG1过表达组在HFS刺激后,f EPSP波幅与电针组相比均有明显抑制。q RT-PCR结果显示,AD细胞株SNHG1明显升高。CCK-8检测结果显示,SNHG1敲减可显着增加AD细胞的增殖。此外,SNHG1敲减组EDU阳性细胞百分率明显升高。同时,SNHG1敲减的AD细胞发生了较少的凋亡。彗星电泳实验显示,在AD细胞中,SNHG1敲减组的DNA损伤百分率也低于对照组。敲减SNHG1的AD细胞的葡萄糖摄取、乳酸产生和ATP生成显着减少;细胞外酸化率（ECAR）显着降低,氧耗率（OCR）显着增加。铁死亡是AD发生的重要机制,我们继而探索了SNHG1与铁死亡之间的关系,结果显示,敲减SNHG1可以带来铁死亡相关表型的改变,如MDA水平减少、Iron水平减少、GSH增加等,同时这些效应能够被NRF2敲减所逆转。为了验证SNHG1与NRF2 mRNA的直接相互作用,RIP实验结果表明,与空载体或Ig G相比,AD细胞中的SNHG1 RIP对NRF2 mRNA的表达显着富集。然后确定了SNHG1和NRF2之间的调控关系,发现SNHG1的敲减显着提高了AD细胞中NRF2 mRNA和蛋白的表达。而SNHG1的敲减并没有影响NRF2启动子的荧光素酶活性,表明SNHG1通过转录后方式调节NRF2的表达。为了探讨SNHG1是否影响NRF2 mRNA的降解,用RNA合成抑制剂α-Amanitin处理SNHG1改变的AD细胞,然后测定NRF2 mRNA的衰减情况。结果显示,SNHG1的敲减增加了NRF2 mRNA的半衰期和稳定性。接着进行了Me-RIP分析,发现与Ig G相比,m6A抗体显着富集了NRF2mRNA。另外,还观察到SNHG1的敲减显着增加了AD细胞中NRF2 mRNA的m6A甲基化,提示SNHG1对NRF2 mRNA的m6A修饰有负性调节作用。FTO和ALKBH5是m6A脱甲基转移酶,RIP结果表明,FTO抗体能显着富集SNHG1转录本,同时SNHG1的敲减显着降低了FTO在NRF2 mRNA中的结合,FTO过表达挽救了si-SNHG1诱导的NRF2上调。为进一步证实SNHG1/FTO/NRF2轴在AD中的作用,回复实验结果表明,SNHG1基因被敲减后NRF2蛋白的表达增加,而NRF2的敲减可以部分挽救SNHG1带来的效应。在细胞增殖分析中,NRF2的敲减可以部分挽救敲减SNHG1对AD细胞增殖的上调作用。NRF2的敲减挽救了SNHG1基因敲减引起的葡萄糖摄取和乳酸产生的抑制。ECAR和OCR分析表明,NRF2敲减可以部分恢复SNHG1基因敲减对糖酵解过程的抑制。结论:电针可以调节神经元及突触的lncRNA表达,通过表观遗传途径调控神经元的活性和突触抑制。分子机制方面,SNHG1/IGF2BP2/Beclin1通路通过抑制自噬导致神经元损伤和LTP抑制,同时,SNHG1/FTO/NRF2通路参与了AD细胞铁死亡、有氧糖酵解进程。
董健健[2]（2021）在《应用CRISPR/Cas9技术构建Wilson病小鼠模型及其基因治疗研究》文中研究说明Wilson病（Wilson’s disease,WD）是ATP7B基因突变引起的常染色体隐性遗传的铜代谢障碍疾病。ATP7B基因突变及其功能的失活影响胆汁中的铜排泄,从而诱发体内铜稳态失调,导致肝脑等脏器的病理性损伤。WD中国人群患者中广泛存在8号外显子Arg778Leu和13号外显子Pro992Leu的高频突变,针对这些突变构建动物模型,研究这些动物模型的表型十分必要。CRISPR/Cas9技术是能够高效地同时编辑多个基因的DNA序列,在转基因动物模型构建这一领域已被广泛使用。WD目前的常规疗法是患者终生服用铜螯合剂和锌盐,大部分患者经治疗后可获得较好的效果,但常规治疗方案并不能恢复患者的正常铜代谢,且部分患者会出现严重不良反应。本研究应用CRISPR/Cas9技术,靶向中国WD患者ATP7B基因的常见突变位点Arg778Leu和Pro992Leu以显微注射技术向小鼠单细胞期胚胎注射Cas9 mRNA,最终成功构建了模拟ATP7B基因R778L和P992L点突变的小鼠模型。进一步,我们从生理和病理角度观察了这两种突变小鼠临床表型,验证了它们的表型与WD患者临床症状的契合程度。我们发现:R778L点突变小鼠血清中全铜蓝蛋白水平显着低于野生型小鼠,R778L和P992L小鼠血清中非铜蓝蛋白结合铜,及肝脑组织中铜的含量则显着高于野生型小鼠;同时,这些小鼠呈现肝脏病理性损伤,而R778L小鼠则伴有行为学异常。NLRP3炎性小体在WD小鼠的病理进程中发挥重要作用,抑制NLRP3炎性小体的激活可显着降低WD小鼠中枢神经系统（central nervous system,CNS）中炎症因子的表达水平,并显着减少神经元的病理性损伤,从而有效地改善了该小鼠的行为学异常。我们将编码ATP7B cDNA的腺相关载体注射至已构建的WD小鼠中,评估其铜代谢及疾病进展相关参数。我们发现,AAV9-ATP7B治疗后,WD小鼠的肝功能相关指标基本恢复正常,血清全铜蓝蛋白水平也恢复正常,尿铜排泄减少,且在铜超载情况下的生理性胆汁铜排泄也得以恢复。同时,AAV9-ATP7B治疗可逆转WD小鼠肝、脑组织内的铜沉积,抑制WD小鼠脑内NLRP3炎性小体激活,并显着减少炎症导致的神经元病理性损伤。综上所述,我们利用CRISPR/Cas9技术,精确构建了针对中国人群WD的点突变小鼠动物模型,为WD发病机制及基因治疗研究提供了理想的工具。同时,我们也证实了 NLRP3炎性小体激活诱导的神经炎症反应是WD神经损伤的重要机制。最后,我们也确认了通过腺相关病毒技术过表达ATP7B基因以治疗WD的治疗效果,为针对WD的基因治疗提供了有力的证据和重要的理论基础。
曲晓霞[3]（2021）在《PPARα激动剂通过GPX4激活Nrf2/HO-1信号通路改善APP/PS1小鼠铁死亡》文中研究说明目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）已经成为世界上导致痴呆最常见的原因之一,疾病发病率呈逐年上升。AD的主要病理特征为:患者脑内β淀粉样蛋白（Amyloidβ-peptide,Aβ）的沉积和细胞碎片形成老年斑块;tau蛋白过度磷酸化形成神经元纤维缠结（Neurofibrillary tangles,NFTs）以及大量神经元的死亡。目前对于AD的发病机制的研究尚未完全的明确。近年来,有研究显示,脑内铁增高以及铁代谢调控的紊乱可能在AD发病过程中发挥重要的作用。铁含量的增加可形成大量活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,这些活性氧会损伤包括蛋白质、DNA等在内的细胞大分子物质。铁死亡是在2012年发现的一种新型细胞死亡模式。AD患者脑切片显示,铁在Aβ形成的老年斑及其周围的细胞中分布显着增多,暗示AD患者脑中出现铁的沉积和以及铁稳态的破坏。脑组织中的铁水平在神经系统退行性疾病发病过程中会逐渐升高,这可能会介导细胞铁死亡。因此,靶向降低脑内铁水平,调节氧化应激反应,降低铁死亡有望成为治疗AD的新手段。当机体出现氧化应激反应时,机体会产生谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）等物质启动抗氧化防御机制来防止这种损害。GPX4也被看作是铁死亡的核心组成部分。已有研究表明,在神经退行性疾病中GPX4的缺失可以导致海马神经元与星形胶质细胞减少。而促进GPX4的表达可以显着缓解大鼠帕金森症状。GPX4还能在谷胱甘肽依赖的反应中催化脂质过氧化物的还原,可以防止铁死亡。因此,GPX4可以作为抑制细胞铁死亡的重要靶点,值得我们进一步的研究。过氧化物酶体增殖物激活受体α（Peroxisome proliferators-activated receptorα,PPARα）属于核受体超家族,是一种由配体激活的核转录因子。研究指出,PPARα通过控制钙离子内流,参与编码海马相关蛋白的表达,进而参与突触可塑性的调节。PPARα表达下调可能降低机体的抗氧化和抗炎症反应能力。暗示,PPARα可能是治疗阿尔茨海默病的一个重要靶点。NF-E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是体内抗氧化应激防御系统中最重要的一种转录因子。当机体产生强烈的氧化应激损伤时,Nrf2会细胞质中与Keap1相互分离转移至细胞核内,结合抗氧化反应元件,从而激活抗氧化基因HO-1的表达。激活Nrf2/HO-1信号通路,可以通过调节α-突触核蛋白的积聚、神经炎症和凋亡细胞来消除退行性神经疾病中的细胞毒性。研究拟选用APP/PS1小鼠实验和细胞实验,观察PPARα激动剂对铁死亡的作用及其与Nrf2/HO-1信号通路的关系。研究方法:1、PPARα激动剂改善APP/PS1小鼠脑损伤减轻铁死亡:取WT小鼠和APP/PS1转基因小鼠。实验分组:WT组、WT+PPARα激动剂组、APP/PS1组和APP/PS1+PPARα激动剂组。本研究采用免疫组织化学染色检测各组小鼠脑内Aβ的积聚情况;采用水迷宫实验检测小鼠的认知能力;免疫荧光实验检测Iba-1和BDNF的表达情况;TUNEL法检测了各组神经元的凋亡水平;Western Blot检测凋亡相关的标志物Caspase3、Bcl-2和Bax的表达;ELISA检测IL-1β,TNF-α和IL-6等炎症性细胞因子的表达情况。Western Blot检测FPN1、DMT1、Ferritin等铁调节蛋白的表达情况。2、PPARα激动剂靶向调控GPX4抑制APP/PS1小鼠氧化应激及铁死亡。实验分组:WT组、WT+PPARα激动剂组、APP/PS1组和APP/PS1+PPARα激动剂组。首先应用ROS探针检测细胞内活性氧的表达水平以及代表内源性脂质过氧化产物MDA和4-HNE的含量;其次,检测各组中GPX4的表达;最后应用生信分析、荧光素酶报告和染色质免疫共沉淀等方法检验PPARα是否可以作为上游分子促进GPX4的转录及表达。3、PPARα激动剂通过GPX4激活Nrf2/HO-1信号通路改善铁死亡调控铁摄取。实验分组1:WT组、WT+PPARα激动剂组、APP/PS1组和APP/PS1+PPARα激动剂组;实验分组2:转空载质粒neo的SH-SY5Y细胞为对照组（control组）、过表达APPsw的SH-SY5Y细胞为APP组、APP细胞+PPARα激动剂为PPARα组、APP细胞+PPARα激动剂+GPX4抑制剂为GPX4组。首先采用Western Blot检测野生型小鼠与APP小鼠脑中HO-1、Nrf2、Trx-1的表达水平。其次利用PPARα激动剂和GPX4抑制剂处理不同实验组的细胞,研究其对细胞活力、细胞凋亡、Aβ1-42、ROS的表达情况;检测各组细胞中HO-1、Nrf2、Trx-1及对铁的摄取和与铁代谢的相关蛋白的水平。结果:1、免疫组织化学结果显示,在WT小鼠的大脑中未检测到老年斑,并且在APP/PS1小鼠大脑皮层和海马中发现了大量含有Aβ的老年斑,而GW7647处理可减少小鼠老年斑的大小和数量;与WT小鼠相比,APP/PS1小鼠的逃避潜伏期显着增加,跨平台数目明显减少（P<0.05）。GW7647处理后可以显着缩短APP/PS1小鼠的逃避潜伏期,增加跨越平台的次数（P<0.05）,但是,各组之间的游泳速度没有明显变化;与WT小鼠相比,APP/PS1小鼠的IL-1β,TNF-α和IL-6水平明显升高,Iba-1表达明显升高,海马和大脑皮层神经元的凋亡明显增加,Caspase3和Bax的表达水平明显上调,Bcl-2的水平明显下调,BDNF表达明显降低,FPN1表达显着降低,DMT1和Ferritin的表达显着增加（P<0.05）。经GW7647处理后,可见APP/PS1小鼠IL-1β,TNF-α和IL-6的表达显着下降,Iba-1表达显着降低,海马和大脑皮层神经元的凋亡减少,Caspase3和Bax的表达降低,Bcl-2的表达升高,BDNF表达升高,FPN1表达升高,DMT1和Ferritin的表达降低（P<0.05）。以上结果提示,AD模型小鼠脑内发生了铁代谢异常,这种代谢的异样与AD的发生和发展密切相关。2、与WT小鼠相比,可见APP/PS1小鼠中的ROS表达显着升高,MDA、4-HNE表达显着增加,GPX4表达下调（P<0.05）。但经GW7647处理后,可见ROS表达下降,MDA、4-HNE表达显着减少,GPX4表达升高（P<0.05）。生信分析结果显示,在GPX4启动子上存在PPARα结合序列（PPRE）。根据这段序列构建包含结合位点序列或结合位点突变的荧光素酶报告基因质粒,结果显示,GW7647处理显着增加GPX4-WT荧光素酶活性,而GPX4-MUT在GW7647处理后应该素酶活性无显着变化。GW7647处理显着增加APP/PS1小鼠GPX4启动子PPARα富集水平（P<0.05）。以上结果提示激活PPARα相关蛋白能够显着抑制ROS过量表达和脂质过氧化引起的氧化应激损伤,其机制与PPARα能够结合GPX4启动子调控GPX4转录,促进GPX4的表达有关。3、与WT小鼠相比,APP/PS1小鼠脑组织中的HO-1、Nrf2、Trx-1蛋白的表达降低（P<0.05）。与Neo/SH-SY5Y细胞相比,APPsw/SH-SY5Y细胞活性显着降低,凋亡率显着增加,Aβ1-42的表达水平明显增加,ROS的表达明显增强（P<0.05）,HO-1、Nrf2、Trx-1蛋白表达下降(（P<0.05）,摄铁能力显着增加,Ferritin、DMT1的表达明显升高,FPN1的表达显着下降(（P<0.05）。结论:PPARα激动剂能够Nrf2/HO-1信号通路抑制氧化应激,缓解铁死亡,其作用机制与激活GPX4分子有关相关。
张珂[4]（2020）在《在茶氨酸作用下的铜介导绿茶EGCG氧化的机制研究》文中研究说明绿茶多酚提取物是有美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准的植物性处方药,其含量最高且主要的活性物质为表没食子儿茶素没食子酸酯（（-）-epigallocatechin-3-gallate,EGCG）。EGCG具有多种益于生物体的效应,如抗氧化,预防癌症、心血管疾病,调节糖脂代谢等作用。研究发现,EGCG的作用发挥与其抗氧化或促氧化性相关,这种特性的表达与剂量及生物环境有关。临床上发现,高剂量口服以EGCG为主的绿茶多酚提取物会出现肝毒性,恶心,腹痛等副作用,而这种副作用归咎于EGCG的自氧化作用。EGCG的自氧化会产生超氧阴离子（superoxide anion,·O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）等活性氧（reactive oxygen species,ROS）;而变价金属离子,如铜、铁离子,能够促进EGCG的自氧化,并与H2O2发生芬顿反应（Fenton Reaction）,产生毒性更强的羟基自由基（hydroxyl radicals,·OH-）。EGCG自氧化会转化为醌,随后攻击蛋白质的半胱氨酸残基上的巯基,并与其共价结合形成醌化蛋白（quinoprotein,QP）。铜是人体第三大微量元素,在肝脏中含量最高,是组成多种辅酶的重要组成部分。铜离子具有氧化还原活力,过多的铜离子会对人体造成损伤,引发机体紊乱,因此游离铜含量是被严格控制在细胞需要的水平,即大约平均每个细胞含有远低于一个铜离子。二硫代氨基甲酸酯（dithiocarbamates,DTC）一族的化合物广泛用于农业,工业及医疗领域,因此在人们日常生活中接触此类化合物几率很高。戒酒硫（disulfiram,DSF）及其代谢产物二乙基二硫代氨基甲酸酯（diethyldithiocarbamate,DEDTC）作为其中的代表,具有强大的金属离子络合能力,能够络合铜离子。DSF或DEDTC进入机体能够络合铜离子,从而显着抑制了含铜酶的活力,如铜/锌-超氧歧化酶（Cu/Zn-superoxide dismutase,SOD）,形成铜复合体（Cu（DEDTC）2）。DEDTC具有脂溶性能自由进出细胞膜,因此可作为铜转运体,携带铜于肝脏中富集。本研究发现Cu（DEDTC）2仍具有氧化还原性。EGCG产生自氧化毒性的靶器官是肝脏,当体内具有清除活性氧的SOD被DEDTC削弱,同时在肝脏中富集大量氧化还原铜,会极大地提高了EGCG的毒性。已有研究报道,在EGCG和DEDTC均为药理剂量,同时腹腔注射于小鼠时会造成严重的伤亡现象,其原因是EGCG的氧化得到显着促进,从而毒性增强。本研究则进一步具体去阐释这种损伤的机制:1.DEDTC抑制血中SOD活力,使得EGCG自氧化水平提高,消耗加快,富集于肝中的氧化还原铜促进EGCG氧化消耗;2.增强的EGCG氧化毒性会显着提高肝细胞中炎症与凋亡相关基因及蛋白的表达;3.产生大量醌化蛋白;4.脂质过氧化。茶氨酸（L-theanine,L-T）是茶树（Camellia Sinensis）中特有的也是含量最高的非蛋白质氨基酸,为茶汤滋味提供鲜味。据报道,茶氨酸具有多种有益功能,主要是对大脑的作用,能够镇定舒缓。由于EGCG大量摄入会引发机体氧化逆境,本研究探索在茶氨酸干预下,EGCG的自氧化,及其对生物体的影响。由于茶氨酸能够有效结合铜,因此通过体外实验发现,茶氨酸保护了由铜离子或一种主要含铜的,具有多酚氧化能力的酶,铜蓝蛋白（ceruloplasmin,Cp）,介导的EGCG促氧化、DNA损伤及醌化蛋白形成等;而在动物实验上,采用亚急性毒性剂量的EGCG（55 mg/kg）腹腔注射一天一次,共5次,造成了小鼠转氨酶升高,肝脏p53相关基因上调,氧化逆境产生,DNA损伤以及肝脏醌化蛋白含量显着提高;而作为抗氧化系统的Nrf2相关基因显着上调;保护组采用茶氨酸与EGCG同时腹腔注射于小鼠,上述损伤皆被抑制,甚至有的指标与正常对照组水平相当,而Nrf2基因并没有明显上调,由此推断,茶氨酸抑制了EGCG的自氧化。这些结果证明了茶氨酸能有效保护EGCG的自氧化引起的毒性,对于儿茶素健康功能的安全利用有重要意义。综上所述,铜能够促进EGCG的氧化,增强其氧化毒性。而DEDTC可通过抑制SOD活力,与运载氧化还原性铜进入肝细胞并富集两种效果共同促进EGCG的自氧化,增强其毒性,降低EGCG等儿茶素类化合物的安全使用阈值。茶氨酸是与EGCG共同出自茶树,茶氨酸对铜的络合效应较强,能有效抑制氧化还原铜,以及含铜多酚氧化酶—铜蓝蛋白对EGCG的促进作用,从而提高EGCG为代表的儿茶素类化合物的安全利用阈值。
舒婉婷[5]（2020）在《价态与来源不同的铁对视网膜的影响及机制研究》文中指出目的:视网膜铁超载与年龄相关性黄斑变性等视网膜退行性疾病的发病相关。然而,铁对视网膜产生毒性的机制尚不明确。本课题探讨血清中的铁穿过血视网膜屏障（BRB）进入视网膜的条件;探究视网膜血管内皮细胞（rVEC）表达的铁转运蛋白（Fpn）在铁穿越BRB过程中的作用;通过对小鼠眼部铁质沉着症模型的观察与分析,进一步阐明遗传性铁超载小鼠模型中视网膜病变的发生机制。方法:1.给予野生型（WT）小鼠和视网膜特异性铁调素敲除（RS-Hepc KO）小鼠右旋糖酐铁腹腔注射（IP FeDex）。通过活体视网膜成像观察视网膜形态及自发荧光;通过测定血液与肝脏中的铁评估全身铁含量;通过定量PCR测量铁调控蛋白编码基因与光感受器细胞（PR）特异性基因的m RNA表达水平;通过免疫荧光染色对视网膜中的铁蛋白与白蛋白进行定位。2.通过给予P21的Fpnf/f小鼠与对照组Fpn+/+小鼠尾静脉注射AAV9-Ple261（CLDN5）-icre,建立rVEC与脑血管内皮细胞（bVEC）特异性Fpn敲除小鼠模型。观察2、6和9月龄小鼠视网膜与脑中铁的分布。活体视网膜成像与血清铁定量测定用于模型验证;采集视网膜与脑组织进行免疫荧光染色。3.对WT小鼠玻璃体腔内（IVT）注射Fe2+、Fe3+或生理盐水（saline）,铁死亡抑制素-1（Fer-1）预处理用于探究铁的视网膜毒性是否源于铁死亡。在注射后不同时间点进行活体视网膜成像与光学相干断层扫描;采集视网膜用于定量PCR、蛋白质印迹分析和免疫荧光染色。结果:1.IP FeDex导致WT小鼠和RS-Hepc KO小鼠肝脏、血清、rVECs与RPE中铁含量大幅升高,视网膜神经上皮层（NSR）铁含量无显着改变。青年或老年WT小鼠短期或长期暴露于IP FeDex所致全身铁超载条件下,BRB始终保持完整,视网膜未发生病理改变。2.敲除小鼠r&bVEC中的Fpn导致铁蛋白轻链积聚在r&bVECs。Fpnf/f组血清铁含量比对照组显着降低。3.IVT Fe2+导致WT小鼠NSR氧化应激相关基因表达上调,而IVT Fe3+没有。IVT Fe2+注射后第2天光感受器细胞（PR）外节自发荧光、DNA碎片化,注射后第7天PR死亡、视网膜色素上皮细胞（RPE）出现自发荧光。4.缺乏PR的6周龄rd10突变小鼠在IVT Fe2+后未发生RPE自发荧光。结论:1.高剂量IP FeDex导致铁聚积于BRB,而非NSR。BRB能在通过IP FeDex建立的铁超载模型中保护NSR,而这一能力不依赖于NSR生成的铁调素（Hepc）。2.r&bVEC离腔面表达的Fpn在铁运输至视网膜和脑组织的过程中不可或缺。3.IVT Fe2+引起PR氧化应激反应,导致PR死亡与RPE自发荧光。4.IVT Fe2+引发的WT小鼠RPE自发荧光归因于RPE对受损PR外节的吞噬作用。
马冬雪[6]（2020）在《淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方通过铁调素调控APP水解关键酶增进AD学习记忆的机制研究》文中研究表明阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是老年人常见的一种神经退行性疾病,以进行性认知、学习和记忆功能障碍为主要临床表现。如今,老龄化进程日益加剧,AD发病率逐年上升。AD已成为仅次于心脑血管疾病和恶性肿瘤的重要致死性疾病。AD是一种多病因介导的疾病,其发病机制学说有很多,其中包括以Aβ毒性学说为核心的Tau蛋白异常学说、氧化应激学说、基因突变学说、金属离子代谢紊乱学说等,其中金属离子代谢紊乱学说是目前研究的一个重点。现代药理学对淫羊霍苷、黄芪甲苷、葛根素治疗AD的机制进行了大量的研究。上述研究发现淫羊霍苷、黄芪甲苷、葛根素对脑内神经递质含量、氧化应激水平、炎症反应等方面有影响,但对其改善脑铁超载的关注不足,目前这方面的相关研究也鲜见报道。Aβ是其前体蛋白APP经3种不同分泌酶进行分解代谢产生的,在α、β和γ位使APP发生裂解的蛋白酶分别称之为α、β和γ分泌酶。APP的异常剪切加工、Aβ形成及其从可溶状态到不溶状态的转变是AD发病机制中的关键环节。研究表明,细胞内APP有两种代谢通路:APP的非淀粉样代谢通路主要是α-分泌酶和γ-分泌酶共同剪切,第一步α-分泌酶首先剪切APP细胞外的位点产生具有神经保护作用的s APPα蛋白被释放到细胞外,另一部分留在细胞内的C83碎片,被γ-分泌酶剪切形成P3和AICD（APP intracellular domain）,AICD留在细胞内,而P3是一种有毒物质被释放到细胞外,不产生Aβ;APP的淀粉样代谢通路主要是由β-分泌酶和γ-分泌酶共同剪切APP。先是BACE1位点被β-分泌酶剪切,产生s APPβ蛋白并被释放到细胞外,然后γ-分泌酶的剪切留在细胞内的C99产生Aβ多肽和AICD,此通路中产生Aβ;本课题组前期研究发现淫羊霍苷、黄芪甲苷、葛根素有效组分复方可以有效地减少Aβ的产生,并可以调节铁代谢紊乱。但其病理生理机制并不是十分清楚。本研究旨在通过对铁调素（hepcidin,HAMP）基因沉默的HT22细胞给予淫羊霍苷、黄芪甲苷、葛根素有效组分复方进行干预,探讨淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方是否通过影响APP水解中的关键蛋白,从而影响Aβ的形成。第一部分淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠学习记忆和海马CA3区ADAM10表达的影响目的:探讨淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠学习记忆和海马CA3区ADAM10表达的影响。方法:10月龄雄性APPswe/PS1d E9双转基因模型小鼠30只随机分为复方组、模型组和阳性药去铁斯诺（deferox,DFX）对照组,10月龄的雄性C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组。以黄芪、淫羊藿、葛根有效组分复方给予复方组小鼠灌胃,黄芪甲苷、淫羊藿苷和葛根素的用量分别为80mg·kg-1、120mg·kg-1和80mg·kg-1。正常对照组和模型组小鼠以等量生理盐水灌胃,DFX组以DFX灌胃,剂量为100mg·kg-1,每日一次。用药结束后,采用Morris水迷宫检测各组小鼠学习记忆能力情况,并于水迷宫后取出小鼠的脑组织,应用免疫荧光、Real-time PCR和Western blot检测各组小鼠海马CA3区解聚素金属蛋白酶10（A disintegrin and metalloproteinase 10,ADAM10）的表达情况。结果:水迷宫实验结果显示,与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠的逃避潜伏期、游泳距离和游泳时间均明显延长（P<0.05）,穿越平台区域次数、平台区域停留时间明显缩短（P<0.05）,首次穿越平台的逃避潜伏期明显延长（P<0.05）;与模型组小鼠相比,复方组和DFX组逃避潜伏期、游泳距离和游泳时间明显缩短（P<0.05）,穿越平台区域次数、平台区域停留时间明显增多（P<0.05）,首次穿越平台的逃避潜伏期明显减少;复方组和DFX组相比,逃避潜伏期、游泳距离、游泳时间、跨台次数、穿越平台区域次数、平台区域停留时间和首次穿越平台的逃避潜伏期均无显着差异（P>0.05）。免疫荧光、Real-time PCR和Western blot检测结果均显示:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠海马CA3区ADAM10的表达增高（P<0.05）;与模型组相比,复方组和DFX组小鼠海马CA3区ADAM10的表达降低（P<0.05）;复方组和DFX组相比,ADAM10表达水平无显着差异（P>0.05）。小结:淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可缩短APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠的逃避潜伏期、游泳距离和游泳时间,增多穿越平台区域次数、平台区域停留时间,缩短首次穿越平台的逃避潜伏期,有效改善APPswe/PS1d E9双转基因AD小鼠的学习记忆能力,其机制可能与下调海马CA3区ADAM10 m RNA和蛋白表达有关。第二部分淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠海马CA3区铁调素表达的影响目的:探讨淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠海马CA3区铁调素表达的影响。方法:将30只10月龄的雄性APPswe/PS1d E9双转基因模型小鼠随机分为复方组,模型组和阳性药去铁斯诺（DFX）对照组,10只10月龄的雄性C57BL/6J小鼠作为正常对照组。用药结束后,取出小鼠的脑组织,应用免疫荧光、Real-time PCR和Western blot检测各组小鼠海马CA3区HAMP的表达情况。结果:与正常对照组小鼠相比,模型组小鼠海马CA3区HAMP的表达明显降低（P<0.05）;淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方和DFX灌胃干预后,HAMP表达水平较模型小鼠明显升高（P<0.05）。复方组和DFX组相比,HAMP表达水平无显着差异（P>0.05）。小结:淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可以上调APPswe/PS1d E9双转基因AD模型小鼠海马CA3区HAMP m RNA和蛋白的表达水平,这可能是其提高AD模型小鼠学习记忆的作用机制之一。第三部分淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方通过铁调素对HT22细胞APP水解关键酶的影响目的:探讨淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方通过HAMP对HT22细胞APP水解关键酶的影响方法:将HT22细胞分为:Control组、Aβ组（加入Aβ25-35处理24h）、RNAi组（转染HAMP-siRNA-3）、Aβ+RNAi组（加入Aβ25-35处理24h后转染HAMP-siRNA-3）、Aβ+TCM组（加入Aβ25-35处理24h后中药处理24h）、RNAi+TCM组（转染HAMP-siRNA-3 24h后中药处理24h）、Aβ+RNAi+TCM组（加入Aβ25-35处理24h后转染HAMP-siRNA-3 24h,然后中药处理24h）。应用免疫荧光、Real-time PCR和Western blot法检测ADAM10、解聚素金属蛋白酶17（A disintegrin and metalloproteinase 17,ADAM17）、β淀粉样前体蛋白裂解酶（Beta-site APP cleaving enzyme 1,BACE1）的表达情况。结果:与Control组比较,Aβ组（模型组）、RNAi组和Aβ+RNAi组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均增高（P<0.05）,ADAM10、ADAM17表达均降低（P<0.05）;与Aβ组比较,Aβ+RNAi组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均增高（P<0.05）,ADAM10、ADAM17表达均降低（P<0.05）,Aβ+TCM组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均降低（P<0.05）,ADAM10、ADAM17表达均增高（P<0.05）;与RNAi组比较,Aβ+RNAi组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均增高（P<0.05）,ADAM10、ADAM17表达降低（P<0.05）,RNAi+TCM组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均降低（P<0.05）,ADAM10、ADAM17表达均增高（P<0.05）;与Aβ+RNAi组比较,Aβ+RNAi+TCM组中的BACE1在蛋白和m RNA水平表达均降低（P<0.05）,ADAM10、ADAM17表达均增高（P<0.05）;小结:淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可以通过上调HAMP的表达,促进APP水解关键酶ADAM10和ADAM17的表达,抑制BACE1的表达,从而减少Aβ的生成。结论:淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方可以改善小鼠学习记忆能力,其机制主要通过其上调HAMP的表达,从而促进ADAM10和ADAM17的表达,抑制BACE1的表达实现的。
王鲜[7]（2019）在《铁暴露与认知功能损伤的关联及作用机制研究》文中研究指明铁是人体必需的微量元素之一。适宜浓度的铁在机体内发挥重要的生理作用,包括参与氧的输送和转运、能量代谢、蛋白质的合成等。但是,铁过载则可激活氧化应激,诱发线粒体铁积累、神经元铁代谢紊乱和细胞凋亡等。流行病学研究提示脑铁过量沉积与神经退行性疾病有关联性,包括阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）、帕金森病（Parkinson’s disease,PD）、多发性硬化症等。毒理学研究表明,铁过载可致NMRI小鼠的认知功能受损,并可加重AD模型小鼠（淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）/早老素1（presenilin 1,PS1）小鼠和Tg2576小鼠）的认知功能损害。然而,研究报道铁螯合剂去铁胺（deferoxamine,DFO）不仅对AD模型动物有神经保护作用,而且对AD患者也显现出积极的治疗作用。但是,迄今有关铁的神经毒性的作用机制仍不清楚。基于此,本研究开展了以下三部分研究:首先构建铁长期暴露C57/BL6小鼠模型,用多种行为学实验评价其认知功能,并用多组学技术研究铁长期暴露对C57/BL6小鼠血清代谢谱和肠道微生物谱以及海马组织的蛋白质表达谱的影响。随后,构建不同剂量铁长期处理APP/PS1小鼠模型。为明确经鼻DFO给药对小鼠神经功能的保护作用,构建了高铁（10 mg/L）与DFO长期处理APP/PS1小鼠模型,进行了实验小鼠的认知功能的评估和小鼠海马组织β-淀粉样蛋白（amyloidβ,Aβ）沉积和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）的表达以及海马组织的蛋白质差异表达谱分析,并用Western Blot进一步验证了蛋白质组学结果。最后,在一个城市社区老年人群中探索性研究了尿铁浓度与其认知功能障碍的剂量―反应关系。第一部分多组学研究铁长期暴露致小鼠认知功能损伤的作用机制目的:研究铁长期暴露对C57/BL6小鼠认知功能的影响及作用机制。方法:将30只3月龄雄性C57/BL6小鼠随机分为对照组和铁处理组（15只/组）。对照组给予标准啮齿类动物饲料和饮用水,铁处理组给予标准啮齿类动物饲料及含铁（10 mg/L）饮用水,连续处理实验小鼠6个月。为评价其认知功能、情绪状态和运动协调性,在实验小鼠9月龄时进行新物体识别实验、电跳台实验、水迷宫实验、明暗箱实验、旷场实验和转棒实验。用HE染色诊断实验小鼠海马组织的病理形态学变化。用相关试剂盒测定小鼠海马组织ATP含量。用液相色谱―串联质谱仪（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）检测小鼠血清代谢谱和海马组织的蛋白质表达谱。用Western Blot技术进一步分析了小鼠海马组织涉及突触囊泡循环通路、突触前膜和突触后膜的16个相关蛋白质,以及神经元线粒体电子传递链复合体和线粒体动力学蛋白质共9个蛋白质的表达水平。用Illumina高通量测序技术分析小鼠的肠道微生物谱。结果:新物体识别实验、电跳台实验、水迷宫实验结果一致性表明:铁处理可致C57/BL6小鼠认知功能障碍。铁处理组C57/BL6小鼠海马组织DG区神经元结构异常,出现神经元核浓染病理变化。与对照组相比,铁处理组C57/BL6小鼠海马组织ATP水平降低24%（P<0.05）。两组C57/BL6小鼠的海马组织共检出主要与谷氨酸能突触和突触囊泡循环通路等相关的66个差异表达蛋白质。Western Blot结果表明,与对照组相比,铁处理组C57/BL6小鼠海马组织的突触小体相关蛋白25（synaptosomal-associated protein 25,SNAP25）、囊泡相关膜蛋白2（vesicle-associated membrane protein 2,VAMP2）、SynapsinⅠ、GluA2（AMPA Receptor 2）、NMDAR2A（N-methyl-D-aspartate receptor-2A）、ATP5H（ATP synthase subunit d）表达下调,动力相关蛋白1（dynamin related protein 1,DRP1）表达上调（all P<0.05）。此外,在两组C57/BL6小鼠血清中检出富集在脂代谢、氨基酸代谢等通路的40个差异性代谢物。PCoA（principal coordinates analysis）分析和NMDS（nonmetric multidimensional scaling）分析显示两组C57/BL6小鼠肠道菌群构成有差异性。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能注释揭示在两组C57/BL6小鼠显现出与糖代谢、能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢、神经系统、神经退行性疾病等相关的69条代谢通路的差异性。结论:用10 mg/L铁处理C57/BL6小鼠6个月对其血清中脂类、氨基酸类代谢谱和肠道微生物谱有影响,检出C57/BL6小鼠海马组织的病理形态学改变以及突触和线粒体功能相关蛋白表达变化,并与其认知功能损伤可能存在相关性。第二部分去铁胺对铁长期暴露诱导APP/PS1小鼠认知功能障碍的改善作用目的:研究不同剂量铁长期处理对APP/PS1小鼠认知功能的影响以及DFO对高剂量（10 mg/L）铁诱导APP/PS1小鼠认知功能障碍的改善作用。方法:将50只3月龄雄性APP/PS1小鼠随机分为对照组（饮用水）、低铁组（0.1 mg/L饮用水）、高铁组（10 mg/L饮用水）、高铁+DFO组（10 mg/L饮用水+DFO经鼻给药（24μL/次/只,终浓度:100 mg/mL,3次/周））、DFO组（饮用水+DFO经鼻给药（24μL/次/只,终浓度:100 mg/mL,3次/周））,每组10只小鼠,连续处理6个月。所有实验组小鼠均用标准啮齿类动物饲料喂养。在实验小鼠9月龄时实施新物体识别实验和水迷宫实验旨在评价其认知功能。分别用免疫组化和免疫荧光方法检测小鼠海马区Aβ沉积和GFAP表达水平。用液相色谱―串联质谱仪（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）分析小鼠海马区蛋白质差异表达谱。用Western Blot方法分析小鼠海马组织的突触前、突触后、线粒体电子传递链复合体Ⅰ-Ⅴ的部分亚基、线粒体动力学、APP加工过程、磷酸化Tau蛋白等37个蛋白表达水平。结果:与对照组相比,新物体识别实验和水迷宫实验均提示高铁组APP/PS1小鼠的认知功能损伤加重。水迷宫实验表明DFO经鼻给药可改善APP/PS1小鼠的认知功能,对高铁诱导小鼠认知功能损伤有逆转作用。与对照组相比,高铁组APP/PS1小鼠海马区Aβ沉积增多,但DFO组小鼠海马区Aβ沉积却减少。与对照组相比,高铁组小鼠脑内活化的星形胶质细胞数量增多,但DFO组则减少。与高铁组相比,高铁+DFO组APP/PS1小鼠的脑内活化的星形胶质细胞数量相应减少（all P<0.05）。在低铁组和对照组APP/PS1小鼠的海马区共检出与突触、线粒体功能等相关的差异表达蛋白质50个。但在高铁组和对照组APP/PS1小鼠的海马区共检出与突触、线粒体功能等相关的差异表达蛋白质11个。在DFO组和对照组小鼠的海马区共检出与突触、线粒体功能等相关的差异表达蛋白质62个。在高铁组和高铁+DFO组APP/PS1小鼠的海马区共检出与突触、线粒体功能等相关的差异表达蛋白质52个。Western Blot结果显示:与对照组相比,高铁组APP/PS1小鼠的海马区Syntaxin 1a、NMDAR2A（N-methyl-D-aspartate receptor-2A）、NMDAR2B（N-methyl-D-aspartate receptor-2B）蛋白表达下调;DFO组APP/PS1小鼠的海马区Syntaxin 1a、SynapsinⅠ蛋白表达上调（all P<0.05）。与高铁组相比,高铁+DFO组APP/PS1小鼠的海马区CPLX1（complexin-1）、CPLX2（complexin-2）、Syntaxin 1a蛋白表达上调（all P<0.05）。结论:高铁（10 mg/L）长期暴露加重了APP/PS1小鼠的认知功能损伤和脑内Aβ斑块沉积,并上调GFAP表达水平。但DFO则下调了APP/PS1小鼠脑内GFAP表达水平,并对高铁诱导APP/PS1小鼠的认知功能损伤有改善作用,且伴有海马区突触、线粒体功能相关差异表达蛋白质,由此提示一定剂量DFO（100 mg/mL）对10 mg/L铁诱发APP/PS1小鼠的神经毒性可能有改善作用。第三部分老年人群尿铁浓度与认知功能障碍风险的剂量―反应关系目的:在社区老年人群中探索性研究尿铁浓度与认知功能障碍的剂量―反应关系。方法:在2017年7月20日至2018年10月10日期间,采用分层整群抽样方法招募长期居住深圳市某区的≥60岁社康居民共9411人为研究对象,对其进行健康问卷调查和健康体检,同时采用简易智力状态评估量表（Mini-cog）评价其认知状况,并在其体检日收集研究对象的空腹静脉血和早晨点尿样。血常规和血生化项目均在该区某医院及时完成。用电感耦合等离子体质谱仪检测研究对象尿金属浓度,并用肌酐测定试剂盒测定其尿肌酐浓度。在9411名研究对象中,有7706人提供了满足尿肌酐和金属浓度测定的尿样。在7706人中,有7185人完成了认知功能的评价。当排除癫痫、中风、AD、帕金森病（Parkinson’s disease,PD）、抑郁症、颅内肿瘤患者后,最终7073人纳入本部分研究。为解析尿铁浓度与认知功能障碍的关联性,首先采用多因素非条件logistic回归分析,随后利用限制性立方样条（restricted cubic spline,RCS）分析尿铁浓度与认知功能障碍之间是否存在剂量―反应关系。结果:非条件logistic回归分析提示:在7073人中,当校正尿铜、锌、锰、硒、铝、铅、镉、砷的log转换值后,尿铁log转换值每增加一个单位,其认知功能受损风险增加1.471倍。限制性立方样条（restricted cubic spline,RCS）分析显示:尿铁浓度与认知功能障碍呈线性相关性（非线性检验χ2=0.76,P>0.05）。结论:在本研究人群中,尿铁浓度与认知功能障碍呈现线性剂量―反应关系。
陈雪飘[8]（2019）在《槲皮素通过ROS/ADMA/DDAHⅡ/eNOS/NO通路对抗铁过载诱导的HUVECs损伤》文中研究指明目的:铁是一种人体必需的微量元素,但当铁过载时又可能会对机体造成损害。过量的铁积累于血管常造成血管内皮细胞（VECs）损伤,其所涉及的机制最初被认为与过量产生的活性氧（ROS）有关。非对称二甲基精氨酸（ADMA）是机体内调节NOS-NO系统的重要物质,能通过抑制一氧化氮合酶（NOS）使NO合成减少,从而导致内皮功能失调。ADMA主要由二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶（DDAH）催化降解,而DDAH对ROS极其敏感。铁过载可导致氧化应激增加,而槲皮素（Que）作为黄酮类化合物,具有一定的清除自由基的能力。因此,本文旨在探讨Que是否能通过ROS/ADMA/DDAHⅡ/eNOS/NO途径减轻铁过载所致HUVECs损伤。方法:本文采用终浓度为50μM右旋糖酐铁（Iron）处理细胞48h对HUVECs构建铁过载损伤模型。通过MTS法检测细胞存活率,微板法检测细胞LDH的释放,检测SOD、GSH-Px活性,MDA含量,NO含量,HPLC检测ADMA、DDAHⅡ浓度,Western blotting法检测eNOS、p-eNOS、DDAHⅡ、cleaved-caspase 3蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞内ROS水平、线粒体膜电位（Δψm）,分光光度法检测线粒体通透性转换孔（mPTP）开放程度。同时,加入抗氧化剂Que与Iron共孵育,检测上述指标的变化。另外,设立ADMA竞争性抑制底物L-Arg组,mPTP关闭剂CsA组,及自由基清除剂Eda组,作为阳性对照。结果:1.与Control组相比,HUVECs经50μM Iron处理后,细胞存活率降低、LDH活性增高,细胞凋亡率增多,cleaved-caspase 3蛋白表达增多;2.20μM Que处理HUVECs后,细胞存活率升高、LDH活性减弱,SOD、GSH-PX活性升高,MDA含量降低,DDAHⅡ活性及蛋白表达升高,ADMA浓度降低,NO含量升高,p-eNOS/eNOS蛋白比率升高,ROS水平降低,Δψm趋稳,mPTP开放被抑制,细胞凋亡率减少。其作用效果与L-Arg、CsA及Eda的处理效果相似;3.细胞感染pAD/DDAⅡ-shRNA腺病毒后,Que的上述作用被减弱。结论:槲皮素能减轻铁过载诱导的HUVECs氧化应激损伤和线粒体功能障碍,其作用机制可能与ROS/ADMA/DDAHⅡ/eNOS/NO通路有关。
刘志华[9]（2018）在《Transferrin1与Ferritin介导的代谢通路在膳食铁吸收中拮抗的机制研究》文中指出铁是人体必需的微量元素,在维持生命活动中具有复杂而不可替代的作用。然而,铁缺乏是全球三大“隐形饥饿”之首,全球有数以亿计的人患有缺铁性贫血。相比西方发达国家,我国铁缺乏现象较为严重,影响地区广,涉及人群多。不合理的膳食结构及匮乏的铁营养知识是导致我国居民铁营养不良的主要原因。随着人们生活水平的提高,营养、安全和健康已成为食品开发的主题,研究食品功能成分,开发功能性微量元素补充食品已成为国内外食品研究瞩目的热点。功能性食品的开发需要基础科研为其提供理论支撑和依据,然而铁代谢机制还未完全阐明。例如,在哺乳动物中,存在多条铁吸收的途径,有些组织需要由转铁蛋白（transferrin,Tsf）介导的铁吸收,有些组织需要由铁蛋白（Ferritin）完成铁吸收,不同铁吸收途径存在的意义和关系目前尚不清楚。因此探究铁离子在体内的吸收、转运、铁再循环和储存过程对于更好的调控铁稳态、预防与铁代谢紊乱相关的疾病、开发功能性食品及指导人们合理膳食具有重要的科学意义和应用价值。果蝇作为经典的模式生物,因其遗传背景清楚、基因调控方便、生长周期短等优点,近年来广泛应用于食品营养与健康等领域。本论文主要探究果蝇转铁蛋白Transferrin1（Tsf1）在铁代谢中的功能及由Tsf1和Ferritin分别介导的两条铁吸收途径间的关系。主要研究内容与结果如下:（1）Tsf1在果蝇不同组织的表达丰度。实验结果显示,Tsf1是一个在果蝇幼虫体内广泛表达的蛋白,其中脂肪体（类似于哺乳动物肝脏）和气管是其主要表达部位。（2）Tsf1参与果蝇铁代谢。我们从两方面证实了 Tsf1参与果蝇铁代谢:一方面,我们通过调控膳食铁水平检测Tsf1 mRNA和蛋白水平的变化,发现高铁能够抑制Tsf1表达,低铁诱导Tsf1的表达;另一方面,我们发现Tsf1敲低的果蝇对缺铁敏感,而Tsf1过表达的果蝇对膳食中多铁敏感。通过这两方面,我们基本确定Tsf1是参与果蝇铁代谢的。（3）脂肪体合成的Tsf1参与将铁从中肠运到脂肪体。通过多种实验手段,发现脂肪体基因沉默Tsf1导致中肠铁积累,脂肪体铁缺乏。根据实验结果推断,脂肪体合成的Tsf1参与了将肠系吸收的铁运到脂肪体中来。（4）Tsf1与dZIP13/Ferritin竞争铁。实验发现中肠特异性敲低Tsf1挽救了dZIP1 3/Ferritin敲低造成的发育缺陷,后续实验发现这种挽救是通过提高全身铁含量而实现的。普鲁士蓝染色发现,Tsf1敲低恢复了由dZIP13/Ferritin敲低导致的分泌途径的铁减少。根据实验结果,我们推测中肠合成的Tsf1能够与dZIP13/Ferritin竞争铁。综上,一方面,本论文鉴定了果蝇Tsf1的功能,表明铁代谢在物种之间是保守的,果蝇可以作为一个很好的模型应用于未来的铁元素营养研究中。另一方面,阐述了Tsf1与Ferritin分别介导的两条铁吸收途径之间存在竞争关系。这些发现拓展并完善了我们对铁代谢的认识,为未来功能性食品的开发及铁代谢紊乱相关疾病的治疗提供了重要线索和理论依据。
车天栋[10]（2018）在《猪不同生长发育阶段脾脏转录组差异及物种间比较转录组分析》文中研究指明脾脏在循环系统中的位置和特殊的淋巴结结构,使其成为了一种独特的淋巴器官,不仅是哺乳动物机体内最大的免疫器官,同时也是最大的血液过滤器,对维持机体的免疫稳态、衰老红细胞的回收和铁离子的转运具有重要作用。LncRNAs作为调控网络中的重要一员参与了一系列的生物学过程。目前,缺少关于蛋白编码基因和lncRNAs在脾脏不同生长发育阶段和不同物种中的研究。本研究选取家猪5个不同生长发育时间点和3头成年野猪,及其余9种哺乳动物的脾脏组织为研究对象,对一共39个样本进行链特异性lncRNA测序,通过一系列生物信息学的分析方法,对脾脏功能性转录组和调控性转录组进行研究,主要研究结果如下:（1）在猪不同生长发育阶段的18个样本中,一共鉴定出15,040条lncRNAs,包含了12,967个lncRNAs基因。其中,有6,898条lncRNAs在上述所有样本中共表达,约占生长发育阶段鉴定到的总lncRNAs的45.86%。（2）与蛋白编码基因相比,lncRNAs具有转录本长度更短、外显子数目更少和表达水平更低的特性。（3）在猪不同生长发育阶段的脾脏中,反义链内含子区域与lncRNAs有重叠的蛋白编码基因主要富集在T细胞活化、B细胞的增殖和分化、适应性免疫应答和金属离子的结合等生物学通路上,暗示了lncRNAs的生物学功能可能与其邻近的基因相关。（4）基于猪不同生长发育阶段转录组的表达量数据显示,蛋白编码基因和lncRNA均可以将样本按照不同生长发育时间点区分开。基于样本间表达量的Pearson相关系数显示,样本可以划分为胚胎发育期、哺乳期和性成熟期,且lncRNAs具有更灵敏的时空特异性。通过PSI值对蛋白编码基因外显子的可变剪切潜能进行打分,也可以将样本按照不同生长发育时间点区分开。（5）短时间序列（STEM）研究发现,蛋白编码基因和lncRNAs具有类似的动态表达模式。表达量呈现上升趋势的模块,基因主要富集于先天性免疫应答、适应性免疫应答和T细胞增殖的正调控作用等生物学过程;表达量呈现下降趋势的模块,基因主要富集于细胞分裂、DNA的复制、细胞增殖等生物学过程。（6）共表达网络的结果显示,与时间变量相关的蛋白编码基因和lncRNAs主要富集于适应性免疫应答、B细胞受体信号通路和T细胞的活化等生物学过程。（7）不同生长发育阶段差异表达分析结果显示,血浆铜蓝蛋白前体（ceruloplasmin precursor,CP）基因在所有时间点呈现出差异表达,其具有亚铁氧化酶活性,能将Fe2+氧化为Fe3+,并且不释放氧自由基,还与铁离子的跨膜运输有关,这与脾脏的生物学功能相一致。（8）在十个物种中鉴定得到4,783个1:1的同源蛋白编码基因,其中有2,780个（58.12%）在十个物种脾脏组织中都有表达。同时,在十个物种脾脏组织中一共鉴定到1,407个具有同源关系的lncRNAs。（9）基于十个物种转录组的表达量数据显示,同源蛋白编码基因和同源lncRNAs均可以将样本按照不同物种区分开,且同源lncRNAs的表达模式具有较低的物种保守性。蛋白编码基因同源外显子的可变剪切潜能也可以将样本按照不同物种区分开,且在物种间的保守性较低。（10）既是物种特异性表达,又是表达量受到选择的基因功能富集结果显示,在农业动物中存在与药物反应相关的生物学过程。综上所述,脾脏转录组在猪生长发育过程中展现出了其特定的功能变化,且其生物学功能在不同物种中存在差异,这将为今后的相关研究提供参考,具有重要的理论和实践意义。
二、定量分析铁代谢基因在血浆铜蓝蛋白缺陷小鼠中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、定量分析铁代谢基因在血浆铜蓝蛋白缺陷小鼠中的表达（论文提纲范文）
（1）电针通过长非编码RNA SNHG1调控细胞自噬、糖代谢和铁死亡延缓阿尔茨海默病进展及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 电针通过SNHG1/IGF2BP2/Beclin1 轴改善AD大鼠的认知功能和LTP抑制 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 动物分组、动物模型的建立及处理 |
| 2.3 AD细胞模型的建立 |
| 2.4 SNHG1 的检测 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 细胞增殖和凋亡检测 |
| 2.7 DNA损伤和修复检测 |
| 2.8 Edu增殖水平的检测 |
| 2.9 蛋白检测 |
| 2.10 mRNA稳定性检测 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 AD动物及细胞模型的建立及鉴定 |
| 3.2 电针改善AD大鼠认知功能及LTP抑制作用 |
| 3.3 生物信息学分析表明SNHG1可能通过自噬途径参与AD进展的调控 |
| 3.4 SNHG1/IGF2BP2/Beclin1 抑制AD状态神经元的生物活性 |
| 3.5 SNHG1 促进AD神经元凋亡和DNA损伤 |
| 3.6 回复实验证实电针治疗AD是通过诱导自噬和抑制SNHG1来实现的 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二章 SNHG1 通过FTO/NRF2 轴促进铁死亡和有氧糖酵解导致AD进展 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 AD细胞模型的建立 |
| 2.3 SNHG1 的检测 |
| 2.4 细胞的转染 |
| 2.5 细胞增殖和凋亡检测 |
| 2.6 DNA损伤和修复检测 |
| 2.7 Edu增殖水平的检测 |
| 2.8 铁死亡相关检测 |
| 2.9 蛋白检测 |
| 2.10 mRNA稳定性检测 |
| 2.11 Me-RIP检测NRF2 mRNA的 m6A修饰以及SNHG1 对其的影响 |
| 2.12 RIP实验检测FTO和 SNHG1/NRF2 mRNA存在互作 |
| 2.13 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SNHG1在AD细胞中表达上调,促进细胞死亡和功能损伤 |
| 3.2 SNHG1 基因敲减可抑制AD细胞的有氧糖酵解 |
| 3.3 SNHG1 通过NRF2 途径促进了AD的铁死亡 |
| 3.4 SNHG1与NRF2 mRNA结合促进其稳定性 |
| 3.5 SNHG1 通过与RNA脱甲基转移酶FTO结合下调NRF2 的表达 |
| 3.6 SNHG1/FTO/NRF2 轴促进AD增殖和功能损伤 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 全文总结 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 非编码RNA和外泌体在神经退行性疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）应用CRISPR/Cas9技术构建Wilson病小鼠模型及其基因治疗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 Wilson病 |
| 1.1.1 遗传学 |
| 1.1.2 铜稳态 |
| 1.1.3 发病机制和病理生理 |
| 1.1.4 临床症状和体征 |
| 1.1.5 治疗策略 |
| 1.2 结构性影像学在Wilson病诊断中的应用 |
| 1.3 Wilson病的动物模型 |
| 1.4 CRISPR/Cas9技术在疾病模型构建中的应用 |
| 1.5 本课题的研究思路 |
| 第2章 利用CRISPR/Cas9技术构建ATP7B点突变Wilson病小鼠模型 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验试剂和仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ATP7B基因R778L、P992L质粒的构建与验证 |
| 2.3.2 ATP7B基因R778L、P992L基因编辑胚胎定点整合效率 |
| 2.3.3 R778L、P992L基因编辑F0、F1和F2小鼠鉴定 |
| 2.3.4 R778L、P992L小鼠存在铜转运蛋白表达异常 |
| 2.3.5 R778L、P992L小鼠存在铜代谢异常 |
| 2.3.6 R778L、P992L小鼠存在肝脏铜沉积并伴肝组织病理性损伤 |
| 2.3.7 R778L、P992L小鼠CNS存在铜蓄积并伴行为学异常 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章结论 |
| 第3章 NLRP3炎症小体在WD小鼠神经病理损伤中的作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验试剂和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 NLRP3炎症小体激活与WD |
| 3.3.2 铜诱导小胶质细胞NLRP3炎症小体活化和ASC胞外的释放 |
| 3.3.3 抑制NLRP3的激活可改善铜诱导的神经炎症 |
| 3.3.4 MCC950可抑制铜诱导的小胶质细胞内NLRP3炎症小体的激活 |
| 3.3.5 MCC950可逆转WD小鼠脑内神经元损伤 |
| 3.3.6 MCC950抑制WD小鼠脑内NLRP3炎症小体的活化 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章结论 |
| 第4章 使用腺相关病毒系统基因治疗WD模型小鼠 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验试剂和仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 AAV9载体可在WD小鼠肝脏内有效转录 |
| 4.3.2 AAV9-ATP7B基因治疗可纠正WD小鼠铜代谢异常 |
| 4.3.3 AAV9-ATP7B基因治疗可抑制WD小鼠肝脏铜蓄积和肝损伤 |
| 4.3.4 AAV9-ATP7B基因治疗可逆转WD小鼠脑铜蓄积和行为学异常 |
| 4.3.5 AAV9-ATP7B治疗抑制WD小鼠脑内NLRP3炎症小体激活并改善神经元损伤 |
| 4.3.6 AAV9-ATP7B基因治疗可恢复WD小鼠的生理性铜排泄 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章结论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（3）PPARα激动剂通过GPX4激活Nrf2/HO-1信号通路改善APP/PS1小鼠铁死亡（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 PPARα激动剂改善APP/PS1小鼠脑损伤及对铁死亡的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组 |
| 2.2.2 转基因小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色 |
| 2.2.4 Morris水迷宫实验 |
| 2.2.5 免疫荧光实验 |
| 2.2.6 TUNEL实验 |
| 2.2.7 ELISA实验 |
| 2.2.8 Western blot实验 |
| 2.2.9 铁水平检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 PPARα激动剂减少APP/PS1 小鼠大脑皮层和海马区中Aβ积聚 |
| 3.2 PPARα激动剂改善APP/PS1 小鼠认知功能 |
| 3.3 PPARα激动剂下调APP/PS1 小鼠小胶质细胞中Iba-1 表达 |
| 3.4 PPARα激动剂下调APP/PS1 小鼠炎症因子的表达 |
| 3.5 PPARα激动剂抑制APP/PS1 小鼠神经细胞的凋亡 |
| 3.6 PPARα激动剂抑制APP/PS1 小鼠神经细胞中凋亡蛋白的表达 |
| 3.7 PPARα激动剂促进APP/PS1 小鼠神经营养因子的表达 |
| 3.8 PPARα激动剂改善APP/PS1 小鼠脑铁平衡 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 PPARα激动剂靶向调控GPX4 抑制APP/PS1 小鼠氧化应激 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组 |
| 2.2.2 免疫荧光法 |
| 2.2.3 ROS检测 |
| 2.2.4 MDA检测 |
| 2.2.5 Western Blot法 |
| 2.2.6 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.7 染色质免疫共沉淀 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 PPARα激动剂能够抑制细胞中活性氧的表达 |
| 3.2 PPARα激动剂能够抑制内源性脂质过氧化产物的表达 |
| 3.3 PPARα激动剂促进GPX4 的表达 |
| 3.4 PPARα通过直接结合GPX4启动子促进GPX4 转录 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 PPARα激动剂通过GPX4 激活Nrf2/HO-1信号通路改善铁死亡调控铁摄取 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验分组 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 Wsetern Blot实验 |
| 2.2.4 CCK8 检测细胞活性 |
| 2.2.5 流式细胞术检测 |
| 2.2.6 免疫荧光 |
| 2.2.7 细胞内铁水平检测 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 PPARα激动剂激活Nrf2/HO-1 信号通路 |
| 3.2 GPX4 抑制剂能够抑制APPsw/SH-SY5Y细胞活性 |
| 3.3 GPX4 抑制剂能够促进APPsw/SH-SY5Y的凋亡 |
| 3.4 GPX4 抑制剂能够促进APPsw/SH-SY5Y的中Aβ1-42 的表达 |
| 3.5 GPX4 抑制剂能够促进APPsw/SH-SY5Y的 ROS的表达 |
| 3.6 GPX4 抑制剂能够抑制APPsw/SH-SY5Y的中HO-1、Nrf2、Trx-1 的表达 |
| 3.7 GPX4 抑制剂能够促进APPsw/SH-SY5Y对铁的摄取能力 |
| 3.8 GPX4 抑制剂能够抑制铁平衡 |
| 4 讨论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 铁死亡在疾病中的作用机制与研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）在茶氨酸作用下的铜介导绿茶EGCG氧化的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 铜在生物体中的角色 |
| 1.1.1 铜的生物学功能 |
| 1.1.2 铜的毒性 |
| 1.2 二乙基二硫代氨基甲酸酯(DEDTC)和戒酒硫(DSF) |
| 1.2.1 DEDTC和 DSF简介 |
| 1.2.2 DEDTC和 DSF的作用机制 |
| 1.3 绿茶多酚提取物EGCG |
| 1.3.1 EGCG的自氧化 |
| 1.3.2 EGCG激活自适反应转录因子Nrf2 |
| 1.3.3 EGCG的毒性 |
| 1.3.4 EGCG与其他物质联用 |
| 1.4 茶氨酸 |
| 1.4.1 茶氨酸及其性质简介 |
| 1.4.2 茶氨酸的健康作用 |
| 1.5 研究内容、目的和意义 |
| 1.5.1 研究内容和目的 |
| 1.5.2 研究的意义 |
| 第二章 DEDTC与 EGCG联用致肝损伤机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 动物实验设计 |
| 2.2.3 样品的采集和制备 |
| 2.2.4 相关生物指标检测 |
| 2.2.5 肝脏中基因提取、反转录及表达测定 |
| 2.2.6 蛋白质印迹法(western blot)评估肝脏中蛋白质表达 |
| 2.2.7 EGCG氧化评估 |
| 2.2.8 EGCG含量的测定 |
| 2.2.9 活性氧检测 |
| 2.2.10 EGCG/GAPDH在体外形成醌化蛋白的模型及评估 |
| 2.2.11 检测肝中醌化蛋白水平 |
| 2.2.12 DNA损伤检测 |
| 2.2.13 肝组织中DNA水平检测 |
| 2.2.14 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 EGCG与 DSF联用导致小鼠死亡 |
| 2.3.2 EGCG和 DEDTC联用加剧脂质过氧化和炎症反应 |
| 2.3.3 联用EGCG和 DEDTC导致肝组织DNA损伤及多种凋亡相关蛋白表达 |
| 2.3.4 联用EGCG和 DEDTC诱导肝脏中多种有害基因的转录 |
| 2.3.5 联用EGCG和 DEDTC扰乱肝脏中铜稳态 |
| 2.3.6 体外非酶体系中Cu(DEDTC)2可促进EGCG氧化 |
| 2.3.7 铜离子和Cu(DEDTC)2促EGCG氧化产生醌化蛋白和损伤DNA |
| 2.3.8 DEDTC促进EGCG在血浆及肝组织中氧化消失及肝中醌化蛋白形成 |
| 2.3.9 急性毒性剂量EGCG造成的氧化逆境响应 |
| 2.3.10 DEDTC与不同剂量EGCG联用引发小鼠肝毒性 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 茶氨酸通过抑制铜促进EGCG氧化预防其肝毒性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 动物实验设计 |
| 3.2.3 样品的采集和处理 |
| 3.2.4 生物指标的测定 |
| 3.2.5 肝脏的表达测定 |
| 3.2.6 Western blot评估肝脏中蛋白质表达 |
| 3.2.7 体外实验部分 |
| 3.2.8 肝脏中醌化蛋白检测 |
| 3.2.9 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 体外非酶体系中茶氨酸抑制铜促EGCG氧化效应 |
| 3.3.2 茶氨酸与铜结合效应 |
| 3.3.3 茶氨酸抑制铜促EGCG氧化产生醌化蛋白和损伤DNA |
| 3.3.4 铜蓝蛋白促EGCG氧化效应 |
| 3.3.5 茶氨酸抑制铜蓝蛋白促EGCG氧化效应 |
| 3.3.6 茶氨酸对铜蓝蛋白经典活力不产生影响 |
| 3.3.7 茶氨酸抑制亚急性毒性剂量的EGCG对小鼠产生的相关损伤指标 |
| 3.3.8 茶氨酸抑制EGCG引起的γH2AX和p53 相关基因的上调 |
| 3.3.9 茶氨酸限制EGCG引起的Nrf2 相关基因的上调 |
| 3.3.10 茶氨酸促进Nrf2 相关蛋白表达以对抗EGCG毒性 |
| 3.3.11 茶氨酸对亚急性毒性剂量的EGCG的早期作用 |
| 3.3.12 茶氨酸无法保护由急性毒性剂量EGCG造成的小鼠肝毒性 |
| 3.3.13 茶氨酸保护由剂量逐渐升高的EGCG造成的小鼠死亡 |
| 3.3.14 茶氨酸不妨碍EGCG调控的糖脂代谢相关基因的转录 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论与创新点 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词清单 |
| 作者简介 |
（5）价态与来源不同的铁对视网膜的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 利用右旋糖酐铁建立小鼠全身性铁超载模型并探究其视网膜表型 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 IP FeDex注射4 周未能提高NSR铁含量但引起视网膜血管内铁聚集 |
| 1.3.2 通过IP FeDex使小鼠全身性铁超载7 个月引起NSR铁含量轻度升高、Hepc上调以及视锥蛋白轻度下调 |
| 1.3.3 通过IP FeDex使18 月龄小鼠处于全身性铁超载4 个月引起NSR铁含量轻度升高、Hepc上调但无PR变性 |
| 1.3.4 rVECs中铁的积聚未对BRB完整性造成破坏 |
| 1.3.5 IP FeDex造成的视网膜血管内铁聚集并非NSR所分泌的Hepc所致 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 视网膜血管内皮细胞在血清铁进入视网膜过程中的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 r&bVEC特异性Fpn KO模型的验证 |
| 2.3.2 rVEC特异性Fpn KO导致rVECs铁沉积 |
| 2.3.3 bVEC特异性Fpn KO导致bVECs铁沉积 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 通过眼部铁质沉着症模型探究价态不同的铁对视网膜的毒性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 IVT注射Fe~(2+)而非Fe~(3+)导致全视网膜自发荧光与PR变性 |
| 3.3.2 IVT注射Fe~(2+)所导致的视网膜自发荧光呈剂量依赖性 |
| 3.3.3 IVT注射Fe~(2+)导致PR DNA碎片化、PR外节与RPE自发荧光 |
| 3.3.4 IVT注射Fe~(2+)或Fe~(3+)后,抗氧化基因、铁调控基因以及PR与 RPE特异性基因表达发生改变 |
| 3.3.5 IVT注射Fe~(2+)激活铁死亡信号通路中的组成部分 |
| 3.3.6 PR的存在是Fe~(2+)诱导RPE自发荧光的必要条件 |
| 3.4 结论 |
| 总结 |
| 综述——铁螯合剂治疗视网膜疾病的研究进展 |
| 1.引言 |
| 2.铁调节异常相关的视网膜变性疾病 |
| 2.1 遗传性铁超载 |
| 2.2 AMD |
| 2.3 由铁剂补充引发的铁超载 |
| 2.4 铁质沉着症 |
| 2.5 视网膜下出血 |
| 3.铁螯合剂用于视网膜保护治疗的潜力 |
| 3.1 去铁胺 |
| 3.2 去铁斯若 |
| 3.3 去铁酮 |
| 3.4 Salicylaldehyde isonicotinoyl hydrazine(SIH) |
| 4.展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
（6）淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方通过铁调素调控APP水解关键酶增进AD学习记忆的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对APPswe/PS1d E9 双转基因AD模型小鼠学习记忆和海马CA3区ADAM10 表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方对APPswe/PS1d E9 双转基因AD模型小鼠海马CA3区铁调素表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方通过铁调素对HT22细胞APP水解关键酶的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 脑铁代谢相关蛋白与阿尔茨海默病 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）铁暴露与认知功能损伤的关联及作用机制研究（论文提纲范文）
| 全文缩写词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 多组学研究铁长期暴露致小鼠认知功能损伤的作用机制 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 去铁胺对铁长期暴露诱导APP/PS1小鼠认知功能障碍的改善作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 老年人群尿铁浓度与认知功能障碍风险的剂量―反应关系 |
| 1 研究方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 创新点与局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 (研究生期间工作小结) |
| 致谢 |
（8）槲皮素通过ROS/ADMA/DDAHⅡ/eNOS/NO通路对抗铁过载诱导的HUVECs损伤（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写及全称和中文对照表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 主要材料与试剂 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养 |
| 2.3.2 实验分组与处理 |
| 2.3.3 MTS比色法检测HUVECs细胞存活率 |
| 2.3.4 微量酶标法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性 |
| 2.3.5 Western blotting法检测HUVECs细胞中相关蛋白的表达 |
| 2.3.6 HUVECs细胞中SOD的测定 |
| 2.3.7 HUVECs细胞中GSH-Px的测定 |
| 2.3.8 HUVECs细胞中MDA的测定 |
| 2.3.9 HUVECs细胞中NO的测定 |
| 2.3.10 HUVECs细胞中ADMA含量的测定 |
| 2.3.11 HUVECs细胞中DDAH含量的测定 |
| 2.3.12 HUVECs细胞中活性氧(ROS)的测定 |
| 2.3.13 HUVECs细胞中线粒体膜电位(△Ψm)的测定 |
| 2.3.14 HUVECs细胞中线粒体通透性转换孔(mPTP)开放的测定 |
| 2.3.15 TUNEL法检测HUVECs细胞凋亡 |
| 2.3.16 流式细胞仪检测HUVECs细胞凋亡 |
| 2.4 数据处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 槲皮素最佳处理浓度的确定 |
| 3.2 槲皮素对 HUVECs铁过载损伤后细胞存活率及LDH 活性的影响 |
| 3.3 槲皮素对铁过载HUVECs线粒体中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响 |
| 3.4 槲皮素对铁过载损伤后HUVECs细胞内ROS水平的影响 |
| 3.5 槲皮素对铁过载损伤后HUVECs线粒体膜电位（△Ψm）的影响 |
| 3.6 槲皮素对HUVECs铁过载损伤后mPTP开放的影响 |
| 3.7 槲皮素对铁过载损伤后HUVECs中ADMA/DDAH Ⅱ/eNOS/NO通路的影响 |
| 3.8 槲皮素对铁过载诱导的HUVECs细胞凋亡的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（9）Transferrin1与Ferritin介导的代谢通路在膳食铁吸收中拮抗的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 功能性食品 |
| 1.1.1 功能性食品的定义 |
| 1.1.2 功能性食品的发展 |
| 1.1.3 微量元素与功能性食品 |
| 1.2 膳食铁的来源及铁的强化、补充 |
| 1.2.1 膳食铁的来源 |
| 1.2.2 铁强化 |
| 1.3 铁代谢与人类健康 |
| 1.3.1 铁元素生理功能及缺铁的症状和危害 |
| 1.3.2 与铁代谢异常相关的疾病 |
| 1.3.3 铁代谢研究进展及概况 |
| 1.4 果蝇与食品营养 |
| 1.4.1 果蝇在食品营养研究中的应用 |
| 1.4.2 微量元素与食品营养 |
| 1.4.3 果蝇在微量元素代谢领域内研究概况 |
| 1.5 课题研究的目的及意义 |
| 1.5.1 课题研究的目的 |
| 1.5.2 课题研究的意义 |
| 1.6 研究的主要内容和技术路线 |
| 1.6.1 研究的主要内容 |
| 1.6.2 实验思路及技术路线 |
| 第二章 Tsf1在果蝇不同组织的表达丰度 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试剂与仪器 |
| 2.1.2 果蝇品系 |
| 2.1.3 果蝇玉米培养基 |
| 2.1.4 果蝇总蛋白提取 |
| 2.1.5 Western blot检测蛋白表达量 |
| 2.1.6 果蝇总RNA提取、反转录和半定量RT-PCR |
| 2.1.7 果蝇UAS/GAL4系统 |
| 2.1.8 果蝇显微注射技术 |
| 2.1.9 数据分析与统计 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 Tsf1过表达、基因沉默效果的mRNA水平检测 |
| 2.2.2 Tsf1过表达、基因沉默效果蛋白水平检测 |
| 2.2.3 Tsf1 mRNA和蛋白在果蝇体内的表达丰度 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 Tsf1参与果蝇铁代谢 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 仪器 |
| 3.1.2 食物中金属元素的添加 |
| 3.1.3 果蝇总蛋白提取及Western blot检测蛋白表达情况 |
| 3.1.4 RNA提取及Q-PCR实验 |
| 3.1.5 数据统计与分析 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 Tsf1在果蝇体内有功能 |
| 3.2.2 Tsf1响应膳食铁变化 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 脂肪体Tsf1参与将铁从中肠运到脂肪体 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 仪器 |
| 4.1.2 果蝇品系 |
| 4.1.3 果蝇羽化率的测定 |
| 4.1.4 果蝇内源铁蛋白非变性胶染色检测技术 |
| 4.1.5 ferrozine法测定铁含量 |
| 4.1.6 顺乌头酸酶活性的测定 |
| 4.1.7 Western blot检测蛋白铁含量 |
| 4.1.8 数据统计与分析 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 脂肪体合成的Tsf1具有重要生理功能 |
| 4.2.2 脂肪体敲低Tsf1对中肠和脂肪体铁含量的影响 |
| 4.2.3 脂肪体敲低Tsf1对中肠和脂肪体顺乌头酸酶活性的影响 |
| 4.2.4 脂肪体敲低Tsf1对分泌途径铁含量的影响 |
| 4.2.5 脂肪体敲低Tsf1对中肠和脂肪体Ferritin mRNA和蛋白的影响 |
| 4.2.6 脂肪体合成的Tsf1可分泌到血淋巴及中肠表面 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 Tsf1在中肠与dZIP13/Ferritin竞争铁 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 果蝇品系 |
| 5.1.2 果蝇三龄幼虫中肠的解剖 |
| 5.1.3 中肠普鲁士蓝染铁 |
| 5.1.4 果蝇组织铁含量的测定-基于ferrozine显色的试验方法 |
| 5.1.5 果蝇寿命曲线的测定 |
| 5.1.6 数据统计与分析 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 中肠合成的Tsf1可分泌到血淋巴及其他组织 |
| 5.2.2 中肠敲低Tsf1对果蝇寿命的影响 |
| 5.2.3 中肠Tsf1敲低挽救了dZIP13/Ferritin敲低所致羽化率下降的表型 |
| 5.2.4 中肠Tsf1敲低通过升高全身铁含量挽救dZIP13和Ferritin敲低 |
| 5.2.5 中肠Tsf1敲低恢复了dZIP13和Ferritin敲低导致的分泌途径中的铁减少 |
| 5.2.6 中肠敲低Tsf1对Ferritin蛋白及mRNA表达的影响 |
| 5.2.7 Tsf1敲低对Ferritin敲低的挽救具有组织特异性 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 博士学位期间的学术活动及成果情况 |
| 参考文献 |
（10）猪不同生长发育阶段脾脏转录组差异及物种间比较转录组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 高频词汇对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物脾脏组织概况 |
| 1.1.1 脾脏组织先天性免疫反应的分子机制 |
| 1.1.2 脾脏组织适应性免疫反应的分子机制 |
| 1.1.3 脾脏组织与滤血功能 |
| 1.2 LncRNA的研究进展 |
| 1.2.1 LncRNA与生长发育 |
| 1.2.2 LncRNA与物种间的比较转录组研究 |
| 第二章 选题背景与目的意义 |
| 2.1 本研究的选题背景 |
| 2.2 研究的主要内容 |
| 2.3 研究的目的与意义 |
| 第三章 材料与方法 |
| 3.1 试验设计和动物样本采集 |
| 3.1.1 猪不同生长发育阶段脾脏样本的采集 |
| 3.1.2 不同物种脾脏样本的采集 |
| 3.2 试验仪器和主要试剂 |
| 3.2.1 主要仪器设备 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 总RNA的抽提 |
| 3.3.2 总RNA的质检 |
| 3.3.3 LncRNA测序文库的构建 |
| 3.4 数据分析方法 |
| 3.4.1 原始数据的过滤与参考基因组的比对 |
| 3.4.2 LncRNA的鉴定 |
| 3.4.3 物种间同源蛋白编码基因的鉴定 |
| 3.4.4 物种间同源lncRNA的鉴定 |
| 3.4.5 定量分析 |
| 3.4.6 LncRNA的分类 |
| 3.4.7 基于表达谱的分析 |
| 3.4.8 利用香农熵筛选特异性表达的蛋白编码基因和lncRNA |
| 3.4.9 短时间序列(STEM)分析 |
| 3.4.10 差异表达分析 |
| 3.4.11 共表达网络分析 |
| 3.4.12 基于表达量的受选择分析 |
| 3.4.13 外显子可变剪切潜能的预测 |
| 3.4.14 基因功能富集分析 |
| 第四章 结果与分析 |
| 4.1 测序数据概况与比对结果 |
| 4.2 猪不同生长发育阶段蛋白编码基因和lncRNA分析 |
| 4.2.1 猪脾脏lncRNA的鉴定 |
| 4.2.2 LncRNA的基因组特征及其分类 |
| 4.2.3 蛋白编码基因和lncRNA的表达谱分析 |
| 4.2.4 基因动态表达模式的鉴定 |
| 4.2.5 共表达网络分析 |
| 4.2.6 蛋白编码基因和lncRNA的差异表达分析 |
| 4.2.7 蛋白编码基因外显子的可变剪切潜能预测 |
| 4.3 不同物种蛋白编码基因和lncRNA分析 |
| 4.3.1 物种间同源蛋白编码基因的鉴定及表达谱分析 |
| 4.3.2 物种特异性表达同源基因的筛选 |
| 4.3.3 基于表达量受选择分析 |
| 4.3.4 物种间同源lncRNA的鉴定及表达谱分析 |
| 4.3.5 同源蛋白编码基因外显子可变剪切潜能预测 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 LncRNA鉴定方法的可靠性 |
| 5.2 同源蛋白编码基因和同源lncRNA鉴定的可靠性 |
| 5.2.1 同源蛋白编码基因鉴定方法的可靠性 |
| 5.2.2 同源lncRNA鉴定方法的可靠性 |
| 5.3 猪生长发育过程中脾脏转录组的变化 |
| 5.3.1 蛋白编码基因水平的变化 |
| 5.3.2 LncRNA水平的变化 |
| 5.4 不同物种脾脏转录组特征与功能的关系 |
| 第六章 结论与创新 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
四、定量分析铁代谢基因在血浆铜蓝蛋白缺陷小鼠中的表达（论文参考文献）
- [1]电针通过长非编码RNA SNHG1调控细胞自噬、糖代谢和铁死亡延缓阿尔茨海默病进展及机制研究[D]. 刘兴媛. 南昌大学, 2021(01)
- [2]应用CRISPR/Cas9技术构建Wilson病小鼠模型及其基因治疗研究[D]. 董健健. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [3]PPARα激动剂通过GPX4激活Nrf2/HO-1信号通路改善APP/PS1小鼠铁死亡[D]. 曲晓霞. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]在茶氨酸作用下的铜介导绿茶EGCG氧化的机制研究[D]. 张珂. 安徽农业大学, 2020(03)
- [5]价态与来源不同的铁对视网膜的影响及机制研究[D]. 舒婉婷. 上海交通大学, 2020(01)
- [6]淫羊藿、黄芪、葛根有效组分复方通过铁调素调控APP水解关键酶增进AD学习记忆的机制研究[D]. 马冬雪. 承德医学院, 2020(02)
- [7]铁暴露与认知功能损伤的关联及作用机制研究[D]. 王鲜. 华中科技大学, 2019(01)
- [8]槲皮素通过ROS/ADMA/DDAHⅡ/eNOS/NO通路对抗铁过载诱导的HUVECs损伤[D]. 陈雪飘. 南昌大学, 2019(01)
- [9]Transferrin1与Ferritin介导的代谢通路在膳食铁吸收中拮抗的机制研究[D]. 刘志华. 合肥工业大学, 2018(01)
- [10]猪不同生长发育阶段脾脏转录组差异及物种间比较转录组分析[D]. 车天栋. 四川农业大学, 2018(02)