一、猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用（论文文献综述）
孙兰[1]（2020）在《H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用》文中进行了进一步梳理H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）自首次分离至今,已在全世界各地造成了广泛的传播。在国内,H9N2亚型AIV呈地方性流行且传播范围广,不但给养殖业造成巨大的经济损失,也给公共卫生安全造成潜在的威胁。在免疫压力和抗原漂移作用下,AIV容易发生抗原变异,最终导致免疫失败。因此研发针对H9N2亚型AIV较为理想的单抗对H9亚型AIV监测和诊断有重要的意义。1.H9N2亚型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表达选取 H9N2 AIV 流行株 A/Chicken/Taixing/10/2010（简称 rTX）和疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98（简称F98）作为研究对象,通过PCR分别扩增其HA基因和NP基因,将其克隆到真核表达载体PCAGGS上,成功构建出重组质粒PCAGGS-rTX-HA、PCAGGS-F98-HA 和 PCAGGS-rTX-NP。然后将其转染入 293T 细胞,通过间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）和蛋白印迹试验（Western blot,WB）检测确定HA和NP蛋白均在体外正确表达,成功制备出用于制备单克隆抗体的免疫原。此外,通过将PCAGGS-rTX-NP进行双酶切获得的NP片段连接pET-32a上,构建原核重组质粒pET32a-rTX-NP,利用Roestta（DE3）进行优化表达,获得分子量约为73 KD的可溶性rNP,以作为下一步制备针对rTX毒株NP蛋白单克隆抗体的筛选原。2.H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用将重组质粒PCAGGS-rTX-HA和PCAGGS-F98-HA通过肌肉注射结合基因导入仪刺激的方式免疫6-8周龄BALB/c小鼠,三免后腹腔注射灭活病毒进行加强免疫,3天后取其脾细胞制备杂交瘤细胞。通过血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）试验和IFA对融合孔进行筛选,经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,其中有4株为针对rTX HA蛋白的单抗,分别命名为1B9、1C10、3E2和2D6;有2株为针对F98 HA蛋白的单抗,分别命名为1B2和1F10。抗体亚类鉴定结果显示,1B9、1C10和3E2的亚类均为IgM,2D6的亚类为IgG2a,1B2和1F10的亚类为IgG1;6株单抗腹水HI效价较高,均在210-215之间;IFA检测结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98产生特异性荧光,其余的单抗对毒株rTX产生特异性荧光;Western-blot试验结果显示,单抗1B2和1F10对毒株F98有特异性反应,其余的单抗都对毒株rTX有特异性反应,条带大小均为75KD;中和试验结果显示,单抗2D6、1B2和1F10都具有中和特性,其中1F10的中和效价最高;单抗特异性和广谱性鉴定结果显示,6株抗HA蛋白单抗只与H9亚型AIV有反应,而与其他亚型AIV和NDV无反应性,表明具有良好的特异性,其中有4株单抗对H9N2 AIV的反应谱较好;6株单抗对2017-2019年实验室分离株HI和IFA检测结果显示,有37.1%（10/27）的H9N2 AIV分离株与4株抗Y280-like代表株HA蛋白的单抗所识别的表位存在抗原差异性,有22.26%（6/27）的H9N2 AIV分离株获得了与抗F98毒株HA蛋白单抗识别表位类似的抗原位点。因此,这些单抗可用于流行株的抗原差异性分析,且近3年的流行株已发生了较大的抗原变异。3.H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备和鉴定将重组质粒PCAGGS-rTX-NP免疫小鼠进行单克隆抗体的制备。细胞融合10 d后,通过酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）和EFA筛选阳性杂交瘤细胞。经过3次亚克隆后最终获得6株单克隆抗体,分别命名为1B4、1E50、2E10、3A9、8F10和3E6。抗体亚类鉴定结果显示,2E10、3A9和1B4的亚类均为IgG2a,1E50的亚类为IgG1,3E6和8F10的亚类为IgM;采用ELISA试验对单抗腹水效价进行检测,效价在1:25600-1:204800之间;IFA试验结果表明6株单抗中只有3E6和8F10与rTX毒株有特异性的荧光反应;特异性试验结果表明单抗3E6、8F10、2E10和1B4这4株单抗不与NDV和IBV发生反应,具有良好的的特异性,单抗3A9和1E50的特异性不佳;广谱性鉴定结果表明单抗3E6、8F10和2E10的广谱性较好,除了不与H5N1亚型发生反应,与H9N2、H5N6和H7亚型的AIV都有很好的反应,而单抗1B4、3A9和1E50广谱性较差,只与部分H9N2亚型AIV和毒株W1-8（H7亚型）反应。综上所述,单抗3E6、8F10和2E10综合特性较好,在AIV流行病学调查等方面有一定的应用价值。
张鹏[2]（2016）在《禽源H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白特异性单克隆抗体的制备》文中研究指明猪流感（Swine Influenza,SI）是由正粘病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒（Swine Influenza virus,SIV）引起的一种猪的高度接触的急性传染性呼吸道疾病。目前为止已发现的SIV有H1N1、H1N2、H1N7、H2N3、H3N1、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1及H9N2等多种亚型,禽源H1N1亚型猪流感病毒在我国猪群中流行的各亚型猪流感病毒中占有重要地位。本研究首先以禽源H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2014（H1N1）（简称SH1）为试验材料,接种MDCK细胞,培养72h内,待出现细胞病变后收集细胞上清。用蔗糖梯度离心的方法,纯化病毒。进行间接ELISA方法的建立,用于针对禽源H1N1亚型猪流感病毒抗体的检测及筛选阳性杂交瘤细胞。研究表明,抗原包被浓度为5.725μg/ml,4℃过夜;阴、阳性血清作1:200稀释;样品最佳反应作用条件为37℃,1h;酶标二抗最佳反应作用条件也为37℃,1h。该方法与H3N2亚型猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒等重要猪病原的阳性血清不发生交叉反应。因此,本研究建立的禽源H1N1亚型猪流感病毒间接ELISA抗体检测方法具有特异性好、操作简便、快捷、结果准确等特点。用4%甲醛对纯化后的病毒进行灭活,与弗氏佐剂混合乳化后皮下多点注射,免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠,每只小鼠100μg。之后每隔两个周免疫一次,免疫剂量相同。二次免疫后,眼球采血,用ELISA方法测其血清抗体效价。选择抗体效价高的小鼠,加强免疫后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,制备杂交瘤细胞。用HI和ELISA方法对杂交瘤细胞上清进行检测,筛选出阳性细胞孔,再用有限稀释法对阳性细胞株进行亚克隆培养,最后获得2株H1亚型特异性的杂交瘤细胞株:1D9、3C7。经鉴定两株单克隆抗体均能与H1N1亚型猪流感病毒发生特异性反应,且与其他亚型猪流感病毒和其他猪病病原不反应,其中3C7为针对HA蛋白的特异性单抗,为下一步建立H1N1亚型猪流感的诊断方法提供了物质保障。
魏东[3]（2013）在《p38MAPK在H9N2-SIV诱导小鼠急性肺损伤中的作用》文中认为急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）是由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性加重的呼吸困难、难治性低氧血症和肺水肿，病情严重时发展为急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS），重症者出现死亡。ALI是流感病毒感染哺乳动物的主要症状之一，其确切发病机理目前仍不很清楚，近期的研究表明，流感病毒引起的ALI可导致多器官的损害，近年来对其发病机理的研究主要集中在细胞因子和炎症介质的作用上。p38MAPK与炎症反应的调控密切相关，离体研究显示其参与调节多种炎性因子的表达。有资料显示，p38MAPK在肺损伤过程中发挥了重要的调控作用。研究发现，流感的历次大流行都与猪有关，猪流感病毒在人类流感的流行与病毒变异过程中较禽流感病毒具有更密切的关系。但有关p38MAPK在H9N2亚型猪流感病毒（H9N2-SIV）感染小鼠引起ALI的研究还末见相关报道。为了对p38MAPK在H9N2-SIV诱导小鼠ALI中作用进行研究，我们以6-8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠为研究对象，利用本课题组分离的A/swine/HeBei/012/2008（H9N2）（H9N2-SIV），采用鸡胚尿囊腔接种法扩增病毒，经鼻腔滴鼻接种小鼠，以各组小鼠的临床症状、肺病理组织学变化、肺水肿的变化、支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎性细胞的变化和血流动力学的变化等作为标准，建立H9N2-SIV诱导小鼠ALI模型，同时设立p38MAPK的特异性抑制剂SB203580处理组（SB组），选择小鼠ALI过程的不同时期进行测定，采用的主要方法：①观察小鼠的临床症状，统计小鼠死亡率，定时称量活鼠的体质量和采食量，测定小鼠肺系数、肺W/D、支气管肺泡灌洗液中炎性细胞的变化和血流动力学的变化；②建立H9N2-SIV感染小鼠的ALI模型；③应用HE染色技术、免疫组织化学技术和透射电镜技术动态观察肺脏的病理变化；④应用酶联免疫法测定炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）的表达调控；⑤应用免疫组织化学技术和免疫印迹（Western-blot）技术测定磷酸化p38MAPK在肺组织中的分布及表达。测定结果显示：①感染组小鼠在感染病毒后2-3d开始发病，早期表现为背毛粗糙无光泽、活动减少、爱扎堆、精神沉郁、反应迟钝、食欲减退、眼睛缩小或紧闭、眼周围有分泌物；后期出现呼吸急促、被毛逆立、缩头弓背、拒食、消瘦等临床症状，蜷缩于鼠笼一隅，跑动缓慢或蹒跚样行走，个别小鼠出现明显的神经症状，死亡率达60%，体质量出现先降后升的趋势，小鼠出现严重肺水肿。从第8d开始症状逐渐减轻，14d后基本恢复正常。与对照组比较，感染组小鼠动脉血中氧分压从第2d开始降低，第4d出现明显的差异（P＜0.01），第6d最低时仅为（6.79±1.27）kPa，呈现严重的低氧血症，同时，二氧化碳分压显着上升（P＜0.05）；BALF内炎性细胞在感染后第4-8d显着增加，尤其以肺泡巨噬细胞和多核型白细胞增加最为明显（P＜0.01）。SB组小鼠体征表现比感染组减轻，比对照组加重，介于感染组和对照组之间。②病理组织学观察，感染组小鼠肺泡腔内有以嗜中性细胞为主的炎性细胞、红细胞和大量的粉红色的蛋白渗出物和水肿液，肺泡腔变小，肺泡壁增厚，肺泡间质不同程度增宽，细支气管和小血管周围间质水肿、疏松，可见中等量淋巴细胞和单核细胞浸润，支气管部分黏膜上皮细胞坏死，脱落；SB组血管及支气管壁周围稍有增厚、水肿，肺泡大小形态稍不规则，损伤程度亦明显小于病毒组。③感染组和SB组在各时间点肺组织匀浆中的TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10浓度均显着高于对照组（P<0.05）。感染组的TNF-α和IL-1β在损伤后第2d急剧升高，第4d达到高峰后开始下降，至14d后趋于正常；IL-6及IL-10于损伤后第2d开始升高，至第6d达到高峰，第8d虽然有所下降，但下降幅度不大，到14d仍高于正常对照组；SB组各时间点细胞因子水平较感染组降低，但仍高于对照组。④免疫组织化学测定，对照组小鼠肺组织基本正常，仅仅在肺泡隔上皮细胞和气道上皮细胞有极少量的磷酸化p38MAPK阳性表达。感染组磷酸化p38MAPK阳性表达增多，特别是肺泡隔中的上皮细胞几乎全部呈阳性，肺泡管结节状膨大部的肌样细胞同样呈阳性反应。同时磷酸化p38MAPK阳性表达还广泛分布于气道上皮细胞、血管内皮细胞、浸润炎性细胞的胞浆和胞核中，在浸润炎性细胞中表达量也较高；SB组相对于感染组磷酸化p38MAPK阳性表达明显减少，仅见肺泡隔中上皮细胞的胞浆有少量阳性表达，可见肺泡隔内的毛细血管内皮细胞阳性表达消失，至14d磷酸化p38MAPK阳性表达量基本恢复至对照组。⑤经Western-blot法检测，在H9N2-SIV感染小鼠的不同时间点，对照组小鼠肺脏有浅淡的磷酸化p38MAPK蛋白条带表达，但在对照组中任何观察时间点都未发现有统计学意义的变化。感染组小鼠磷酸化p38MAPK蛋白在感染后第2d，表达即明显增强，和对照组比较，差异有显着性（P<0.05）；至第6d蛋白表达达高峰，差异有极显着性（P<0.01），第8d磷酸化p38MAPK蛋白表达有所下降；到14d仍高于对照组。SB组小鼠肺脏在各时间点磷酸化p38MAPK蛋白表达均明显低于感染组，但仍高于对照组。通过对H9N2-SIV诱导小鼠ALI的研究，我们得出如下结论：本课题组分离的A/swine/HeBei/012/2008（H9N2）能够感染BALB/c小鼠，肺脏是其侵害的主要靶器官，引起小鼠的ALI，BALB/c小鼠可以作为流感病毒感染哺乳动物相关研究的良好模型动物；在ALI的病程中TNF-α、IL-1β起致炎因子的作用；IL-6在本试验中可能发挥抗炎作用，IL-10起抗炎因子的作用并在ALI的转归过程中发挥重要作用；p38MAPK能够被H9N2-SIV激活并介导ALI，p38MAPK参与了H9N2-SIV诱导小鼠ALI的发生和发展过程；p38MAPK特异性抑制剂SB203580可以下调磷酸化p38MAPK的表达水平，降低炎症因子的表达，减轻ALI中肺组织的病理损伤。
杨康[4]（2011）在《猪流感噬菌体单链抗体库的构建、筛选及基因表达》文中进行了进一步梳理猪流感（swine influenza, SI）是猪流感病毒（swine influenza virus, SIV）引起的一种在世界范围内分布的呼吸道疾病,可对感染畜群造成重大的经济损失,而且它还会与其它呼吸道疾病混合感染,损失更无法估量。猪还可以感染禽流感和人流感,被认为是新流感病毒的中间宿主,具有混合器作用,因此猪流感除了其重要的兽医卫生学意义外,更重要的还在于其显而易见的公共卫生学意义。目前控制这类传染病的主要措施还是免疫接种,但在畜禽传染病日益严重的今天,由于种种原因如母源抗体的干扰、病毒亚型较多且相互之间无交叉反应等,常规防疫措施有时无能为力。因此,我们可以另辟蹊径从抗病育种方面探索新的防病措施。本研究以猪流感病毒的经典亚型H1N1为对象开展研究,通过噬菌体抗体库技术筛选到抗H1N1猪流感病毒的单链抗体,同时也会得到该单链抗体菌株的基因型,为抗猪流感转基因猪的研究奠定基础。试验Ⅰ H1N1猪流感病毒的培养及培养条件的优化。利用MDCK细胞进行H1N1猪流感病毒的培养,首先通过对比MDCK细胞在不同接种量及血清浓度下的生长情况,优化MDCK细胞的培养；通过免疫荧光染色观察H1N1猪流感病毒的感染MDCK细胞状态,再通过红细胞凝血试验,对比病毒在不同血清浓度、TPCK胰酶浓度及培养时间下的血凝效价,找出H1N1猪流感病毒培养的最佳血清浓度、TPCK胰酶浓度及培养时间。结果发现：6孔板细胞接种量为5×105,培养48h可以用于免疫荧光和真核转染试验。MDCK细胞培养的最佳血清浓度为10%；H1N1猪流感病毒培养的最佳血清浓度为0%,最佳TPCK胰酶浓度为1.5μg/mL,最佳培养时间为72h。试验Ⅱ猪流感单链噬菌体抗体库的构建与筛选。H1N1猪流感病毒滴鼻免疫BALB/C小鼠,免疫效价达到要求后,提取小鼠脾总RNA,反转录合成cDNA第一条链,PCR扩增出重链可变区VH和轻链可变区VL,再经过SOE-PCR,通过柔性多肽Linker接头（Gly4Ser）3按VH-Linker-VL方式将VH基因和VL基因拼接成scFv基因片段。将scFv基因和pCANTAB5E载体分别双酶切（sfi Ⅰ/Not Ⅰ）后连接,转化宿主菌TGl,经过辅助噬菌体M13K07拯救,构建噬菌体单链抗体库。以猪流感病毒为抗原包被96孔酶标板,经过3轮的亲和富集筛选,通过Phage-ELISA鉴定阳性重组抗体。成功构建出库容约为4×106cfu/mL抗猪流感的单链抗体库,并筛选出4株特异性抗猪流感的单链抗体,其中1株WJY001与H1N1猪流感病毒结合反应的特异性较高。试验Ⅲ WJY001噬菌体单链抗体的鉴定。PCR及序列分析,鉴定WJY001株scFv片段大小及基因序列是否正确。然后再通过阻断ELISA、夹心ELISA鉴定WJY001株噬菌体抗体是否能够与鼠源阳性多抗进行竞争结合猪流感病毒。最后通过真核转染、病毒阻断及免疫荧光试验,观察单链抗体能否在A549细胞内表达,是否对病毒感染细胞有阻断作用。结果发现：WJY001株噬菌体单链抗体可以与鼠源多抗竞争结合猪流感病毒,可以在A549细胞中表达并可阻断H1N1猪流感病毒感染A549细胞。试验Ⅳ WJY001菌株scFv的原核表达。PCR扩增出WJY001株的scFv片段,连接到PET28a载体上,转到BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测是否表达,再经过Western Blot和ELISA分析其免疫原性。结果发现：单链抗体主要以包涵体形式表达,大小30kD左右,经过蛋白重折叠,再经过Western Blot和ELISA分析,复性后的scFv与可与H1N1猪流感病毒发生特异性结合结合反应。
段博芳,张利仙,段纲,董俊,叶玲玲,周晓黎,徐志斌,艾军[5]（2010）在《猪流感H1N1亚型NP基因杆状病毒表达载体构建及其在昆虫细胞中的表达》文中研究表明目的获得研发A型猪流感病毒ELISA检测试剂盒和制备NP蛋白单克隆抗体的抗原物质。方法根据已报道的猪流感病毒H1N1亚型NP基因序列（GenBank登录号:GQ422386）人工合成NP基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将NP基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,获得携带NP基因的重组质粒pFast-BacHTB-NP。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bac-mid-NP。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。结果通过SDS-PAGE和Westernblotting分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为57KD。结论实验结果表明已成功构建了携带NP基因的重组质粒pFastBacHTB-NP和转座的杆粒Bacmid-NP,转染后在sf9昆虫细胞上成功的表达。
许家荣[6]（2010）在《表达猪流感病毒HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析》文中研究表明1. SIVH1N1和H3N2亚型重组HAl蛋白iELISA方法的建立将合成的SIV H1N1和H3N2的HA1分别插入原核表达载体pET28b（+）,构建重组表达质粒pET28b（+）-H1HA1、pET28b（+）-H3HA1。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达,并用镍柱亲和层析法纯化蛋白。用猪流感阳性血清进行Western-blot,证明目的蛋白具有HAl蛋白抗原性。利用SIV HA1重组蛋白作包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪流感病毒抗体。结果表明本方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,适于大规模检测SIV血清抗体的流行病学调查。2.表达H1N1 HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析以质粒pET28b（+）-H1HA1为模板扩增猪流感病毒H1N1 HA1基因,并将其插入猪痘病毒载体pUSZ11中,构建了猪痘病毒转移载体pUSZ11/H1。将pUSZll/H1与猪痘病毒同源重组,获得表达猪流感H1N1 HA1蛋白重组猪痘病毒rSPV/H1。用SⅣH1N1阳性血清进行间接免疫荧光试验（IFA）,证明该重组病毒在PK15细胞中可以表达HAl目的蛋白；用Western-blot检测,结果显示HA1蛋白能够正确表达,且抗原性良好。取45只BALB/c小鼠,随机分为3组,每组15只。第1组每只肌肉免疫rSPV/H1,剂量为0.2×1070 TCIDD50;第2组每只肌肉注射wtSPV0.2×107.0TCID5o,第3组每只肌肉注射PK15细胞裂解上清0.2 mL。21 d、35 d分别以相同的剂量加强免疫2次。分别于首次免疫后21、35、42 d采血测定ELISA抗体和中和抗体；在首次免疫后21、35、42d,测定脾淋巴细胞增殖反应；首次免疫后35d,测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的量。结果为：第1组小鼠在免疫后21d,可以检测到SIV H1N1 HA1特异的ELISA抗体和中和抗体,42d达到最高,抗体水平显着高于对照组（P<0.05）。 21、35、42d,rSPV/H1免疫组小鼠淋巴细胞增殖指数（Stimulation Index, SI）显着高于wtSPV、PK15细胞免疫组（P<0.05）；35d时,rSPV/H1免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ（175.68 pg/ml）和IL-4（117.4 pg/ml）平均含量显着高于对照组（P<0.05）。取雌性Hartly豚鼠36只,随机分为6组,每组6只。第1、2组每只免疫rSPV/H1,剂量为每只0.4×107.0TCID50;第3、4组每只免疫wtSPV,剂量为0.4×107.0TCID50;第5、6组每只注射PK15细胞裂解上清0.4 mL。21 d加强免疫1次。首次免疫后28 d,测定外周血淋巴细胞培养上清中IFN-Y和IL-4的量。35 d测定中和抗体滴度。第35 d攻毒,第1、3、5组每只鼻腔注射0.2×105.0TCID50的HN1 SIV; 2、4、6组每只鼻腔注射0.2×105.0TCID50的H3N2 SIV。攻毒后观察7 d。对临床症状和肺大体病变进行评分。42 d将全部豚鼠安乐死,取肺组织处理、接种SPF鸡胚,HI试验检测流感病毒,同时观察肺组织病理变化。结果显示,免疫后28 d,1、2组淋巴细胞培养上清中SIV H1N1特异的的细胞因子IFN-γ（257.3 pg/ml）和IL-4 （208.26 pg/ml）的量显着高于对照组（P<0.05）。免疫35d, rSPV/Hl免疫组豚鼠血清中均能够检测到SⅣH1N1特异的中和抗体,而wtSPV、PK15免疫组血清对SIV H1N1没有中和活性。一免后35 d攻毒。攻毒后,免疫rSPV/H1的豚鼠无流感症状出现,而对照组豚鼠则表现有流感症状。rSPV/H1免疫组中只有用SIV H3N2攻击的2/6只豚鼠有轻微肉眼可见病理变化,而所有对照组豚鼠肺部都有范围大小不等的紫色、肉变区出现,病变范围从35%-75%。显微镜下见有严重的间质增生,有的充血、淋巴细胞浸润和肺泡壁破坏。免疫rSPV/H1的豚鼠只从用SIV H3N2攻击的1/6只中分离到SⅣ,而对照组全都分离到SⅣ。取30头6周龄SIV、PRRSV、PCV、SPV阴性猪,随机分6组,每组5头。第1组和第2组免疫rSPV/H1,第3、4组注射wtSPV,第5、6组注射PK15细胞裂解上清。在免疫后21d,检测H1N1的中和抗体和外周血淋巴细胞培养上清中IFN-Y和IL-4的量。在免疫后21d,所有猪攻毒。第1、3、5组每只鼻腔注入1×105.0 TCID50的HN1；2、4、6组每只鼻腔注入1×105.0 TCID50的H3N2。攻毒后连续5 d,观察临床表现,测体温、采鼻拭子。剖检时记录肺大体病变。检测肺组织SⅣ；同时取肺组织做病理切片。结果显示,免疫后21 d,1、2组淋巴细胞培养上清中的细胞因子IFN-γ （247.48pg/ml）和IL-4（159.02 pg/ml）的量显着高于对照组（P<0.05）. rSPV/Hl免疫组猪血清中均能够检测H1N1特异的中和抗体,wtSPV,PK15免疫组血清对SIV H1N1没有中和活性。攻毒后,免疫rSPV/H1的猪均无流感症状出现,而对照组则表现有流感症状。PK15和wtSPV组猪的鼻腔中一直持续分泌SIV,而重组毒免疫组在1、2天有2头检测到病毒,且分泌量明显低于对照组；其他猪未检测到病毒。rSPV/Hl免疫组猪中,用H3N2攻击的3/5头猪有轻微肉眼可见病理变化,而所有对照组猪肺部都有3%-9%的病变。免疫rSPV/Hl的猪只从用H3N2攻击的1/5号猪分离到H3N2,而对照组猪全都分离到H3N2。上述结果表明：本研究获得了SIV H1N1 HA1蛋白重组猪痘病毒rSPV/H1。 rSPV/H1能诱导小鼠产生显着的体液免疫和细胞免疫反应,不仅保护豚鼠和猪抵御同源SIV H1N1的攻击,还能部分抵御异型SIV H3N2的攻击。3.表达H3N2 HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析以质粒pET28b（+）-H3HA1为模板扩增H3N2 HA1基因,并将其插入猪痘病毒载体pUSZ11中,构建了猪痘病毒转移载体pUSZ11/H3。将pUSZ11/H3与猪痘病毒同源重组,获得表达H3N2 HA1蛋白重组猪痘病毒rSPV/H3。用H3N2阳性血清进行间接免疫荧光试验（IFA）,证明该重组病毒在PK15细胞中可以表达HA1目的蛋白；用Western-blot检测,结果显示HA1蛋白能够正确表达,且抗原性良好。取45只BALB/c小鼠,随机分为3组,每组15只。第1组每只肌肉免疫rSPV/H3,第2组每只肌肉注射wtSPV,第3组每只肌肉注射PK15细胞裂解上清。21 d、35 d分别以相同的剂量加强免疫2次。分别于首次免疫后21d、35d、42 d采血测定ELISA抗体和中和抗体；在首次免疫后21d、35d、42d,测定脾淋巴细胞增殖反应；首次免疫后35d,测定脾淋巴细胞培养上清中SIV H3N2特异的IFN-γ和IL-4的量。结果为：第1组小鼠在免疫后21d,可以检测到H3N2 HA1特异的ELISA抗体和中和抗体,42d达到最高,抗体水平显着高于对照组（P<0.05）。21d、35d、42d,rSPV/H3免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖指数显着高于wtSPV、PK15细胞免疫组（P<0.05）;35d时,rSPV/H3免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ（188.82pg/ml）和IL-4（133.57pg/ml）平均含量显着高于对照组（P<0.05）。取雌性Hartly豚鼠36只,随机分为6组,每组6只。第1、2组每只免疫rSPV/H3,第3、4组每只免疫wtSPV,第5、6组每只注射PK15细胞裂解上清。21d加强免疫1次。首次免疫后28 d,测定外周血淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的量。35 d测定中和抗体滴度。第35 d攻毒,第1、3、5组每只鼻腔注射SIV H3N2; 2、4、6组每只鼻腔注射SIVH1N1。攻毒后观察7 d。记录临床症状和肺大体病变。42 d将全部豚鼠安乐死,取肺组织处理、接种SPF鸡胚,HI试验检测流感病毒,同时取肺组织固定,做病理切片。结果显示,免疫后28 d,1、2组淋巴细胞培养上清中SIV H3N2特异的的细胞因子IFN-y（253.26pg/ml）和IL-4（191.88pg/ml）的量显着高于对照组（P<0.05）。免疫35d,rSPV/H3免疫组豚鼠血清中均能够检测到H3N2特异的中和抗体,wtSPV.PK15免疫组血清对H3N2没有中和活性。一免后35 d攻毒。攻毒后,免疫rSPV/H3的豚鼠无流感症状出现,而对照组豚鼠则表现有流鼻涕等流感症状。rSPV/H3免疫组中只有用H1N1攻击的有2只有轻微肉眼可见病理变化,而所有对照组豚鼠肺部都有大范围大小不等的紫色、肉变区出现,病变范围从35%-75%。显微镜下见有严重的间质增生,有的充血、淋巴细胞浸润和肺泡壁破坏。免疫rSPV/H3的豚鼠只从用H1N1攻击的1/6只的肺中分离到H1N1,而对照组全都分离到H1N1 SIV。取30头6周龄SIV（H3N2、H1N1）、PRRSV、PCV2、SPV阴性猪,随机分6组,每组5头。第1组和第2组免疫rSPV/H3,第3、4组注射wtSPV,第5、6组注射PK15细胞裂解上清。在免疫后21d,检测SIV的中和抗体和外周血淋巴细胞培养上清中H3N2特异的IFN-y和IL-4的量。在免疫后21d,所有猪攻毒。第1、3、5组每只鼻腔注入1×105.0TCID50的H3N2；2、4、6组每只鼻腔注入1×105.OTCID50的H1N1。攻毒后连续5 d,观察临床表现,测体温、采鼻拭子。剖检时记录肺大体病变。检测肺组织SIV；同时取肺组织做病理切片。结果显示,免疫后21 d,1、,2组淋巴细胞培养上清中的细胞因子IFN-γ（264.10pg/ml）和IL-4（180.16pg/ml）的量显着高于对照组（P<0.05）。rSPV/H3免疫组猪血清中均能够检测到SⅣH3N2特异的中和抗体,wtSPV、PK15免疫组血清对SIV H3N2没有中和活性。攻毒后,免疫rSPV/H3的猪无流感症状出现,而对照组则表现有流感症状。PK15和wtSPV组猪的鼻腔中SⅣ分泌一直持续,而重组毒免疫组用异型SIV H1N1攻击的2/5头检出病毒,且分泌量明显低于对照组；其他猪未检测到病毒。rSPV/H3免疫组猪中,用H1N1攻击的有2头有轻微肉眼可见病理变化,而所有对照组猪肺部都有3%-9%的病变。免疫rSPV/H3的猪未分离到H1N1,而对照组猪全都分离到H1N1。上述结果表明：本研究获得了H3N2 HAl蛋白重组猪痘病毒rSPV/H3. rSPV/H3能诱导小鼠产生显着的体液免疫和细胞免疫反应,不仅保护豚鼠和猪抵御同源H3N2的攻击,还能部分抵御异型H1N1的攻击。4.串联表达H3和H1亚型的HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析本研究设计、合成基因H3-2A-H1（HA1 Of SIV H3N2,2A of FMDV and HAl gene Of SIV H1N1）,将其插入猪痘病毒载体pUSZ11,获得pUSZ11/H3-2A-H1重组猪痘病毒转移载体。将pUSZ11/H3-2A-H1与猪痘病毒同源重组,获得表达猪流感H3N2和H1N1 HA1蛋白的重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-H1。用H3N2和H1N1阳性血清进行间接免疫荧光试验（IFA）,证明该重组病毒在PK15细胞中可以表达H3N2和H1N1 HA1目的蛋白；用Western-blot检测,结果显示H3N2和H1N1 HA1蛋白能够正确表达,且抗原性良好。取45只BALB/c小鼠,随机分为3组,每组15只。第1组每只肌肉免疫rSPV/H3-2A-H1,剂量为0.2×107.0 TCID50;第2组每只肌肉注射wtSPV 0.2×107.0 TCID50,第3组每只肌肉注射PK15细胞裂解上清0.2 mL。21 d、35 d分别以相同的剂量加强免疫2次。分别于首次免疫后21d、35d、42 d采血测定ELISA抗体和中和抗体；在首次免疫后21d、35d、42d,测定脾淋巴细胞增殖反应；首次免疫后35d,测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的量。结果为：第1组小鼠在免疫后21d,可以检测到SIV H3N2和H1N1 HA1特异的ELISA抗体和中和抗体,42d达到最高,抗体水平显着高于对照组（P<0.05）。21d、35d、42d,rSPV/H3-2A-H1免疫组小鼠淋巴细胞增殖指数显着高于wtSPV、PK15细胞免疫组（P<0.05）;35d时,rSPV/H3-2A-H1免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4平均含量显着高于对照组（P<0.05）。取雌性Hartly豚鼠36只,随机分为6组,每组6只。第1、2组每只免疫rSPV/H3-2A-H1,剂量为每只0.4×107.0 TCID50;第3、4组每只免疫wtSPV,剂量为0.4×107.0 TCID50;第5、6组每只注射PK15细胞裂解上清0.4 mL。21 d加强免疫1次。首次免疫后28 d,测定外周血淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4的量。35 d测定中和抗体滴度。第35 d攻毒,第1、3、5组每只鼻腔注射0.2×105.0 TCID50的H3N2 SIV; 2、4、6组每只鼻腔注射0.2×105.0TCID50的H1N1 SIV。攻毒后观察7 d。记录临床症状和肺大体病变。42 d将全部豚鼠安乐死,取肺组织处理、接种SPF鸡胚,HI试验检测流感病毒,同时取肺组织固定、做病理切片。结果为：免疫后28 d,1、2组淋巴细胞培养上清中SIV特异的的细胞因子IFN-γ和IL-4的量显着高于对照组（P<0.05）。免疫35d,rSPV/H3-2A-H1免疫组豚鼠血清中均能够检测到SIV H3N2和H1N1特异的中和抗体,wtSPV、PK15免疫组血清对SⅣ没有中和活性。一免后35 d攻毒。攻毒后,免疫rSPV/H3-2A-H1的豚鼠无流感症状出现,而对照组豚鼠则表现流鼻涕等流感症状。rSPV/H3-2A-H1免疫组无肉眼可见的肺部病理变化,而对照组豚鼠肺部都有范围大小不等的紫色、肉变区出现,病变范围从35%-75%。显微镜检查见有严重的间质增生,有的充血、淋巴细胞浸润和肺泡壁破坏。免疫rSPV/H3-2A-H1的豚鼠未分离到SⅣ,而对照组全都分离到SⅣ。取30头6周龄SIV、PRRSV、PCV、SPV阴性猪,随机分6组,每组5头。第1组和第2组免疫rSPV/H3-2A-H1,第3、4组注射wtSPV,第5、6组注射PK15细胞裂解上清。在免疫后21d,检测SIV H3N2和H1N1的中和抗体和外周血淋巴细胞培养上清中SIV特异的IFN-y和IL-4的量。在免疫后21d,所有猪攻毒。第1、3、5组每只鼻腔注入1×105.0 TCID50的SIV H3N2;2、4、6组每只鼻腔注入1×105.0TCID50的SIV H1N1。攻毒后连续5d,观察临床表现,测体温、采鼻拭子。剖检时记录肺大体病变。检测肺组织SIV；同时取肺组织做病理切片。结果显示,免疫后21d,1、2组淋巴细胞培养上清中的细胞因子IFN-y和IL-4的量显着高于对照组（P<0.05）。rSPV/H3-2A-H1免疫组猪血清中均能够检测到H3N2和H1N1特异的中和抗体,wtSPV、PK15免疫组血清对SIV没有中和活性。攻毒后,免疫rSPV/H3-2A-H1的猪无流感症状出现,而对照组有流感症状。PK15和wtSPV组猪的鼻腔中有SIV分泌,重组毒免疫组未检测到病毒。rSPV/H3-2A-H1免疫组猪中,无肉眼可见病理变化,而所有对照组猪肺部都有3%-9%的病变。从免疫rSPV/ H3-2A-H1的猪肺未分离到SIV,而对照组猪全都分离到SIV。上述结果表明,本研究获得了串联表达H3N2和H1N1 HA1蛋白重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-H1。rSPV/H3-2A-H1能诱导小鼠产生显着的体液免疫和细胞免疫反应,能完全保护豚鼠和猪抵御同源H3N2和H1N1的攻击。
郭利敏[7]（2010）在《H3N2亚型猪流感病毒NP蛋白的表达及其单克隆抗体的制备》文中研究表明猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）是由10种蛋白所构成的球状病毒粒子,其片段5所编码的核蛋白（NP）是保守性结构蛋白,在不同亚型流感病毒中变异率极低。鉴于SIV抗原多变性及其对人类的潜在威胁,NP蛋白单克隆抗体的制备对不同亚型SIV的诊断及NP蛋白结构与功能的研究具有重要的意义。本研究以携带有特定酶切位点的NP基因上下游引物,以H3N2 SIV cDNA为模板经PCR扩增NP基因,克隆到pMD19-T-simple vector,酶切及测序鉴定正确后构建pET32a-NP表达质粒,转化Rosetta（DE3）进行优化表达,获得分子量约73ku的重组可溶性NP蛋白。该蛋白纯化后经Western blot检测表明可分别与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV鸡阳性血清发生反应,具有良好的反应原性和交叉反应性。同时用此蛋白免疫小鼠制备的抗血清经间接免疫荧光（IFA）检测表明:该血清反过来与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV也可发生特异性反应,进一步证实所表达的NP蛋白同时具有良好的免疫原性。将重组质粒pMD-NP进行双酶切反应并将NP基因连接到经相同处理的真核表达载体pCAGGS上,经PCR及酶切鉴定获得重组质粒pCAGGS-NP,转染293T细胞,通过IFA和Western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得了正确表达。将pCAGGS-NP以100μg/只剂量免疫4-5周龄BALB/c小鼠,按常规方法进行3次免疫后进行加强免疫,3天后取其脾细胞与SP2/0进行融合。融合10天后以原核表达NP蛋白作为筛选抗原,以建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。将筛选到的阳性杂交瘤细胞经3-5次克隆培养后获得1株稳定分泌抗SIV NP蛋白单克隆抗体（MAb）的杂交瘤细胞株（3D7）;该单抗具有良好的特异性,经Ig亚类鉴定为IgM,轻链为κ链,其诱导小鼠产生的腹水ELISA效价为1:105;纯化3D7腹水并对其进行亲和力及抗原结合活性的测定,ELISA曲线图显示亲和力常数为1.02×106M-1,IFA结果显示其可与H1N1、H3N2、H9N2 SIV及甲型H1N1流感病毒发生特异性反应,具有良好的交叉反应活性。该MAb的成功制备将为进一步建立SIV的诊断方法以及分析NP蛋白抗原表位等方面的研究奠定基础。
张烨,于在江,唐启慧,陈禹保,辛丽,陈永坤,陈清轩,舒跃龙[8]（2010）在《猪流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达》文中研究说明克隆、表达和鉴定猪流感病毒H1N1 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆猪流感病毒H1N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a（+）上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a（+）/HA（截短）,pET32a（+）/NA（截短）,pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/Rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap 4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果显示,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western blotting试验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了猪流感病毒H1N1 HA、NA基因序列,为猪流感病毒H1N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。
宋晓国,王国华,朱翠侠,戴振华,修冰水,何竞,陈坤,张向颖,凌世淦,杨静,王升启,张贺秋,冯晓燕[9]（2010）在《甲型H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段的克隆和表达》文中研究表明目的:分析比对甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶（NA）、聚合酶B2（PB2）和聚合酶A（PA）抗原的序列,克隆表达保守的和变异的表位抗原区段,为免疫学诊断试剂的研究提供候选抗原。方法:采用BioSun生物学软件比较新近公布的A/H1N1流感病毒和我国猪流感病毒浙江株NA、PB2和PA抗原序列,并预测筛选NA、PB2和PA抗原表位保守区段与变异区段,采用PCR逐步合成法合成NA、PB2和PA表位抗原区段基因序列,并利用原核表达载体pBVIL1进行克隆表达。结果:筛选的保守表位抗原区段和变异表位抗原区段为NA/135～180aa、NA/310～350aa、PB2/1～80aa、PA/41～90aa、PA/231～280aa和PA/341～400aa;获得6条表位抗原区段基因序列,且6条表位抗原区段均获得了高效表达,得到纯化后的抗原。结论:获得了A/H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段,为进一步研制特异的甲型流感病毒快速诊断试剂提供了抗原储备。
谢金文,苗立中,沈志强[10]（2009）在《猪流感病毒蛋白研究进展》文中认为猪流感（swine influenza,SI）是由猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）引起的猪的一种传染病,其在世界各地的广泛存在和流行,给养猪业带来了巨大的经济损失。猪流感病毒属于正黏病毒科A型流感病毒属,作者就猪流感病毒蛋白,包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、基质蛋白（M）、聚合酶蛋白（PA、PB1和PB2）和非结构蛋白（NS）进行简要概述,以期为猪流感病毒的致病机制、诊断、分子流行病学等方面的研究提供参考。
二、猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用（论文提纲范文）
（1）H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述: 禽流感病毒及其单克隆抗体制备的研究进展 |
| 1 禽流感病毒的分子生物学特性 |
| 2 H9N2亚型禽流感的流行情况 |
| 3 禽流感主要检测方法 |
| 4 单克隆抗体技术 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第一章 H9N2亚型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（2）禽源H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白特异性单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 猪流感病毒概况 |
| 1.2 猪流感病毒流行病学 |
| 1.3 猪流感病毒（SIV）的生物学特性 |
| 1.3.1 猪流感病毒（SIV）的基因结构 |
| 1.3.2 猪流感病毒（SIV）蛋白的特性 |
| 1.3.2.1 血凝素蛋白（HA） |
| 1.3.2.2 神经氨酸酶（NA） |
| 1.3.2.3 核蛋白（NP） |
| 1.3.2.4 基脂蛋白 |
| 1.3.2.5 聚合酶蛋白 |
| 1.3.2.6 非结构蛋白 |
| 1.3.3 猪流感病毒的复制 |
| 1.4 猪流感的检测和诊断方法 |
| 1.4.1 猪流感病毒的临床诊断方法 |
| 1.4.2 猪流感的病理学诊断方法 |
| 1.4.3 猪流感病毒的实验室检测方法 |
| 1.4.3.1 猪流感病毒分离鉴定 |
| 1.4.3.2 SIV的血清学诊断方法 |
| 1.4.3.2.1 血凝（HA）和血凝抑制试验（HI） |
| 1.4.3.2.2 神经氨酸酶抑制试验 |
| 1.4.3.2.3 酶联免疫吸附试验 |
| 1.4.3.2.4 琼脂扩散试验 |
| 1.4.3.3 SIV分子生物学诊断方法 |
| 1.4.3.3.1 RT-PCR试验 |
| 1.4.3.3.2 Real-Time PCR试验 |
| 1.4.3.3.3 基因芯片技术 |
| 1.4.3.3.4 荧光抗体试验（IF） |
| 1.5 猪流感的预防与治疗 |
| 1.6 流感病毒单克隆抗体技术 |
| 本研究的目的及意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 毒株 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要试剂及配制 |
| 2.1.5.1 试剂 |
| 2.1.5.2 试剂配制 |
| 2.1.5.3 ELISA相关溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 抗原制备 |
| 2.2.2 动物免疫 |
| 2.2.3 间接ELISA方法建立 |
| 2.2.3.1 ELISA操作程序： |
| 2.2.3.2 抗原包被浓度和血清稀释度确定 |
| 2.2.3.3 抗原包被浓度和血清稀释度确定 |
| 2.2.3.4 封闭液及封闭时间对比实验 |
| 2.2.3.5 一抗作用时间确定 |
| 2.2.3.6 酶标二抗最佳稀释浓度及作用时间确定 |
| 2.2.3.7 特异性试验 |
| 2.2.4 小鼠抗体水平检测 |
| 2.2.5 细胞制备与饲养 |
| 2.2.5.1 SP2/0 细胞的复苏与培养 |
| 2.2.5.2 饲养细胞的制备 |
| 2.2.5.3 脾细胞的制备 |
| 2.2.6 细胞融合 |
| 2.2.7 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.2.8 阳性杂交瘤细胞株的克隆 |
| 2.2.9 单克隆抗体的腹水制备 |
| 2.2.10 HI试验 |
| 2.2.11 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 2.2.12 间接免疫荧光法检测单抗 |
| 2.2.12.1 细胞免疫荧光步骤 |
| 2.2.12.2 HA质粒构建 |
| 2.2.12.3 HA质粒抽提 |
| 2.2.12.4 HA真核转染 |
| 2.2.13 交叉反应试验 |
| 2.2.14 杂交瘤细胞株稳定性试验 |
| 3.结果和分析 |
| 3.1 抗原制备 |
| 3.2 全病毒间接ELISA方法建立 |
| 3.2.1 抗原包被浓度以及血清稀释度的确定 |
| 3.2.2 封闭液的选择 |
| 3.2.3 封闭时间选择 |
| 3.2.4 一抗最佳作用时间选择 |
| 3.2.5 酶标二抗稀释度确定 |
| 3.2.6 酶标二抗作用时间确定 |
| 3.2.7 ELISA特异性试验 |
| 3.3 动物免疫 |
| 3.4 单克隆杂交瘤细胞株命名及筛选 |
| 3.5 单克隆抗体效价的测定 |
| 3.6 HI试验 |
| 3.7 单克隆抗体亚类鉴定 |
| 3.8 病毒间接免疫荧光试验 |
| 3.9 HA真核表达免疫荧光试验 |
| 3.10 单抗交叉反应性试验 |
| 3.11 杂交瘤细胞株稳定性试验 |
| 4.讨论 |
| 4.1 抗原纯化与免疫 |
| 4.2 全病毒ELISA方法的建立 |
| 4.3 细胞融合 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）p38MAPK在H9N2-SIV诱导小鼠急性肺损伤中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 流感概述 |
| 1 流感的历史 |
| 2 流感病毒的分类和命名 |
| 3 流感病毒的结构 |
| 3.1 核心 |
| 3.2 基质蛋白 |
| 3.3 包膜 |
| 4 流感病毒的复制 |
| 5 流感病毒的变异 |
| 6 人类流感病毒与动物流感病毒的相互关系 |
| 6.1 禽类流感病毒 |
| 6.2 哺乳动物流感病毒 |
| 6.3 流感病毒宿主范围及其传播特征 |
| 6.4 流感病毒株起源的机制研究 |
| 6.5 研究动物流感的公共卫生意义 |
| 第2章 猪流感的研究进展 |
| 1 病原 |
| 2 SIV 致病毒株 |
| 2.1 经典 H1N1 型流感病毒 |
| 2.2 类人 H3N2 亚型流感病毒 |
| 2.3 类禽 H1N1 亚型流感病毒 |
| 2.4 H1N2 亚型流感病毒 |
| 2.5 H5N1 和 H9N2 亚型流感病毒 |
| 3 猪流感的流行病学 |
| 4 猪流感诊断方法 |
| 4.1 病毒分离和鉴定 |
| 4.1.1 病毒的分离 |
| 4.1.2 病毒的鉴定 |
| 4.2 血清学诊断方法 |
| 4.2.1 血凝和血凝抑制试验 |
| 4.2.2 神经氨酸酶抑制试验 |
| 4.2.3 中和试验 |
| 4.2.4 琼脂凝胶免疫扩散试验 |
| 4.2.5 免疫荧光法 |
| 4.2.6 免疫过氧化酶单层细胞试验 |
| 4.2.7 酶联免疫吸附试验 |
| 4.3 分子生物学诊断方法 |
| 4.3.1 聚合酶链式反应 |
| 4.3.2 实时荧光定量 PCR 技术 |
| 4.3.3 核酸序列依赖性扩增技术 |
| 5 猪流感的人类公共卫生意义 |
| 第3章 p38MAPK 信号通路研究进展 |
| 1 p38MAPK 概述 |
| 2 p38MAPK 分子结构特征与底物特异性 |
| 3 p38MAPK 信号通路 |
| 3.1 p38MAPK 上游信号调节 |
| 3.2 p38MAPK 下游效应 |
| 4 p38MAPK 信号通路的主要功能 |
| 4.1 炎性反应 |
| 4.2 调控细胞凋亡 |
| 4.3 缺血/再灌注损伤 |
| 4.4 细胞表型转分化 |
| 5 p38MAPK 信号通路常用研究方法 |
| 5.1 阻断剂法 |
| 5.2 免疫印迹分析 |
| 5.3 聚合酶链式反应 |
| 5.4 RNA 干涉 |
| 5.5 荧光共振能量转移技术 |
| 5.6 基因芯片 |
| 6 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 H9N2 亚型猪流感病毒鸡胚增殖及毒力测定 |
| 0 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 H9N2-SIV 的增殖及血凝效价测定 |
| 1.2.2 鸡胚半数感染量（EID50）的测定 |
| 1.2.3 小鼠半数致死量（MLD50）测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 H9N2-SIV 增殖及血凝效价测定 |
| 2.2 H9N2-SIV 感染鸡胚 EID50测定 |
| 2.3 H9N2-SIV 感染小鼠 MLD50测定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第2章 H9N2-SIV 诱导小鼠急性肺损伤模型的建立及相关研究 |
| 0 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物管理 |
| 1.2.2 试验动物的感染 |
| 1.2.3 小鼠肺系数和肺湿质量与干质量比（W/D）的测定 |
| 1.2.4 小鼠肺脏病理组织学观察 |
| 1.2.5 支气管肺泡灌洗液炎性细胞的变化 |
| 1.2.6 血气分析 |
| 1.2.7 试验数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 临床表现与剖检观察 |
| 2.2 感染后小鼠肺系数和肺湿质量与干质量比（W/D）变化 |
| 2.2.1 肺系数变化 |
| 2.2.2 W/D 变化 |
| 2.3 肺病理组织学变化 |
| 2.3.1 病理组织学检测（HE 染色） |
| 2.3.2 免疫组织化学检测（SABC 法） |
| 2.3.3 肺超微结构变化 |
| 2.4 支气管肺泡灌洗液中炎性细胞的变化 |
| 2.5 血气分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于 H9N2-SIV 感染模型动物的选择 |
| 3.2 H9N2-SIV 感染 BALB/c 小鼠动物模型肺脏的变化 |
| 3.3 H9N2-SIV 感染 BALB/c 小鼠动物模型的血气分析 |
| 4 小结 |
| 第3章 p38-MAPK 在 H9N2-SIV 诱导小鼠急性肺损伤中的作用 |
| 0 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与主要试剂 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组与感染 |
| 1.2.2 小鼠肺系数和肺 W/D 的测定 |
| 1.2.3 标本的采集 |
| 1.2.4 肺组织中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 等细胞因子水平检测 |
| 1.2.5 磷酸化 p38MAPK（phospho-p38MAPK）在肺组织中分布 |
| 1.2.6 免疫印迹（Western-blot）法测定肺组织中 p38MAPK 表达 |
| 1.2.7 试验数据处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 临床表现与剖检观察 |
| 2.2 小鼠肺系数和肺湿质量与肺干质量比值（W/D）变化 |
| 2.3 肺病理组织学变化（HE 染色） |
| 2.4 肺组织中细胞因子水平检测结果 |
| 2.5 磷酸化 p38MAPK 蛋白在肺组织的分布 |
| 2.6 肺组织中磷酸化 p38MAPK 蛋白含量的表达 |
| 2.6.1 丽春红染色液染色结果 |
| 2.6.2 Western-blot 法检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 流感病毒感染与细胞因子的关系 |
| 3.2 p38MAPK 与 ALI 的关系 |
| 3.3 p38MAPK 在 H9N2-SIV 诱导小鼠 ALI 中的活性表达和意义 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 博士研究生期间发表论文和研究成果 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
| 基金资助 |
（4）猪流感噬菌体单链抗体库的构建、筛选及基因表达（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流感的研究概况 |
| 1.1 SI的分类 |
| 1.2 SIV的形态结构与理化特性 |
| 1.3 SIV编码蛋白质及其功能 |
| 1.4 SI的流行情况 |
| 1.5 SI的公共卫生学意义 |
| 1.6 SI的防制 |
| 2 转基因动物简介 |
| 2.1 转基因动物的基本原理 |
| 2.2 转基因动物的研究进展 |
| 2.3 转基因动物的应用 |
| 3 噬菌体抗体库技术简介 |
| 3.1 噬菌体抗体库技术的产生及发展 |
| 3.2 噬菌体抗体库技术的基本原理 |
| 3.3 噬菌体抗体库技术的研究进展 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 H1N1猪流感病毒的培养及培养条件的优化 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 MDCK细胞培养条件的优化 |
| 2.2 免疫荧光检测病毒感染MDCK细胞 |
| 2.3 H1N1猪流感病毒培养条件的优化 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 猪流感噬菌体单链抗体库的构建与筛选 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 棋盘法检测小鼠血清抗体效价结果 |
| 2.2 重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段的扩增及SCFV的组装与扩增 |
| 2.3 初级抗体库库容量的计算及鉴定 |
| 2.4 抗体基因多样性分析 |
| 2.5 噬菌体单链抗体库的富集筛选结果 |
| 2.6 PHAGE-ELISA检测结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 阳性克隆株WJY001的鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 WJY001株阳性克隆活性的鉴定结果 |
| 2.2 WJY001株SCFV的真核表达 |
| 2.3 病毒阻断实验鉴定WJY001株SCFV |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 阳性克隆株WJY001的单链抗体的原核表达 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PET28A-SCFV重组质粒构建 |
| 2.2 单链抗体的诱导表达 |
| 2.3 单链抗体复性后的分析结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的论文 |
（6）表达猪流感病毒HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 猪流感病毒及其疫苗的研究进展 |
| 1 A型流感病毒分子生物学特性 |
| 1.1 A型流感病毒的基本特性 |
| 1.2 A型流感病毒基因组结构及编码的蛋白功能 |
| 1.3 A型流感病毒的基因分型 |
| 2 猪流感的危害 |
| 2.1 猪流感对养殖业的危害 |
| 2.1.1 猪流感发病特点、临床症状及病理变化 |
| 2.1.2 猪流感易继发多种疾病 |
| 2.2 猪流感的公共卫生意义 |
| 3 猪流感疫苗研究进展 |
| 3.1 灭活疫苗 |
| 3.2 减毒疫苗 |
| 3.3 DNA疫苗 |
| 3.4 重组活载体疫苗 |
| 3.5 单位疫苗 |
| 参考文献 |
| 第二章 H1N1亚型SIV重HAl蛋白IELISA方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株、血清 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 HAl基因设计合成及pET28b(+)-H1HA1质粒的构建 |
| 1.4 原核表达质粒pET28b(+)-H1HA1的鉴定 |
| 1.4.1 PCR鉴定 |
| 1.4.2 酶切鉴定 |
| 1.4.3 测序鉴定 |
| 1.5 重组蛋白的表达,纯化及抗原性鉴定 |
| 1.5.1 质粒pET28b(+)-H1HA1转化感受态大肠杆菌BL21 |
| 1.5.2 重组蛋白表达条件的优化 |
| 1.5.3 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 1.5.4 重组蛋白的大量表达 |
| 1.5.5 重组蛋白包涵体的纯化 |
| 1.6 猪流感(H1N1)iELISA抗体检测方法的建立 |
| 1.6.1 间接ELISA试验最佳条件的选择 |
| 1.6.2 临界值确定 |
| 1.6.3 特异性试验 |
| 1.6.4 重复性试验 |
| 1.6.5 临床血清样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒pET 28b(+)-H1HA1的鉴定结果 |
| 2.2 重组表达菌的诱导表达与重组HA1蛋白的纯化 |
| 2.3 Western-blot |
| 2.4 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.4.1 间接ELISA试验条件的优化 |
| 2.4.2 临界值确定 |
| 2.4.3 特异性试验 |
| 2.4.4 重复性实验 |
| 2.4.5 临床血清样品检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H3N2亚型SIV重HA1蛋白IELISA方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株、血清 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 HAl基因设计合成及pET28b(+)-H3HA1质粒的构建 |
| 1.4 原核表达质粒pET28b(+)-H3HA1的鉴定 |
| 1.5 重组蛋白的表达,纯化及抗原性鉴定 |
| 1.5.1 质粒pET28b(+)-H3HA1转化感受态大肠杆菌BL21 |
| 1.5.2 重组表达菌的IPTG诱导表达 |
| 1.5.3 重组HA1蛋白的Western-blot鉴定 |
| 1.5.4 重组蛋白的大量表达 |
| 1.5.5 重组蛋白包涵体的纯化 |
| 1.6 猪流感(H3N2)iELISA抗体检测方法的建立 |
| 1.6.1 间接ELISA试验最佳条件的选择 |
| 1.6.2 临界值确定 |
| 1.6.3 特异性试验 |
| 1.6.4 重复性试验 |
| 1.6.5 临床血清样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 原核表达质粒pET28b(+)-H3HA1的鉴定 |
| 2.2 重组菌的诱导表达与重组HA1蛋白的纯化 |
| 2.3 Western-blot |
| 2.4 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.4.1 间接ELISA试验条件的优化 |
| 2.4.2 临界值确定 |
| 2.4.3 特异性试验 |
| 2.4.4 重复性实验 |
| 2.4.5 临床血清样品检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 表达H1N1 HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 猪流感H1N1 HA1基因PCR扩增 |
| 1.2.2 猪流感H1N1 HA1重组猪痘病毒转移载体的构建与鉴定 |
| 1.2.3 感染与转染 |
| 1.2.4 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H1的纯化与鉴定 |
| 1.2.5 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H1的滴度测定 |
| 1.2.6 动物试验 |
| 1.2.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪流感H1N1 HA1基因PCR扩增 |
| 2.2 猪流感H1N1 HA1重组猪痘病毒转移载体pUSZ11/H1的构建与鉴定 |
| 2.3 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H1纯化和PCR鉴定 |
| 2.4 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H1表达鉴定 |
| 2.5 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H1滴度 |
| 2.6 小鼠的免疫学试验 |
| 2.6.1 iELISA抗体 |
| 2.6.2 中和抗体 |
| 2.6.3 SIV(H1N1)特异的淋巴细胞增殖检测 |
| 2.6.4 SIV(H1N1)刺激小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子检测 |
| 2.7 豚鼠免疫保护试验 |
| 2.7.1 SIV(H1N1)刺激豚鼠外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测 |
| 2.7.2 豚鼠肺组织病理变化观察 |
| 2.7.3 豚鼠免疫保护试验 |
| 2.8 猪体攻毒保护试验 |
| 2.8.1 攻毒后体温测量结果 |
| 2.8.2 攻毒后鼻腔排毒情况测量结果 |
| 2.8.3 SIV(H1N1)刺激猪外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测 |
| 2.8.4 猪肺组织病理变化观察 |
| 2.8.5 猪体攻毒保护试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 表达H3N2 HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 猪流感H3N2 HA1基因PCR扩增 |
| 1.2.2 猪流感H3N2 HA1重组猪痘病毒转移载体的构建与鉴定 |
| 1.2.3 感染与转染 |
| 1.2.4 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3的纯化与鉴定 |
| 1.2.5 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3的滴度测定 |
| 1.2.6 动物试验 |
| 1.2.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪流感H3N2 HA1基因PCR扩增 |
| 2.2 猪流感H3N2 HA1重组猪痘病毒转移载体pUSZ11/H3的构建与鉴定 |
| 2.3 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3纯化和PCR鉴定 |
| 2.4 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3表达鉴定 |
| 2.5 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3滴度 |
| 2.6 小鼠的免疫学试验 |
| 2.6.1 iELISA抗体 |
| 2.6.2 中和抗体 |
| 2.6.3 SIV H3N2特异的淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 2.6.4 SIV H3N2刺激小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子检测 |
| 2.7 豚鼠免疫保护试验 |
| 2.7.1 SIV H3N2刺激豚鼠外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测 |
| 2.7.2 豚鼠肺脏组织病理变化观察 |
| 2.7.3 豚鼠免疫保护试验 |
| 2.8 猪体攻毒保护试验 |
| 2.8.1 攻毒后体温测量结果 |
| 2.8.2 攻毒后鼻腔排毒情况测量结果 |
| 2.8.3 SIV H3N2刺激猪外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测 |
| 2.8.4 猪肺组织病理变化观察 |
| 2.8.5 猪体攻毒保护试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 串联表达H3和H1型HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 H3-2A-H1基因合成及猪痘病毒转移载体pUSZ11/H3-2A-H1构建、鉴定 |
| 1.2.2 感染与转染 |
| 1.2.3 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-H1的纯化与鉴定 |
| 1.2.4 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-H1的滴度测定 |
| 1.2.5 动物试验 |
| 1.2.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪流感(H3N2和H1N1)HA1重组猪痘病毒转移载体pUSZ11/H3-2A-H1的构建与鉴定 |
| 2.2 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-H1纯化和PCR鉴定 |
| 2.3 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-H1表达鉴定 |
| 2.4 猪流感重组猪痘病毒rSPV/H3-2A-H1滴度 |
| 2.5 小鼠的免疫学试验 |
| 2.5.1 iELISA抗体 |
| 2.5.2 中和抗体 |
| 2.5.3 SIV特异的淋巴细胞增殖检测 |
| 2.5.4 SIV刺激小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子检测 |
| 2.6 豚鼠免疫保护试验 |
| 2.6.1 SIV刺激豚鼠外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测 |
| 2.6.2 豚鼠肺脏组织病理变化观察 |
| 2.6.3 豚鼠免疫保护试验 |
| 2.7 猪体攻毒保护试验 |
| 2.7.1 攻毒后体温测量结果 |
| 2.7.2 攻毒后鼻腔排毒情况测量结果 |
| 2.7.3 SIV刺激猪外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测 |
| 2.7.4 猪肺组织病理变化观察 |
| 2.7.5 猪体攻毒保护试验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（7）H3N2亚型猪流感病毒NP蛋白的表达及其单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 SIV 的流行病学 |
| 1.2 SIV 的基因组特性 |
| 1.3 SIV 种间传播机制及其公共卫生学意义 |
| 1.4 SIV 核蛋白（Neucleoprotein，NP）的研究进展 |
| 1.4.1 NP 蛋白的结构与功能 |
| 1.4.2 NP 蛋白在抗感染免疫方面的研究 |
| 1.4.3 NP 蛋白在诊断方面的研究 |
| 1.5 DNA 免疫制备单克隆抗体的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 H3N2 SIV NP 基因的优化表达及抗原性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒株、血清、菌株及载体 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 引物设计 |
| 2.1.5 病毒RNA 的提取及反转录 |
| 2.1.6 NP 基因的PCR 扩增与克隆 |
| 2.1.7 原核表达重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.1.8 可溶性NP 蛋白的表达及最佳诱导条件的确定 |
| 2.1.9 重组表达蛋白的SDS-PAGE 分析 |
| 2.1.10 可溶性NP 蛋白非变性纯化 |
| 2.1.11 重组NP 蛋白抗原性分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 NP 基因PCR 扩增 |
| 2.2.2 重组质粒pMD-NP 的鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒pET32a-NP 的鉴定 |
| 2.2.4 表达蛋白的SDS-PAGE 分析 |
| 2.2.5 重组NP 蛋白的Western blot 检测 |
| 2.2.6 重组NP 蛋白的IFA 检测 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 H3N2 SIV NP 基因真核表达载体的构建及体外表达 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 病毒株、血清、细胞及质粒 |
| 3.1.2 试剂、酶及仪器 |
| 3.1.3 真核表达重组质粒pCAGGS-NP 的构建与鉴定 |
| 3.1.4 真核表达重组质粒pCAGGS-NP 的中量提取 |
| 3.1.5 空载体pCAGGS 的中量提取 |
| 3.1.6 293T 细胞的培养 |
| 3.1.7 NP 蛋白在293T 细胞中的体外瞬时表达 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pCAGGS-NP 真核表达重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.2.2 质粒转染293T 细胞的IFA 检测 |
| 3.2.3 NP 蛋白在293T 细胞的Western blot 检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 基因免疫制备抗H3N2 SIV NP 蛋白单克隆抗体 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒株、细胞、实验动物等 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 免疫原DNA 的制备 |
| 4.1.5 实验动物的免疫 |
| 4.1.6 间接ELISA 筛选方法的建立 |
| 4.1.7 阳性杂交瘤细胞的建立 |
| 4.1.8 阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆 |
| 4.1.9 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 4.1.10 单克隆抗体腹水制备 |
| 4.1.11 单克隆抗体的生物学鉴定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 间接ELISA 筛选方法的建立 |
| 4.2.2 杂交瘤细胞株的获得 |
| 4.2.3 单抗亚类鉴定及效价的测定 |
| 4.2.4 特异性鉴定 |
| 4.2.5 单抗的纯化 |
| 4.2.6 单抗Western blot 检测结果 |
| 4.2.7 单抗亲和力测定结果 |
| 4.2.8 抗原结合活性的检测 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）猪流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 猪流感病毒H1N1全基因组提取以及HA、NA基因的克隆 |
| 1.2.2 重组表达质粒pET32a (+) /HA (截短) , pET32a (+) /NA (截短) 的构建 |
| 1.2.3 重组表达质粒pGEX4T-1/NA的构建 |
| 1.2.4 HA、NA蛋白抗原片段的表达 |
| 1.2.5 表达产物的纯化 |
| 1.2.6 纯化产物免疫学活性的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 H1N1病毒全基因组提取以及HA、NA基因的克隆 |
| 2.2 HA、NA蛋白抗原片段表达质粒的构建 |
| 2.3 HA、NA蛋白抗原片段的表达 |
| 2.4 表达产物的纯化 |
| 2.4.1 pET32a (+) /HA (截短) 、pET32a (+) /NA (截短) 重组质粒表达产物的纯化 |
| 2.4.2 pGEX4T-1/NA重组质粒表达产物的纯化 |
| 2.5 纯化产物免疫学活性的鉴定 |
| 3 讨论 |
（9）甲型H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段的克隆和表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 抗原表位分析 |
| 1.3 引物设计与基因合成 |
| 1.4 原核表达载体的构建 |
| 1.5 抗原表达与纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 序列比对与抗原表位选择 |
| 2.2 目的基因的获取 |
| 2.3 抗原表达与纯化 |
| 3 讨论 |
（10）猪流感病毒蛋白研究进展（论文提纲范文）
| 1 血凝素 (HA) |
| 2 神经氨酸酶 (NA) |
| 3 核蛋白 (NP) |
| 4 基质蛋白 (M) |
| 5 聚合酶蛋白 (PA、PB1和PB2) |
| 6 非结构蛋白 (NS) |
四、猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用（论文参考文献）
- [1]H9N2亚型禽流感病毒HA和NP蛋白单克隆抗体的制备及在抗原变异分析中的初步应用[D]. 孙兰. 扬州大学, 2020(01)
- [2]禽源H1N1亚型猪流感病毒HA蛋白特异性单克隆抗体的制备[D]. 张鹏. 山东农业大学, 2016(03)
- [3]p38MAPK在H9N2-SIV诱导小鼠急性肺损伤中的作用[D]. 魏东. 甘肃农业大学, 2013(04)
- [4]猪流感噬菌体单链抗体库的构建、筛选及基因表达[D]. 杨康. 南京农业大学, 2011(04)
- [5]猪流感H1N1亚型NP基因杆状病毒表达载体构建及其在昆虫细胞中的表达[J]. 段博芳,张利仙,段纲,董俊,叶玲玲,周晓黎,徐志斌,艾军. 中国人兽共患病学报, 2010(12)
- [6]表达猪流感病毒HA1重组猪痘病毒的构建与免疫原性分析[D]. 许家荣. 南京农业大学, 2010(08)
- [7]H3N2亚型猪流感病毒NP蛋白的表达及其单克隆抗体的制备[D]. 郭利敏. 中国农业科学院, 2010(02)
- [8]猪流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达[J]. 张烨,于在江,唐启慧,陈禹保,辛丽,陈永坤,陈清轩,舒跃龙. 生物技术通报, 2010(02)
- [9]甲型H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段的克隆和表达[J]. 宋晓国,王国华,朱翠侠,戴振华,修冰水,何竞,陈坤,张向颖,凌世淦,杨静,王升启,张贺秋,冯晓燕. 生物技术通讯, 2010(01)
- [10]猪流感病毒蛋白研究进展[J]. 谢金文,苗立中,沈志强. 中国畜牧兽医, 2009(11)