一、RAP蛋白的纯化和抗体制备（论文文献综述）
张婷[1]（2021）在《转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究》文中进行了进一步梳理近年来,血栓性疾病越发受到关注,临床上有逐年渐增之势,严重威胁人类的生命健康。用溶栓药消除血栓是一种临床常用的方法。现有的溶栓药虽然有明确的治疗效果,但也存在治疗窗口期窄,用药量大,纤维蛋白特异性低,再灌注率低,系统出血率高,半衰期短,副作用大等问题。而纤维蛋白特异性高,溶栓效率高,出血风险低,半衰期长,毒副作用低的吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂（Desmodus rotundus salivary plasminogen activator alpha 1,DSPAα1）又称去氨普酶（desmoteplase）,有望成为新型、高效的溶栓药物。本研究应用哺乳动物转基因技术,在获得了乳腺特异性表达重组DSPA（recombinant DSPA,rDSPA）转基因兔的基础上,收集兔乳中的表达产物,应用自制的单克隆抗体,用于兔乳的ELISA和Western-blot检测;建立从转基因兔乳汁中分离和纯化rDSPA的方法;对rDSPA进行一级结构和生物活性分析,包括N端和C端氨基酸序列、相对分子量以及体外溶纤活性;应用角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型,并通过此血栓模型研究纯化产物rDSPA的体内溶栓效果及血浆半衰期。1.乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖两只原代兔经扩群繁殖、近交和回交,获得乳腺特异性表达rDSPA转基因兔134只,其中经测交确定纯合子兔2只（F2代）。收集兔乳,离心分离乳清,经ELISA检测,兔乳中rDSPA表达水平为1.19±0.26 mg/mL,纤维平板溶圈法（Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA）检测F0代、F1代、F2代转基因兔乳清中DSPA的溶纤活性,溶圈直径大小基本一致（18.6-20.4 mm）,结果表明外源基因rDSPA能稳定遗传给后代,此外培育出的纯合子兔能免除繁琐的基因型检测工作量,为rDSPA的转基因兔的保种提供了保障。2.原核表达去氨普酶（DSPA）基因载体的构建采用分子生物学技术,用PCR法扩增pCL25/DSPA表达载体上的编码DSPAαl成熟肽的DNA序列,用于与原核表达载体连接,构建pET-28a/DSPA原核表达载体。pET-28a/DSPA原核表达载体转入Rosetta感受态细胞,进行诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE电泳估测大小约为50 kDa。目的蛋白纯化后纯度为92%,远远满足其作为制备rDSPA单克隆抗体的免疫原的纯度要求。3.rDSPA单克隆抗体制备及筛选纯化的原核表达产物加弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,分离B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得阳性杂交瘤细胞株,分泌PR-mAb杂交瘤细胞注入同系小鼠腹腔制备抗体。本研究共得到36株阳性杂交瘤细胞,从中筛选出12株稳定分泌抗体的细胞株（命名M1-M12）。经ELISA-elution筛选,其中M3、M4两株为多羟基反应单克隆抗体（PR-mAb）,筛选率为16.67%（2/12）。注射M3和M4细胞株的小鼠腹水的抗体效价为1:125000,腹水抗体可用于ELISA和western blot检测。4.转基因兔乳中rDSPA的分离、纯化小鼠腹水抗体经rProtein A亲和层析柱纯化后与CNBr-activated Bestarose 4 FF介质偶联制成免疫亲和层析柱。rDSPA转基因兔乳经超速离心和硫酸铵沉淀预处理后。分别选用自制免疫亲和层析、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析纯化rDSPA。结果表明rDSPA转基因兔乳通过超速离心、55%硫酸铵沉淀、苯甲醚亲和层析、阳离子交换层析、赖氨酸亲和层析和活性蓝亲和层析分离纯化,获得纯度为98%的rDSPA。运用阴离子交换层析去除纯化产物中的内毒素,使用内毒素检测试剂盒检测结果表明纯化rDSPA内毒素含量低于0.015 EU/mL,符合注射剂标准。5.乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测运用Edman降解法测定rDSPA的N端氨基酸序列,结果显示rDSPA的N端氨基酸序列为 Val Ala Cys Lys Asp Glu IIe Thr Gln Met Thr Tyr Arg Arg Gln,与设计的 DSPA编码序列的理论N端的第4-18位氨基酸序列完全一致,表明rDSPA编码序列N-端的山羊β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）的信号肽已完全切除;运用液相色谱-质谱/质谱联用技术（LC-MS/MS）测定rDSPA的C端氨基酸序列及其它部分的氨基酸序列,结果显示 rDSPA 的 C 端氨基酸序列为 Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Tyr Leu Gly Trp IIe Arg Asp Asn Met His Leu,与设计的rDSPA编码序列的C末端完全一致,共有47%（208个氨基酸）的序列与DSPA编码序列完全同源。经高分辨率质谱仪检测后确定rDSPA的相对分子量为53126.75 Da,大于理论的49535.94 Da,推测是翻译后的糖基化修饰导致;运用纤维平板溶圈法（FAPA）检测纯化产物rDSPA的体外纤溶活性（773333 IU/mg）略高于阿替普酶（580000 IU/mg）。6.rDSPA体内外溶栓效果的初步评价SD大鼠腹主动脉采血,血凝块切成约0.1 cm3方块并称重,分成7组（0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL DSPA;0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL 阿替普酶;生理盐水）,37℃孵育16 h,称重剩余血凝块并计算血凝块溶解率。结果显示rDSPA体外大鼠血凝块溶解率（48.34±2.25%）明显高于阿替普酶组（40.91±1.36%）的血凝块溶解率（p<0.05）,表明rDSPA体外溶栓活性强于阿替普酶。8周龄的雄性SD大鼠随机分成4组,每组6只,分成低、中、高剂量rDSPA组（2 mg/kg、8 mg/kg、32mg/kg）和阿替普酶组（8 mg/kg）,安慰剂组,空白对照组。各组大鼠心脏采血检测凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）,纤维蛋白原（FIB）和D-二聚体,同时测量大鼠尾部血栓长度。结果显示rDSPA有显着的溶栓效果,rDSPA低（APTT:18.80±1.26 s;TT:35.75±0.41 s）、中（APTT:27.78±1.88 s;TT:39.18±0.82 s）、高（APTT:36.51±1.29 s;TT:37.56±1.07 s）剂量组和阿替普酶组（APTT:27.00±1.76 s;TT:34.05±0.99 s）的 APTT、TT 均较安慰剂组（APTT:12.53±0.54 s;TT:26.87±1.31 s）相比有所延长,且差异极显着（p<0.01）,rDSPA 中（PT:14.28±0.79 s;D-二聚体:2.49±0.07 mg/L）、高（PT:17.07±1.19 s;D-二聚体:3.12±0.55 mg/L）剂量组和阿替普酶组（PT:14.26±0.93 s;D-二聚体:2.53±0.12 mg/L）的PT、D-二聚体水平均比安慰剂组（PT:12.29±0.76 s;D-二聚体:2.30±0.07 mg/L）显着升高（p<0.05）,表明大鼠注射rDSPA和阿替普酶后都有效激活纤溶系统。阿替普酶组（200.22±6.09mg/dL）较rDSPA低（222.40±7.89 mg/dL）、中（228.30±1.72mg/dL）、高（228.19±1.89mg/dL）剂量组的 FIB 水平较有所下降（p<0.05）,rDSPA低、中、高剂量组之间的FIB水平差异不显着,表明rDSPA在溶栓过程中FIB消耗量小于阿替普酶,相比阿替普酶不易引起颅内出血副作用,更具有安全性。rDSPA低（48.96±9.42%）、中（24.71±6.26%）、高（0.00±0.00%）剂量组和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比明显小于安慰剂组（67.76±6.06%）,即rDSPA低、中、高剂量组的尾栓消溶相对长度明显长于安慰剂组,并与剂量成正比例,且rDSPA高剂量组大鼠尾部不形成血栓。相同剂量的rDSPA中剂量组（24.71±6.26%）和阿替普酶组（49.19±6.21%）的大鼠尾栓相对长度百分比差异极显着（p<0.01）,表明纯化产物rDSPA的溶栓能力明显优于阿替普酶。8周龄的SD雄性大鼠随机分成2组,每组4只,分为rDSPA组和阿替普酶组。rDSPA组和阿替普酶组均以8 mg/kg的剂量尾静脉注射rDSPA或阿替普酶,采集血浆进行纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的测定,计算rDSPA半衰期。结果显示rDSPA组和阿替普酶组大鼠血浆PAP浓度分别在6 min及3 min达到顶峰（133.06±63.90 ng/mL,219.44±1.18 ng/mL）,rDSPA和阿替普酶在SD大鼠体内的血浆半衰期分别为52.41 min和10.41 min。推算rDSPA的半衰期较阿替普酶延长5倍,表明rDSPA可用于单次注射针剂溶栓药的制备。综上所述,本研究成功培育出乳腺特异性表达rDSPA转基因兔,且rDSPA转基因兔具有较高的表达水平,建立了有效的分离纯化的实验室工艺,并保持原有的溶纤溶栓活性,表明该研究迈出临床应用的第一步。rDSPA的一级结构分析表明,重组DSPA编码序列可以在转基因兔乳腺上皮细胞中表达,并剪切去除异源性的信号肽序列,翻译后加工为有溶栓活性的成熟蛋白,这一结果在国内外尚未见报道。大鼠体内外溶栓试验中rDSPA表现出优于阿替普酶的溶栓性能,且rDSPA在大鼠体内的半衰期长于阿替普酶,体内溶栓试验呈现出更安全、更持续的溶栓效果,该结果在国内外也未见报道。本研究成果为开发和生产新的高效溶栓药奠定了实验基础。
吕照勇[2]（2021）在《基于羊巴贝斯虫球状体蛋白3（SBP3）基因的检测方法建立》文中研究说明巴贝斯虫广泛分布在世界的温带、热带及亚热带地区,对人类和动物健康造成严重危害。巴贝斯虫不同于弓形虫、疟原虫等顶复门原虫,其顶端复合体除了有微线体（Microneme）、棒状体（Rhoptry）之外,还有球状体（Spherical bodies）,但并未发现致密颗粒（Dense granules）的存在。本研究从我国分离的6株羊巴贝斯虫基因组DNA和c DNA中扩增SBP3基因全长序列,进行基因序列比对及结构特征与遗传进化分析,以阐述我国羊巴贝斯虫SBP3的基因学特征和各个虫株间的分类关系;并以其为靶标分子分别建立荧光定量PCR检测方法、巢式PCR检测方法和高分辨率熔解曲线分析方法,以满足不同检测目的的需求;利用原核表达系统获得羊巴贝斯虫未定种新疆株SBP3重组蛋白,并制备了其多克隆抗体,为评价SBP3作为免疫学检测候选抗原的潜力提供了生物学材料。主要研究内容和结果如下:1.从我国分离的6株羊巴贝斯虫基因组DNA和c DNA中扩增了SBP3基因的全长序列;利用生物信息学分析软件,进行基因序列比对、结构特征分析和遗传进化分析,结果显示,羊巴贝斯虫SBP3基因无内含子,羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株、莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株和莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株的SBP3基因全长分别为3 195 bp、3 351 bp和3 348 bp;遗传进化分析结果显示,我国分离的六株羊巴贝斯虫可分为2个种,其中莫氏巴贝斯虫内可能存在2个亚种。2.以我国6株羊巴贝斯虫SBP3基因为分子靶标,通过序列分析,设计特异性引物,成功建立了可检测我国6株羊巴贝斯虫的荧光定量PCR、鉴别检测两种羊巴贝斯虫的巢式PCR和鉴别检测两个种羊巴贝斯虫及莫氏巴贝斯虫两个亚种的高分辨率熔解曲线分子检测方法。这三个分子检测方法均具有良好的特异性和敏感性,与感染羊的吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊无浆体均无交叉反应,对羊巴贝斯虫基因组DNA最低检测限为0.5 pg-10 pg。3.以羊巴贝斯虫未定种新疆株SBP3基因序列为模板,设计引物,扩增出不含信号肽序列的SBP3基因片段,构建原核表达载体p ET-28a-BXJSBP3,将其转入大肠杆菌BL21并进行诱导表达和SDS-PAGE分析。结果显示,大小为130 k Da的重组蛋白（r BXJSBP3）成功表达,同时在2、4、6和8小时表达量无明显差异;经超声破碎和可溶性分析,发现其主要以包涵体形式进行表达;对r BXJSBP3进行纯化以及浓度测定,获得浓度为200μg/m L的可溶性r BXJSBP3;以纯化的r BXJSBP3免疫试验兔制备多克隆抗体,对多克隆抗体进行Western blot分析,发现其能够特异性识别r BXJSBP3和羊巴贝斯虫未定种新疆株裂殖子天然SBP3蛋白。该研究为进一步评价SBP3作为免疫学检测候选抗原的潜力和功能的研究提供了生物学材料。
王晓星[3]（2021）在《羊巴贝斯虫自噬相关基因结构与功能研究》文中指出羊巴贝斯虫病是一种蜱传性（tick-borne）血液原虫病,临床特征包括发热、血红蛋白尿和溶血性贫血等。目前,研究表明我国羊巴贝斯虫分布广泛、动物感染率高,严重危害我国养羊业的健康可持续发展。自噬（autophagy）是细胞在自噬相关基因（autophagy-related gene,ATG）的调控下,依赖溶酶体途径对长寿蛋白或受损细胞器进行降解的一种过程。近年来,研究表明ATGs不仅参与调控疟原虫和弓形虫自噬的发生,而且在维持顶质体、线粒体等细胞器的稳态及虫体的生长复制过程中起关键作用,同时也与耐药虫株（双氢青蒿素、氯喹和哌嗪等抗疟药物）的产生存在潜在的关系。巴贝斯虫、疟原虫和弓形虫等同属于顶复门原虫,但迄今为止,尚未见巴贝斯虫中是否存在自噬系统及其ATGs结构与功能的研究报道。因此,本研究以羊巴贝斯虫未定种新疆株（Babesia sp.Xinjiang,BspXJ）为研究对象,通过对梨形虫ATGs进行生物信息学分析、测定羊巴贝斯虫顶质体和线粒体基因组、评价自噬抑制剂和诱导剂对ATGs表达丰度的影响、建立羊巴贝斯虫基因编辑技术和分析ATGs亚细胞定位及鉴定互作蛋白等工作,为深入开展巴贝斯虫ATGs功能的研究提供了基础数据,同时为利用基因编辑技术开展巴贝斯虫基因功能的研究建立了技术平台。主要研究结果总结如下:1.通过对梨形虫ATG的生物信息学分析,表明巴贝斯虫基因组中仅存在部分核心ATGs,包括ATG3、ATG4、ATG7、ATG8、ATG18和Vps34,其中ATGs蛋白的催化或结合位点在不同物种中高度保守,同时也显示其适于作为顶复门原虫进行分类研究的分子靶标;其次对羊巴贝斯虫顶质体和线粒体基因组进行测定,结果显示其基因组大小分别为29916–30846 bp和5767–5946bp,以其基因组构建的系统进化树均表明我国羊巴贝斯虫可分为羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫（Babesia motasi）,其中莫氏巴贝斯虫又分为两个亚种,该结果为后续ATGs基因功能的研究提供细胞器基因组数据。2.通过瞬时转染筛选最佳转染条件,结果表明最佳转染缓冲液、程序和质粒用量分别为Human T Cell nucleofector solution、V-024和20μg,启动子活性为Actin IG>ef1αAIG>ef1αBIG>Rap IG,在瞬时转染成功的基础上使用同源重组技术,将e GFP-杀稻瘟菌素（Blasticidin,BSD）融合蛋白插入BspXJ基因组的ef1α位点,经PCR、WB和IFA鉴定,结果显示获得稳定表达e GFP-BSD融合蛋白的单克隆虫株,表明成功建立了BspXJ瞬时和稳定转染系统,为后续研究基因功能提供了技术支持。3.制备BspXJ的ATGs多克隆抗体,经WB分析,结果显示天然ATG蛋白的表达量较低;利用建立的稳定转染系统,构建过表达ATGs的BspXJ虫株,经q PCR、PCR、WB和IFA鉴定过表达ATGs的虫株,结果显示成功获得过表达ATG3和ATG8的BspXJ虫株;然后通过IFA和Co-IP等方法进行ATG3和ATG8蛋白的亚细胞定位分析及互作蛋白的鉴定,结果表明ATG3和ATG8与顶质体和线粒体均部分共定位,与其互作的蛋白主要参与调控自噬、泛素降解、入侵和线粒体主要功能等生物学过程。4.通过筛选BspXJ自噬抑制剂和诱导剂的最佳作用浓度,应用q PCR检测自噬抑制剂和诱导剂处理后不同时间点ATGs的表达丰度,结果显示最佳作用浓度依次为2 m M 3-甲基腺嘌呤、12.5n M巴非霉素A1、12.5μM氯喹和5μM雷帕霉素,HBSS和雷帕霉素自噬诱导剂处理后,均可增高ATGs的表达丰度,其中ATG8表达量增加3–26.5倍,而自噬抑制剂处理后,ATGs表达丰度降低/增高倍数小于1,表明BspXJ的ATGs参与调控其自噬过程。5.利用同源重组技术敲除ATG3和ATG8后,经过多轮筛选均未获得稳定转染的基因敲除虫株,结果表明ATG3和ATG8是BspXJ生长复制过程中的关键基因;为进一步研究其基因功能,稳定表达TIR1-3Flag的虫株中转染p BS-m Cherry-AID-3HA质粒,成功筛选获得稳定表达m CherryAID-3HA的虫株。在加入400μM IAA 4 h时,WB和IFA检测结果显示m Cherry-AID-3HA蛋白的表达水平显着降低,表明成功建立了BspXJ的条件性基因敲除系统,从而为将来开展ATG3和ATG8作用机制的研究提供了技术平台。综上所述,本研究成功建立了BspXJ的瞬时、稳定转染及条件性基因敲除技术,初步阐明了虫体内存在自噬途径,且其ATGs参与调控自噬途径,为深入开展巴贝斯虫自噬相关基因的作用机制提供了基础数据,同时为开展巴贝斯虫入侵、繁殖、致病、代谢等方面机制的研究提供了技术平台。
吴杰连[4]（2021）在《p62/Keap1-Nrf2途径介导自噬促进贝类抗氧化应激研究》文中指出贝类是水生态系统的初级消费者,在底栖动物中占优势。蓝藻水华产生的微囊藻毒素严重影响了贝类的生存,贝类可以通过直接的摄食活动将MC快速地富集在体内通过产生活性氧簇引起贝类机体氧化系统失衡,以致细胞损伤。选择性自噬和Keap1-Nrf2通路是主要的抗氧化应激途径,氧化剂可通过多条信号途径诱导细胞产生自噬和激活Keap1-Nrf2途径以缓解氧化损伤。Keap1-Nrf2的激活途径分为经典途径和非经典途径。在应激条件下,Keap1构象发生改变,以致Nrf2入核与小Maf形成异源二聚体,诱导Nrf2靶标调控区的抗氧化酶功能,从而保护细胞和组织免受氧化损伤,这是Keap1-Nrf2激活的经典途径。P62是选择性自噬衔接蛋白,通过与泛素蛋白结合穿梭至蛋白酶体或溶酶体,参与泛素-蛋白酶体和自噬溶酶体的蛋白质降解,其表达水平通常与自噬成反比。哺乳动物p62在氧化应激中充当协调自噬和Keap1-Nrf2信号通路的细胞整合点,通过形成p62/Keap1-Nrf2正反馈回路介导细胞自噬上调抗氧化反应元件ARE抗氧化酶和解毒酶来保护细胞免受损伤,此途径被称为Keap1-Nrf2激活的非经典途径。本文以暴露在MC环境下的褶纹冠蚌为研究对象,对褶纹冠蚌p62进行鉴定与功能分析,阐明p62与自噬的关联,以及p62与Keap1-Nrf2通路的调控关系,探讨贝类p62/Keap1-Nrf2途径消减贝类微囊藻毒素引起的应激反应。1、Western Blot、免疫组化及qRT-PCR实验发现MC胁迫蚌24 h,Cp Nrf2蛋白的表达和mRNA转录水平显着增强,Cp Nrf2敲降后,在MC诱导24 h其mRNA和蛋白表达均显着降低;CpKeap1a敲降后MC诱导96 h,Cp Nrf2 mRNA和蛋白表达显着增强。MC促进GOT、GPT及相关抗氧化酶活显着上调,进而通过激活抗氧化酶减轻蚌的肝胰腺受损。荧光素酶报告基因实验表明Cp Nrf2以剂量依赖性促进Cp NQO1基因启动子的活性上调;在细胞毒性承受范围内,MC以剂量依赖性上调Cp NQO1基因启动子的活性,并且MC促进Cp Nrf2上调Cp NQO1基因启动子的活性。2、构建pGEX 4T-1-CpKeap1a、pET30a-Keap1b和pET-32a-Nrf2表达载体,诱导蛋白表达,纯化GST-CpKeap1a和HIS-Cp Keap1b蛋白,其浓度分别为0.338mg/m L和0.22 mg/m L。GST-pulldown结果表明CpKeap1a与Cp Keap1b形成异源二聚体。构建FLag-CpKeap1a、FLag-Cp Keap1b、HA-CpKeap1a、HA-Cp Keap1b、HA-Cp Nrf2、FLag-Cp Nrf2等表达载体,免疫共沉淀显示CpKeap1a与Cp Keap1b可以形成同源和异源二聚体,Cp Nrf2可以与CpKeap1a和Cp Keap1b相互结合。3、从构建的褶纹冠蚌血细胞转录组文库中筛选p62、LC3、Bcl-2基因片段,克隆了Cpp62、CpLC3和CpBcl-2基因的c NDA序列全长。Cpp62 c DNA全长序列为2484 bp,其5’UTR序列为88 bp,3’UTR序列为1247 bp,ORF序列为1149 bp,编码382个氨基酸,其中包含高度保守的p62-PB1结构域（3-90aa）、ZZ链结构域（102-148）和UBA结构域,预测有LIR结构域而无KIR结构域。该蛋白含有一个poly（A）尾,质谱测定其分子量为42.485 k Da,理论等电点（PI）为5.98。CpLC3 c DNA序列全长为2151 bp,其5’UTR序列为64 bp,3’UTR序列为1721 bp,ORF框长度为366 bp,其编码121个氨基酸,包含一个高度保守Ub1＿ATG8＿MAP1LC3结构域。该蛋白含有一个poly（A）尾,其蛋白质分子量为14.10 k Da,PI为9.39。CpBcl-2 c DNA序列全长为760 bp,其5’UTR为93 bp,3’UTR为132 bp,ORF序列为535 bp,共编码177个氨基酸,其中包含高度保守的Bcl-2样superfamily结构域（44-145aa）,其分子量为20.17 k Da,PI为6.61。4、MC胁迫后,肝胰腺中Cpp62 mRNA的表达在24和48h明显上调,其在肾脏中的表达也均上调;CpKeap1a敲降后,MC促进肝胰腺中Cpp62在24,48和72 h的表达上调,促进肾脏Cpp62在72和96 h表达上调;Cp Nrf2敲降后,MC促进肝胰腺中Cpp62的表达在24、48和72h下调。Western Blot实验结果显示MC促进Cpp62的蛋白表达,褶纹冠蚌Keap1-Nrf2途径正向调控Cpp62蛋白的表达,与荧光定量PCR结果一致。结果表明MC可以激活褶纹冠蚌Keap1-Nrf2途径参与调控Cpp62 mRNA和蛋白的表达。5、克隆褶纹冠蚌p62基因启动子,分析其含有Nrf2、Maf G、Mafk和Nrf2-Maf G二聚体结合元件,并含有4个ARE元件。EMSA表明Cp Nrf2蛋白阻滞Cpp62-ARE迁移,荧光素酶报告基因显示Cp Nrf2以剂量依赖性促进Cpp62-ARE活性上调。但是MC抑制Cp Nrf2上调Cpp62启动子活性。Cpp62启动子ARE元件突变后,其活性被Cp Nrf2转录因子抑制。6、合成褶纹冠蚌p62双链干扰序列（Cpp62-ds RNA）,Cpp62-ds RNA干扰效率在24和48 h分别为64.7%和58.6%,表明Cpp62-ds RNA具有干扰效率,且Cp Nrf2和Cp NQO1的表达在Cpp62-ds RNA处理组显着下调。荧光素酶报告基因实验发现Cpp62可以呈Cp Nrf2浓度依赖性促进Cp NQO1和Cpp62基因启动子的活性上调。但是,MC抑制Cpp62促进Cpp62启动子的活性上调,且Cpp62抑制ARE元件突变的Cpp62启动子活性。7、Cpp62与CpKeap1a体外不形成二聚体,双荧光素酶报告显示CpKeap1a和Cp Keap1b均不影响Cpp62促进Cp NQO1和Cpp62基因启动子的活性。8、构建自噬抑制剂和自噬激活剂贝类模型,采用qRT-PCR和Western Blot检测发现自噬的动态变化影响了Cpp62的表达;TEM观察MC诱导褶纹冠蚌产生轻度自噬,并且发现Cpp62-ds RNA中自噬溶酶体数量减少,自噬小体消失,表明褶纹冠蚌Cpp62可能介导自噬小体的形成,且贝类存在Cpp62依赖型自噬。9、CpLC3在检测的组织中均有表达,自噬激活剂诱发蚌产生自噬时上调CpLC3的表达,并且MC引起的氧化应激促进CpLC3 mRNA的表达水平显着上调;免疫双荧光定位发现MC促进CpLC3蛋白分别与Cpp62、CpKeap1a蛋白在细胞中发生重叠;免疫共沉淀实验表明CpLC3分别与CpKeap1a、Cp Keap1b和Cpp62结合。结果表明蚌发生自噬和氧化应激均影响CpLC3基因的转录,并促进蚌内p62-Keap1a-LC3聚合体的形成。10、qRT-PCR检测发现自噬缺陷时,CpBcl-2 mRNA的表达水平呈显着性下降;反之,自噬发生时其表达相反。Tunel结果显示3-MA促进细胞发生凋亡,Rap抑制细胞凋亡,并且Cpp62-ds RNA组织中的凋亡细胞数量高于对照组。结果表明MC诱发蚌产生的细胞自噬可以抑制细胞凋亡,揭示褶纹冠蚌p62可以正向调控细胞凋亡。
彭超[5]（2021）在《TRIM50-like和TRIM9在斑节对虾先天免疫中的功能研究》文中提出斑节对虾（Penaeus monodon）是我国的固有品种,是当前世界上三大养殖虾类之一。然而,近年来由各种原因导致的病害频繁爆发,阻碍了对虾养殖行业的健康发展。在这些病害中,白斑综合征病毒（white spot syndrome virus,WSSV）引发的病毒性疾病和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）引起的细菌性疾病是对虾养殖中影响最为严重的两种病害。三基序家族（Tripartite motif family,TRIM）蛋白在参与调控制先天免疫信号通路和抵御病原菌入侵中起着不可替代的作用。因此,了解TRIM家族蛋白成员在对虾先天免疫反应中的作用,对参与WSSV病毒和副溶血弧菌感染的TRIM蛋白进行鉴定和功能分析,对预防和控制对虾病害有重要的意义。本文从斑节对虾的转录组文库中筛选和挖掘出了 TRIM家族的两个成员PmTRIM9和PmTRIM50-like,并对其进行了基因克隆和原核表达分析。通过分析他们在感染副溶血弧菌和WSSV过程中的免疫功能,来阐明其调节对虾先天免疫信号通路的分子机制。1.TRIM50-like可能通过其介导的细胞自噬和泛素化作用来参与抑制WSSV病毒的复制哺乳动物中,很多TRIM蛋白作为细胞自噬的核心组分,在调节细胞自噬方面起至关重要的作用。另外,很多TRIM蛋白还可以通过多种方式来实现抗病毒功能。然而,在甲壳动物中还没有关于TRIM蛋白参与细胞自噬和病毒感染的研究报道。在本研究中,我们从斑节对虾克隆并鉴定了一种TRIM50-like基因,并将其命名为Pm TRIM50-like。PmTRIM50-like的ORF全长为1245 bp,编码一个长度为414aa的蛋白质。PmTRIM50-like含有一个典型的RING结构域,一个B-Box结构域和一个Cyclophilin结构域。系统进化树结果表明,PmTRIM50-like与伊比利亚鼹鼠的E3泛素蛋内连接酶TRIM50进化关系最近。通过qRT-PCR和Western blotting检测发现,PmTRIM50-like广泛分布在肠、胃、血细胞、鳃、心脏、大脑、肝胰腺和肌肉中,其中PmTRIM50-like在肠道和胃组织中的相对表达量较高。在受到WSSV感染后,PmTRIM50-like蛋白及其mRNA在肠道和血细胞中显着上调表达。与感染前相比,PmTRIM50-like在肠道和血细胞中的表达量分别上升了 16.6倍和10.6倍。这说明PmTRIM50-like可能参与WSSV感染过程。RNA干扰实验结果表明,当Pm TRIM50-like的表达被干扰后,对虾体内的VP28在转录和翻译水平的表达量明显增加,WSSV病毒的拷贝数显着增加,对虾的存活率显着下降。过表达实验结果表明,当过表达对虾体内的PmTRIM50-like tnRNA后,对虾体内的VP28在转录和翻译水平的表达量明显减少,WSSV病毒的拷贝数也显着降低。这说明Pm TRIM50-like在斑节对虾体内参与抑制WSSV的复制。Western blotting、透射电镜和免疫细胞荧光化学实验结果表明WSSV或细胞自噬诱导剂雷帕霉素刺激能诱导对虾细胞自噬的发生。而细胞自噬在对虾内被证明起抑制WSSV复制的作用。当干扰PmTRIM50-like的表达后,结果显示WSSV或剂雷帕霉素诱导的细胞自噬作用被明显抑制。这说明斑节对虾PmTRIM50-like参与正向调节细胞自噬的发生。进一步实验结果表明,干扰Pm TRIM5 0-like的表达后,雷帕霉素诱导的对虾细胞自噬被抑制,从而失去抑制WSSV复制的作用。这说明pmTRIM50-like可能通过正向调节细胞白噬来参与抑制WSSV病毒的复制。Pull-down和体外泛素化实验结果表明,PmTRIM50-like可以识别并泛素化WSSV的囊膜蛋白VP24、VP26和VP28。综合以上结果,本研究表明PmTRIM50-like可能通过自身介导的细胞自噬和泛素化来参与抑制WSSV的复制。本文首次报道了对虾TRIM家族蛋白在病毒感染和细胞自噬中的作用。2.TRIM9通过参与负调控斑节对虾Relish信号通路来促进副溶血弧菌感染TRIM9在调节先天免疫信号通路中发挥重要作用。本研究中,我们从斑节对虾中克隆了一个TRIM9基因类似物,将其命名为PmTRIM9。PmTRIM9具有一个长度为2064 bp的开放阅读框,编码一个长度为687个氨基酸的蛋白质。PmTRIM9含有一个RING结构域,2个B-Box结构域、一个Coiled-coil结构域、一个fibronectin type Ⅲ repeat（FNⅢ）结构域和一个SPRY结构域。系统进化树结果表明,PmTRIM9和凡纳滨对虾的TRIM9进化关系最近,与其聚为一支。通过qRT-PCR检测发现,PmTRIM9在肠道和脑组织中的相对表达量较高。副溶血弧菌感染对虾后,PmTRIM9的mRNA在肠道和血细胞中表达水平显着降低。这说明PmTRIM9可能与副溶血弧菌感染相关。为了探究PmTRIM9的功能,我们向对虾注射PmTRIM9的干扰RNA和重组蛋白。结果表明干扰PmTRIM9的表达能抑制副溶血弧菌在斑节对虾中的繁殖,提高对虾感染副溶血弧菌后的成活率。注射PmTRIM9的重组蛋白后能促进副溶血弧菌在斑节对虾中的繁殖,降低对虾感染副溶血弧菌后的成活率。这说明PmTRIM9在斑节对虾中能促进副溶血弧菌的感染。双荧光素酶报告检测结果表明PmTRIM9在HEK293T细胞中具有抑制NF-κB启动子活性的能力。体内实验结果表明敲低PmTRIM9表达可以增加对虾核转录因子PmRelish的表达。通过实验结果我们发现斑节对虾PmRelish参与感染副溶血弧菌的过程,并在对虾体内发挥抑制副溶血弧菌感染的作用。进一步的RNA干扰实验表明,干扰PmRelish会促进副溶血弧菌感染,并降低包括PmCRU5,PmCRU7,PmALF6,PmALF3,PmLYZ和PmPE5在内的特定的抗菌肽（AMPs）的表达。然而,PmCRU5除外,干扰PmTRIM9却增加了PmCRU7,PmALF6,PmALF3,PmLYZ和PmPEN5抗菌肽的表达,这表明PmTRIM9可能负调控PmRelish介导的抗菌肽的表达。综上所述,PmTRIM9可能通过参与抑制斑节对虾的Relish信号通路来促进副溶血弧菌的感染。
蒋瑶[6]（2021）在《人源和斑马鱼源PKA alpha催化亚基蛋白的原核表达及体外特性比较研究》文中认为蛋白激酶A（PKA）是真核细胞中普遍存在的一种磷酸化激酶,参与调控多种细胞内信号传导事件。实验室前期研究表明,杀菌剂戊唑醇可抑制斑马鱼体内雌激素E2的生物合成,从而对斑马鱼造成生殖内分泌干扰效应。前期基于H295R细胞的体外试验及基于人源PKAα催化亚基（hPKAcα）的表面等离子共振（SPR）结合试验表明,戊唑醇可通过与PKAcα结合来抑制PKA的活性,从而干扰其细胞内c AMP/PKA通路的信号传导,抑制芳香化酶CYP19A的表达,产生抗雌激素效应。然而,尽管PKAcα一级结构在进化上高度保守（hPKAcα与斑马鱼PKAcα（zPKAcα）二者同源性为94%）,但戊唑醇与hPKAcα结合反应,不能完全真实反映戊唑醇与zPKAcα的结合情况。因此,本论文通过原核表达获得了hPKAcα与zPKAcα蛋白,并在此基础上对其体外特性展开相应比较研究。具体结果如下:（1）为在体外获得有活性的hPKAcα与zPKAcα蛋白,首先构建了原核表达载体p EASY-Blunt E2-PRKACA和p ET-28a-prkacaa。优化表达条件后,在25℃,4 h以及25℃,6 h的诱导条件下,用0.5 mmol/L IPTG诱导分别获得了大量表达的可溶性重组人源hPKAcα蛋白和重组斑马鱼源zPKAcα蛋白。经PKA酶活试剂盒检测证明两种重组蛋白均具有磷酸化活性,可用于体外实验,且重组纯化的hPKAcα活性比zPKAcα略高。（2）将zPKAcα蛋白免疫新西兰白兔,制备得到了高效价（1:1024000）的抗zPKAcα蛋白的多克隆抗体,经Western-blot验证该抗体能够有效识别斑马鱼源zPKAcα蛋白。后利用免疫分析探究了商品化抗hPKAcα蛋白的多克隆抗体和制备所得抗zPKAcα蛋白的多克隆抗体分别对重组hPKAcα蛋白和重组zPKAcα蛋白的免疫亲和性。Western-blot和ELISA实验结果表明两种抗体均能与两种重组蛋白发生结合反应。将同种抗体对两种PKAcα蛋白抗原的OD450-浓度对数曲线进行线性拟合,同取OD450=1.0时的抗原浓度值进行比较,发现抗hPKAcα抗体所得曲线中,CzPKAcα:ChPKAcα=1.075;抗zPKAcα抗体所得曲线中,ChPKAcα:CzPKAcα=1.950,同一种抗体与两种重组PKAcα蛋白进行ELISA试验的免疫亲和性相似,证明两种蛋白在免疫反应中具有高交叉性。（3）以PDB数据库中筛得同源性相对最高的几个物种的PKAcα结构作为模板,其中包括已知结构的人类（Homo sapiens）PKAcα蛋白,对zPKAcα催化亚基蛋白的三维结构进行了同源建模并评估优化后选择了一种最为合理的预测结构。利用分子对接技术分别模拟了戊唑醇与zPKAcα蛋白和hPKAcα蛋白的结合情况,并与阳性对照PKA抑制剂H89作对比,结果表明戊唑醇与两种来源的PKAcα蛋白都具有一定的结合性。综上,本实验证明了hPKAcα和zPKAcα两种蛋白在抗原抗体反应中具有相似的免疫亲和力,并模拟证明戊唑醇与这两种蛋白都有一定的结合性,为深入探究戊唑醇与其结合情况奠定了理论基础。
赵婷婷[7]（2021）在《日本七鳃鳗SLP-76基因的克隆表达、抗体制备及相关免疫学研究》文中提出含有SH2结构域的76 k Da的白细胞蛋白（SLP-76）分子作为存在于许多造血细胞谱系中的衔接蛋白,其蛋白序列中含有3个特征结构域,如N-末端的不育α基序（sterile alpha motif,SAM）结构域、C-末端的Src家族同源2（Src homology 2,SH2）结构域和位于二者之间的富含脯氨酸结构域（proline-rich region,PRR）。SLP-76对T细胞受体（TCR）和其偶联蛋白的下游信号传导至关重要。圆口纲（Cyclostomata）的七鳃鳗是无颌脊椎动物的代表,因其可变淋巴受体（variable lymphocyte receptor,VLR）介导的适应性免疫防御系统,受到免疫学家的广泛关注。为探索SLP-76分子在七鳃鳗中的存在及其功能,我们开展了以下工作。本文以日本七鳃鳗（Lampetra japonica）外周血淋巴细胞的总RNA为模板,扩增出七鳃鳗SLP-76分子（Lja-SLP76）的ORF区序列,其编码区长1590bp,编码一个含有529个氨基酸的蛋白质。对其蛋白质序列及结构进行了预测和分析,发现Lja-SLP76与脊椎动物SLP-76分子一样具有三个保守的特征结构域,且具有较高的序列一致性。说明我们在无颌类脊椎动物七鳃鳗中发现SLP-76家族分子。采用QPCR方法检测了Lja-SLP76 m RNA在混合菌刺激12h后的七鳃鳗免疫相关组织的差异表达,发现刺激后其转录水平在外周血淋巴细胞和鳃囊中出现显着性上调表达,说明Lja-SLP76参与了七鳃鳗免疫应答过程。通过抗原表位预测,设计制备Lja-SLP76蛋白分子抗体的抗原区段。利用原核表达体系对截短Lja-SLP76抗原区段进行重组表达并利用亲和层析方法进行了纯化,获得截短Lja-SLP76重组蛋白。以截短Lja-SLP76重组蛋白作为抗原,对健康的新西兰兔进行免疫制备多克隆抗体,经5次加强免疫,最终获得效价高达1:128 000的兔抗Lja-SLP76多克隆抗体。通过免疫印迹实验检测了在LPS、PHA和混合菌刺激24h后七鳃鳗Lja-SLP76分子在免疫相关组织中的表达情况。结果发现,Lja-SLP76在七鳃鳗的外周血淋巴细胞中的表达均出现显着性下调,但是Lja-SLP76分子在LPS刺激后在鳃囊和髓样小体中出现显着性上调表达。通过免疫共沉淀技术确定了Lja-SLP76蛋白质与肌联蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白、细胞角蛋白、氧化型低密度脂蛋白和糖基转移酶蛋白等膜蛋白存在相互作用,说明Lja-SLP76分子可能与信号转导复合体的膜定位密切相关。我们的研究结果为继续深入研究Lja-SLP76分子参与VLR受体的信号转导的分子机制奠定了基础。
柳颖[8]（2020）在《杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制》文中研究指明目前,农药残留问题仍然是食品安全领域的焦点问题,迫切需要建立快速、可靠的残留分析方法。免疫分析方法以其灵敏度高、检测迅速、易操作等特点,在快速诊断领域占有巨大市场。杂交瘤细胞作为制备免疫分析法的核心元件单抗的主要工程细胞,具有制备技术成熟、抗体表达量多、抗体特异性高等优势。本研究对体外培养条件下,杂交瘤细胞表达农药特异性抗体及其调控机制进行探究,为提高杂交瘤细胞的稳定性以及抗体表达量提供理论基础。研究内容与结果:（1）以百菌清（BJQ）特异性杂交瘤细胞为研究对象,表征了培养过程中出现不分泌特异性抗体的转阴现象,表现为增殖加快、不表达抗体轻链和/或重链蛋白,并对抗体基因及其转录表达进行比对分析,发现阴性细胞特异性抗体基因序列丢失或未丢失但表达量显着下调。（2）选择BJQ抗体基因表达量显着下调的对数生长期的D4细胞株与阳性细胞株E2进行转录组比较分析,发现D4癌基因Pet2上调,抑癌基因Lrig1下调;RNAi验证发现与囊泡转运相关基因Vapa、浆细胞分化关键因子Prdm1以及转录因子Foxb1与抗体表达显着相关。（3）利用CRISPR library对百菌清杂交瘤细胞进行全基因组基因编辑,利用农药压力筛选和流式分选方式对CRISPR敲除细胞文库进行抗体表达升高和降低的全生长周期细胞筛选,对富集的功能基因进行分析和归纳:调控杂交瘤细胞抗体表达的主要“油门”基因为抑癌基因Hivep3、Lrig1,MAPK通路基因Grap、Kras,转录调控因子Cebpb、Foxb1、Prdm1、Prdm2、Pax5,囊泡转运相关蛋白Rab12、Vapa、Vapb;主要“刹车”基因为促癌基因Pet2、Rad51、Rad50、Wnt2、Relb,抑制凋亡的基因Ucp2、Perp,促进周期进程的基因cdc25b、Id1、Plk2、Cdkl2,细胞周期进程中的周期蛋白和激酶,胞间信号传导相关的基因Rabgef1,MAPK及上游受体通路基因Rgs4、Gapt、Ralb、Rasef,PI3k/Akt通路中的基因Akt3。其中Foxb1、Prdm1、Vapa为si RNA干扰验证基因,与抗体表达成显着正向关,Pet2、Ccnd2为sh RNA干扰验证基因,与抗体表达呈显着负相关;并通过Erk/MAPK信号通路调控细胞周期和抗体基因表达。（4）对百菌清免疫各阶段的小鼠脾脏细胞进行转录组分析,发现百菌清刺激后,B细胞激活、增殖和分化为浆细胞的过程主要通过BCR级联的Ras-Erk/MAPK信号通路,启动细胞生长及抗体基因表达,与杂交瘤细胞主要通路一致。（5）对杂交瘤细胞抗体表达及调控机制进行归纳:杂交瘤细胞融合了B细胞表达特异性抗体的基因功能及SP2/0细胞不断增殖分裂的功能,在体外培养阶段两者同步进行并互相制约,通过Erk/MAPK通路及上下游相关调控因子进行细胞生长及抗体表达的调控;平台生长期细胞增殖的抑制可以促进抗体的表达,而因基因突变导致的细胞增殖异常加快会抑制抗体的表达。本研究表征了杂交瘤细胞抗体基因及其表达的多样性,探讨了百菌清特异性杂交瘤细胞抗体的表达及调控机制,明确了主要关键调控因子和信号通路,该研究为进一步提高杂交瘤细胞特异性抗体表达的稳定性及产量提供一定的理论基础。
王倩倩[9]（2020）在《沙棘木蠹蛾幼虫EhHsp90-1和EhHsp90-2基因的克隆表达及EhHsp90-1基因RNA干扰体系的构建》文中进行了进一步梳理沙棘木蠹蛾Eogystia hippophaecola（Hua,Chou,Fang&Chen）隶属鳞翅目Lepidoptera、木蠹蛾科Cossidae的Eogystia属,是中国特有的严重危害内蒙、辽宁、宁夏等地区人工沙棘林Hippophae rhamnoides生态和经济效益的钻蛀性害虫,主要以幼虫取食沙棘的根部和干部,能够在沙棘根部越冬,具有较强的耐寒能力。而热激蛋白90（Heat-shock proteins 90,Hsp90）与昆虫的高低温耐受能力密切相关。为了揭示沙棘木蠹蛾幼虫耐受寒冷的适应机制,本研究基于转录组深度测序结果筛选出两条Hsp90基因并进行克隆,分别命名Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2;利用q RT-PCR技术分析了两个Hsp90基因在沙棘木蠹蛾幼虫遭受低温胁迫时的表达规律;将克隆测序正确的Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2基因连接到p ET30a原核表达载体且成功表达目的蛋白;比较不同ds RNA注射剂量和干扰时间对Eh Hsp90-1基因的RNA干扰（RNA interference,RNAi）效率的影响。结果如下:1.获得了Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2基因完整的开放阅读框（Open read frame,ORF）和氨基酸序列。Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2基因ORF全长分别为2154bp和2346bp,编码717和781个氨基酸,预测其分子量为82.5KDa和88.8KDa。两条基因序列均包含Hsp90家族的特征序列,依据C端的特征序列可分为细胞质型Hsp90和内质网型Hsp90,且与多种鳞翅目昆虫的Hsp90氨基酸序列有较高的同源性,表明Hsp90具有高度保守性。2.明确了Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2基因在同一时间不同温度和同一温度不同时间下的表达规律。在不同低温胁迫2h的处理后,Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2的表达规律相似,均表现为先上升后下降。而在-5℃胁迫不同时间后,Eh Hsp90-1在低温胁迫12h后出现表达量显着上调,而Eh Hsp90-2是快速响应的热激蛋白,在胁迫1h后显着上调,2h达到最高,但整体上调水平相比Eh Hsp90-1较低,表明Eh Hsp90-1基因在沙棘木蠹蛾幼虫应对低温胁迫的响应中发挥更显着的作用。3.诱导了Eh Hsp90-1和Eh Hsp90-2蛋白在体外的准确表达。将两个基因与p ET30a表达载体连接并成功转入大肠杆菌,通过IPTG诱导后均在上清液中检测到预期分子量的重组蛋白,表明两个热激蛋白成功在体外表达且均为可溶性蛋白。利用制备的多克隆抗体对沙棘木蠹蛾幼虫体内的Hsp90蛋白进行免疫印迹检测,得到很好的特异性结合,表明基因克隆序列准确且蛋白表达成功。4.初步构建了Eh Hsp90-1基因有效的RNAi体系。比较不同ds RNA注射剂量和干扰时间下Eh Hsp90-1基因的表达量,得出能够有效干扰Eh Hsp90-1基因的体系为注射5μg（1μg/μL）ds RNA以及持续干扰72h的结果,为后续进一步分析基因功能提供参考。
张明天[10]（2020）在《家蚕质型多角体病毒诱导细胞自噬的分子机理》文中提出家蚕质型多角体病毒（Bombyx mori cypovirus,BmCPV）属于呼肠弧病毒（reovirus）。BmCPV能感染家蚕中肠细胞引起质型多角体病,导致蚕茧歉收。细胞自噬（autophagy）是真核生物通过分解代谢维持细胞稳态的一种生命现象,也是机体一种非常重要的保护和防御机制。目前为止,BmCPV感染与宿主防御机制的相互作用关系尚不明确。BmCPV感染与细胞自噬的研究对于理解病毒与宿主的相互作用机制有重要的意义。1.BmCPV感染可以诱导家蚕细胞发生自噬本研究通过透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）观察,研究了 BmCPV感染的家蚕中肠细胞的病理学变化,在感染细胞中观察到自噬体样的结构;LC3全称为微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated proteins light chain 3,MAP1LC3）,可以标记自噬体的形成,被用做自噬的标记物。将指示自噬体形成的pIZ-EGFP-LC3质粒转染家蚕卵巢（B.mori ovarian,BmN）细胞,发现BmCPV感染能明显增加细胞内自噬体的数量;Western Blotting检测结果显示,在BmCPV感染的BmN细胞以及家蚕中肠中,LC3-Ⅱ蛋白相对水平明显升高。这些结果表明,BmCPV感染可以诱导家蚕细胞发生自噬。2.BmCPV感染引起线粒体自噬为了探究BmCPV感染引起的自噬类型,通过TEM观察比较BmCPV感染的家蚕中肠和正常家蚕中肠细胞,在感染细胞中可观察到受损的线粒体和线粒体自噬体结构;利用特异性抗体,通过Western Blotting检测BmCPV感染BmN细胞中PINK1-Parkin 介导的线粒体自噬（mitochondrial autophagy,mitophagy）信号通路上相关蛋白相对水平的变化。Western Blotting检测结果显示,在BmCPV感染的BmN细胞中,PINK1、Parkin和P-Drp1蛋白相对水平明显升高,Tom20蛋白相对水平明显下降;进一步通过siRNA沉默Parkin和Drp1基因,发现Parkin基因沉默后,Parkin/α-tubulin 比值显着下降,LC3-Ⅱ/α-tubulin 比值显着下降;Drp1基因沉默后,P-Drp1/α-tubulin 比值显着下降,LC3-Ⅱ/a-tubulin 比值下降。这些结果表明,BmCPV感染引起细胞线粒体自噬;阻断线粒体自噬通路抑制病毒感染引起的自噬。3.自噬助益BmCPV的增殖为了探究BmCPV感染与自噬的关系,选用经典自噬诱导剂雷帕霉素（rapamycin,Rap）和经典自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤（3-methyl adenine,3-MA）,分别处理BmN细胞,尔后感染BmCPV。当用Rap处理BmN细胞时,Western Blotting结果显示BmCPV结构蛋白VP4/α-tubulin的水平显着升高,qPCR结果显示BmCPV vp1基因的表达水平升高。而当BmN细胞用3-MA处理时,Western Blotting和qPCR出现相反的结果。这些结果表明BmCPV感染引起的细胞自噬对病毒的增殖有促进作用。4.BmCPV结构蛋白VP4是引起自噬的关键蛋白为了明确BmCPV感染引起自噬的关键病毒蛋白,选用LC3-EGFP-mCherry融合蛋白标记自噬体。用pIZT-CS1-pIZT-CS10 10个不同的病毒蛋白表达质粒转染pIZ-LC3-EGFP-mCherry BmN细胞。结果显示,病毒VP4蛋白可以显着增加自噬体的数量。此外,Western Blotting结果显示,在VP4过表达的BmN细胞中,PINK1,Parkin和P-Drp1蛋白的水平显着增加,而Tom20蛋白的水平则相反地降低,与BmCPV感染的BmN细胞的结果一致。这些结果表明,编码结构蛋白VP4的BmCPV是诱导线粒体吞噬的关键蛋白之一。
二、RAP蛋白的纯化和抗体制备（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RAP蛋白的纯化和抗体制备（论文提纲范文）
（1）转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 血栓性疾病与溶栓药物的研究进展 |
| 1.1 血栓的概述及溶栓机理 |
| 1.2 去氨普酶(DSPA)研究进展 |
| 1.3 其它生物溶栓药物的研究进展 |
| 1.4 问题及展望 |
| 2 乳腺生物反应器研究进展 |
| 2.1 乳腺生物反应器简介 |
| 2.2 乳腺生物反应器优势 |
| 2.3 作为乳腺生物反应器的常用动物 |
| 2.4 乳腺生物反应器应用 |
| 2.5 问题与展望 |
| 3 蛋白质分离纯化研究进展 |
| 3.1 蛋白质分离纯化概述及其常用技术 |
| 3.2 乳腺生物反应器生产的重组蛋白的分离纯化 |
| 3.3 DSPA的分离纯化 |
| 3.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 乳腺特异性表达rDSPA转基因兔的传代繁殖 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 常用试剂的配制 |
| 1.5 DSPA编码区设计 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 2.2 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 2.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔传代扩群 |
| 3.2 rDSPA转基因兔后代测交 |
| 3.3 rDSPA转基因兔乳中rDSPA体外活性检测 |
| 3.4 rDSPA转基因兔乳中rDSPA表达水平检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 原核表达去氨普酶(DSPA)基因载体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 DSPA功能基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增pCL25/DSPA表达载体 |
| 2.3 PCR产物和表达载体双酶切 |
| 2.4 PCR产物和表达载体酶切产物纯化 |
| 2.5 DSPA与pET-28a表达载体连接 |
| 2.6 DSPA与pET-28a表达载体连接产物转化TOP10 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 pET-28a/DSPA重组质粒提取 |
| 2.9 pET-28a/DSPA重组质粒转化Rosetta |
| 2.10 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达 |
| 2.11 亲和层析柱纯化DSPA |
| 2.12 蛋白透析 |
| 2.13 浓缩及定量 |
| 3 结果 |
| 3.1 pCL25/DSPA表达载体的构建 |
| 3.2 pET-28a/DSPA原核表达载体诱导DSPA蛋白表达及可溶性鉴定 |
| 3.3 Ni-NTA Resin亲和层析柱纯化DSPA |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第三章 rDSPA单克隆抗体制备及筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物及免疫原 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及材料 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠免疫 |
| 2.2 小鼠血清检测 |
| 2.3 细胞融合 |
| 2.4 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 2.5 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化 |
| 2.6 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 2.7 阳性杂交瘤细胞的扩大培养和冻存 |
| 2.8 rDSPA单克隆抗体(PR-mAb)的大量制备 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫小鼠血清检测 |
| 3.2 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.3 阳性杂交瘤细胞株的单克隆化鉴定结果 |
| 3.4 多羟基反应单克隆抗体(PR-mAb)的筛选 |
| 3.5 小鼠腹水抗体制备及腹水抗体ELISA检测 |
| 3.6 小鼠腹水抗体纯化及SDS-PAGE蛋白电泳检测 |
| 3.7 纯化抗体的ELISA检测 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第四章 转基因兔乳中rDSPA的纯化 |
| 1 材料 |
| 1.1 纯化原料 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 兔乳前处理 |
| 2.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 2.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 2.4 小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 2.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 2.10 纯化产物脱盐 |
| 2.11 FAPA 法检测rDSPA |
| 2.12 SDS-PAGE检测rDSPA |
| 2.13 Western Blot检测rDSPA |
| 2.14 纯化产物纯度测试 |
| 2.15 纯化产物去除内毒素 |
| 2.16 纯化产物内毒素检测 |
| 2.17 rDSPA注射剂配制 |
| 3 结果 |
| 3.1 兔乳前处理 |
| 3.2 硫酸铵沉淀兔乳清蛋白 |
| 3.3 DSPA及兔乳清蛋白等电点预测 |
| 3.4 纯化小鼠单抗与亲和介质的偶联 |
| 3.5 免疫亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.6 强阳离子交换层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.7 苯甲醚亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.8 赖氨酸亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.9 活性蓝亲和层析法纯化转基因兔乳中rDSPA |
| 3.10 转基因兔乳中rDSPA的最终纯化方案 |
| 3.11 纯化产物脱盐 |
| 3.12 纯化产物SDS-PAGE及Western Blot检测 |
| 3.13 纯化产物纯度测试 |
| 3.14 纯化产物去除内毒 |
| 3.15 纯化产物内毒素检测 |
| 3.16 DSPA注射剂配制 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 第五章 乳腺特异性表达rDSPA纯化产物的结构和功能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂及耗材 |
| 2 方法 |
| 2.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 2.2 蛋白质N端测序 |
| 2.3 蛋白质C端测序 |
| 2.4 相对分子量测序 |
| 2.5 纯化产物体蛋白三维结构模拟 |
| 2.6 纯化产物体外活性测试 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA转基因兔乳汁中rDSPA信号肽序列切割位点预测 |
| 3.2 蛋白质N端测序 |
| 3.3 蛋白质C端测序 |
| 3.4 相对分子量测序 |
| 3.5 纯化产物蛋白三维结构模拟 |
| 3.6 纯化产物体外活性测试 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文 |
| 第六章 rDSPA体内外溶栓效果的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 检测样品 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 实验试剂及耗材 |
| 1.5 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 体外血凝块溶解试验 |
| 2.2 角叉菜胶制备大鼠尾部血栓模型 |
| 2.3 体内溶栓试验 |
| 2.4 大鼠血浆rDSPA半衰期试验 |
| 2.5 数据统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 rDSPA体外血凝块溶解效果评价 |
| 3.2 大鼠尾部血栓模型制备结果 |
| 3.3 rDSPA对大鼠尾部血栓模型溶栓效果评价 |
| 3.4 大鼠血浆rDSPA半衰期评价 |
| 4 讨论 |
| 5 参考文献 |
| 全文结论 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）基于羊巴贝斯虫球状体蛋白3（SBP3）基因的检测方法建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 巴贝斯虫病概述 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 巴贝斯虫病临床特征与治疗 |
| 1.1.3 中国羊巴贝斯虫病概况及流行病学 |
| 1.2 巴贝斯虫病诊断技术研究进展 |
| 1.2.1 病原学检查技术 |
| 1.2.2 血清学检测 |
| 1.2.3 分子生物学检测 |
| 1.3 球状体蛋白研究进展 |
| 1.3.1 顶复门原虫入侵过程 |
| 1.3.2 巴贝斯虫膜表面相关蛋白研究概况 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第二章 我国羊巴贝斯虫SBP3 基因克隆与生物信息学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DNA 的提取及cDNA 的制备 |
| 2.2.2 pBluescriptⅡ SK(+)载体的线性化 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 SBP3 基因的扩增 |
| 2.2.5 SBP3 基因与pBluescriptⅡ SK(+)载体的连接和转化 |
| 2.2.6 羊巴贝斯虫SBP3 基因序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 羊巴贝斯虫SBP3 基因的扩增 |
| 2.3.2 羊巴贝斯虫SBP3 基因序列分析 |
| 2.3.3 基于巴贝斯虫SBP3 的遗传进化树构建 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 基于SBP3 基因的分子检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 基因组DNA |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物的设计 |
| 3.2.2 荧光定量PCR条件优化及标准曲线的建立 |
| 3.2.3 巢式PCR反应体系及反应条件的优化 |
| 3.2.4 HRM的标准样品分析 |
| 3.2.5 三种分子检测方法的特异性评价 |
| 3.2.6 三种分子检测方法的敏感性评价 |
| 3.2.7 三种分子检测方法的重复性验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 荧光定量PCR条件优化及标准曲线的绘制 |
| 3.3.2 巢式PCR扩增 |
| 3.3.3 巢式PCR反应的优化 |
| 3.3.4 HRM的标准样品分析结果 |
| 3.3.5 三种分子检测方法的特异性评价 |
| 3.3.6 三种分子检测方法的敏感性评价 |
| 3.3.7 三种分子检测方法的重复性验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 球状体蛋白3 的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 羊巴贝斯虫SBP3 蛋白特性分析 |
| 4.2.2 引物的设计与合成 |
| 4.2.3 pET-28a表达载体的线性化 |
| 4.2.4 SBP3 基因的扩增 |
| 4.2.5 pET-28a-BXJSBP3 原核表达载体的构建 |
| 4.2.6 重组SBP3 蛋白的诱导表达 |
| 4.2.7 重组SBP3 蛋白的纯化及浓度测定 |
| 4.2.8 动物免疫 |
| 4.2.9 多克隆抗体的Western blot分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 羊巴贝斯虫SBP3 蛋白特性分析 |
| 4.3.2 基因的扩增及原核表达载体的构建 |
| 4.3.3 重组SBP3 蛋白的表达纯化 |
| 4.3.4 多克隆抗体的Western blot分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 附录C |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）羊巴贝斯虫自噬相关基因结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 巴贝斯虫 |
| 1.1.1 我国羊巴贝斯虫的分离与鉴定 |
| 1.1.2 我国羊巴贝斯虫的分布情况 |
| 1.1.3 巴贝斯虫的体外培养 |
| 1.1.4 顶复门原虫基因功能研究技术现状 |
| 1.2 顶质体研究进展 |
| 1.2.1 顶质体的发现与起源 |
| 1.2.2 顶质体的基因组 |
| 1.2.3 顶质体的生物学功能 |
| 1.2.3.1 顶质体II型脂肪酸生物合成 |
| 1.2.3.2 顶质体铁硫簇生物合成 |
| 1.2.3.3 顶质体血红素生物合成 |
| 1.2.3.4 顶质体类异戊二烯生物合成 |
| 1.3 自噬 |
| 1.3.1 经典自噬途径 |
| 1.3.2 疟原虫及弓形虫自噬的研究现状 |
| 1.3.3 感染疟原虫或弓形虫宿主细胞自噬研究现状 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 梨形虫ATG生物信息学分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 梨形虫ATG基因的生物信息学分析及扩增 |
| 2.2.2 梨形虫ATG序列比对及相似性分析 |
| 2.2.3 遗传进化分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 梨形虫ATG基因的分布 |
| 2.3.2 梨形虫ATG氨基酸序列比对分析 |
| 2.3.3 基于顶复门原虫ATG氨基酸序列构建的遗传进化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 羊巴贝斯虫顶质体与线粒体基因组序列测定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 DNA的提取 |
| 3.2.2 顶质体和线粒体基因组的扩增与测序 |
| 3.2.3 顶质体和线粒体基因组的拼接与注释 |
| 3.2.4 cytb基因序列比对 |
| 3.2.5 系统发育分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 顶质体和线粒体基因组序列分析 |
| 3.3.2 羊巴贝斯虫顶质体和线粒体基因组与其他顶复门原虫比对分析 |
| 3.3.3 Sanger与Illumina方法测序的顶质体和线粒体基因组比对分析 |
| 3.3.4 cytb基因序列分析 |
| 3.3.5 系统进化分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 顶质体基因组 |
| 3.4.2 线粒体基因组 |
| 第四章 羊巴贝斯虫未定种新疆株瞬时和稳定转染体系的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 羊巴贝斯虫未定种新疆株体外培养 |
| 4.2.2 评估BSD对羊巴贝斯虫未定种新疆株抑制效果 |
| 4.2.3 质粒的构建 |
| 4.2.4 BspXJ启动子活性分析 |
| 4.2.5 BspXJ稳定转染虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 BspXJ启动子活性分析 |
| 4.3.2 BspXJ稳定转染虫株的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 BspXJ瞬时转染 |
| 4.4.2 BspXJ稳定转染 |
| 第五章 ATG蛋白亚细胞定位分析及互作蛋白的鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要仪器 |
| 5.1.2 实验材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 BspXJ的ATG、顶质体Marker分子基因的扩增 |
| 5.2.2 ATG和顶质体Marker分子基因分析 |
| 5.2.3 原核表达载体的构建 |
| 5.2.4 蛋白诱导表达及纯化 |
| 5.2.5 抗体的制备及鉴定 |
| 5.2.6 ATG3与ATG8过表达质粒的构建 |
| 5.2.7 ATG3与ATG8过表达虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 5.2.8 ATG3与ATG8亚细胞定位 |
| 5.2.9 ATG3和ATG8互作蛋白的鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 目的基因分析 |
| 5.3.2 重组蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 5.3.3 抗体纯化及鉴定 |
| 5.3.4 ATG3过表达虫株PCR、WB、IFA及 q PCR鉴定 |
| 5.3.5 ATG8过表达虫株PCR、WB、IFA及 q PCR鉴定 |
| 5.3.6 ATG3和ATG8在BspXJ中的亚细胞定位 |
| 5.3.7 ATG3与ATG8相互作用蛋白鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 自噬抑制剂和诱导剂对羊巴贝斯虫ATG表达丰度的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 主要仪器 |
| 6.1.2 实验材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 筛选BspXJ自噬抑制剂及诱导剂最佳工作浓度 |
| 6.2.2 qPCR检测HBSS饥饿诱导BspXJ后ATG基因表达丰度 |
| 6.2.3 自噬抑制剂和诱导剂处理BspXJ后ATG基因表达丰度的影响 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 BspXJ自噬抑制剂及诱导剂最佳工作浓度 |
| 6.3.2 饥饿诱导对BspXJ的ATG基因表达丰度的影响 |
| 6.3.3 自噬抑制剂和诱导剂对BspXJ的ATG基因表达丰度的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 羊巴贝斯虫ATG基因敲除虫株的构建及条件性基因敲除平台的建立 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 主要仪器 |
| 7.1.2 实验材料 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 ATG基因敲除虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 7.2.2 TIR1表达虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 7.2.3 IAA对BspXJ虫株生长的影响 |
| 7.2.4 mCherry-AID-3HA表达虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 7.2.5 IAA调控mCherry蛋白表达水平的检测 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 ATG3和ATG8 基因敲除虫株的筛选及鉴定 |
| 7.3.2 TIR1-3Flag表达虫株的PCR、WB及 IFA鉴定结果 |
| 7.3.3 IAA对BspXJ形态及染虫率的影响 |
| 7.3.4 m Cherry-AID-3HA虫株WB及IFA鉴定 |
| 7.3.5 IAA调控mCherry蛋白表达水平的检测 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A ATGs氨基酸比对结果 |
| 附录B 顶质体基因组扩增引物、线粒体基因组比对图和顶质体基因组图 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）p62/Keap1-Nrf2途径介导自噬促进贝类抗氧化应激研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 p62/Keap1-Nrf2通路 |
| 1.2.1 p62基因的概述 |
| 1.2.2 Keap1-Nrf2信号通路抗氧化应激 |
| 1.2.3 p62/Keap1-Nrf2信号通路的研究进展 |
| 1.3 细胞自噬的研究进展 |
| 1.4 细胞自噬与凋亡之间的串扰 |
| 1.4.1 p62串扰自噬和凋亡 |
| 1.4.2 氧化应激、自噬和凋亡串扰的调控机制 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第2章 贝类Keap1-Nrf2通路的抗氧化应激作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验样品处理 |
| 2.2.4 组织模板cDNA的制备 |
| 2.2.5 CpNrf2和CpKeap1a mRNA的表达 |
| 2.2.6 MC胁迫下Cp Nrf2蛋白的表达 |
| 2.2.7 MC胁迫下褶纹冠蚌相关酶活性测定 |
| 2.2.8 荧光素酶报告基因分析CpNQO1启动子活性 |
| 2.2.9 体内分析CpNrf2与CpKeap1a、CpKeap1b及亚型二聚体的形成 |
| 2.2.10 体外检测CpKeap1a与CpKeap1b二聚体的形成 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CpNrf2和CpKeap1a mRNA的表达 |
| 2.3.2 CpNrf2蛋白的表达 |
| 2.3.3 肝胰腺GOT和GPT活性测定 |
| 2.3.4 相关抗氧化酶活性测定 |
| 2.3.5 MC和CpNrf2对CpNQO1基因启动子活性的影响 |
| 2.3.6 体内CpKeap1a蛋白与CpKeap1b蛋白的互作 |
| 2.3.7 体外CpKeap1a与CpKeap1b二聚体的形成 |
| 2.3.8 体内CpNrf2与CpKeap1a、CpKeap1b的相互结合 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 Keap1-Nrf2途径介导p62促进贝类抗氧化应激 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物与材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 引物序列 |
| 3.2.4 Cpp62cDNA全长克隆 |
| 3.2.5 Cpp62基因的结构特征分析 |
| 3.2.6 Cpp62基因组织特异性表达 |
| 3.2.7 Cpp62原核表达和蛋白纯化 |
| 3.2.8 Cpp62蛋白抗体制备 |
| 3.2.9 MC胁迫下Keap1-Nrf2途径对Cpp62表达的影响 |
| 3.2.10 Cpp62基因启动子的克隆 |
| 3.2.11 CpNrf2蛋白与Cpp62启动子的亲和分析 |
| 3.2.12 CpNrf2蛋白对Cpp62启动子活性的调控 |
| 3.2.13 检测ARE元件突变的Cpp62启动子活性 |
| 3.2.14 考察Cpp62对CpNrf2mRNA和蛋白表达的调控 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 肝胰腺总RNA的提取 |
| 3.3.2 Cpp62基因全长的克隆 |
| 3.3.3 Cpp62序列及推导的氨基酸序列 |
| 3.3.4 Cpp62氨基酸推导序列的相似性比对 |
| 3.3.5 Cpp62系统发育分析 |
| 3.3.6 Cpp62基因的组织表达 |
| 3.3.7 Cpp62蛋白的原核表达、纯化及抗体制备 |
| 3.3.8 MC胁迫下Keap1-Nrf2途径对Cpp62的表达影响 |
| 3.3.9 Cpp62基因启动子的克隆 |
| 3.3.10 CpNrf2蛋白与Cpp62启动子的亲和性分析 |
| 3.3.11 CpNrf2蛋白对Cpp62启动子的活性调控 |
| 3.3.12 检测Cpp62启动子ARE元件突变后的活性 |
| 3.3.13 Cpp62对CpNrf2和CpNQO1表达的调控 |
| 3.3.14 Cpp62对CpNQO1和Cpp62启动子活性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 贝类p62/Keap1-Nrf2途径介导自噬促进抗氧化应激 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物与仪器 |
| 4.2.2 CpLC3基因cDNA全长克隆 |
| 4.2.3 CpLC3基因的结构特征分析 |
| 4.2.4 CpLC3基因组织特异性表达 |
| 4.2.5 MC诱导褶纹冠蚌自噬的发生 |
| 4.2.6 自噬对p62/Keap1-Nrf2通路关键基因表达调控 |
| 4.2.7 自噬对蚌抗氧化酶活性的影响 |
| 4.2.8 Cpp62与CpKeap1a的互作分析 |
| 4.2.9 Cpp62和CpNQO1启动子的活性检测 |
| 4.2.10 Cp LC3与CpKeap1a、Cpp62的细胞分布 |
| 4.2.11 Cpp62/CpKeap1a与 CpLC3之间的调控关系 |
| 4.2.12 COIP分析Cp LC3与CpKeap1、Cpp62的相互作用 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CpLC3基因序列及推导的氨基酸序列 |
| 4.3.2 CpLC3序列相似性比对及系统发育分析 |
| 4.3.3 CpLC3基因的组织表达 |
| 4.3.4 TEM观察自噬小体和自噬溶酶体 |
| 4.3.5 自噬对Cpp62mRNA和蛋白表达的影响 |
| 4.3.6 MC胁迫下自噬调控CpNrf2和Cpp62 mRNA的表达 |
| 4.3.7 自噬对抗氧化蛋白酶活性的影响 |
| 4.3.8 体外Cpp62与CpKeap1a的互作 |
| 4.3.9 CpKeap1对Cpp62和CpNQO1启动子活性的影响 |
| 4.3.10 CpKeap1a和自噬对CpLC3 mRNA表达的影响 |
| 4.3.11 TEM观察Cpp62对褶纹冠蚌自噬的影响 |
| 4.3.12 Cpp62对CpKeap1a和 CpLC3表达的调控 |
| 4.3.13 CpLC3与CpKeap1a、Cpp62的定位分析 |
| 4.3.14 CpLC3分别与Cpp62和CpKeap1b的相互作用 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 氧化应激诱发贝类细胞自噬与凋亡的交互 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验动物与仪器 |
| 5.2.2 CpBcl-2基因cDNA全长克隆 |
| 5.2.3 CpBcl-2基因的结构特征分析 |
| 5.2.4 qRT-PCR分析CpBcl-2mRNA的表达 |
| 5.2.5 Tunel实验检测细胞凋亡 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CpBcl-2基因序列及推导的氨基酸序列 |
| 5.3.2 CpBcl-2基因序列及推导的氨基酸序列 |
| 5.3.3 MC和自噬影响CpBcl-2mRNA的表达 |
| 5.3.4 Tunel检测MC和自噬引起的细胞凋亡 |
| 5.3.5 Cpp62对CpBcl-2mRNA的表达 |
| 5.3.6 调控Tunel检测Cpp62双链RNA干扰后细胞凋亡 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（5）TRIM50-like和TRIM9在斑节对虾先天免疫中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 对虾先天免疫系统简介 |
| 1.1.1 对虾Toll信号通路简介 |
| 1.1.2 对虾IMD信号通路简介 |
| 1.2 TRIM家族研究进展 |
| 1.2.1 TRIM家族简介 |
| 1.2.2 TRIM家族分类 |
| 1.2.3 TRIM家族在先天免疫信号通路中的作用 |
| 1.2.4 TRIM家族在细胞自噬中的作用 |
| 1.2.5 TRIM家族的抗病毒分子机制 |
| 1.2.6 TRIM家族的其它功能 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PmTRIM50-like基因克隆、重组表达及多克隆抗体制备 |
| 2.1 实验材料和方法 |
| 2.1.1 实验仪器,试剂和耗材 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 总RNA提取和cDNA的合成 |
| 2.1.4 PmTRIM50-like的cDNA克隆和序列分析 |
| 2.1.5 PCR产物胶回收 |
| 2.1.6 连接与转化 |
| 2.1.7 挑取单克隆和菌液PCR |
| 2.1.8 PmTRIM50-like的序列分析 |
| 2.1.9 PmTRIM50-like表达载体构建 |
| 2.1.10 PmTRIM50-like重组载体诱导和表达 |
| 2.1.11 SDS-PAGE电泳 |
| 2.1.12 Western Blotting |
| 2.1.13 PmTRIM50-like重组蛋白的纯化和多克隆抗体制备 |
| 2.1.14 PmTRIM50-like重组蛋白浓度测定 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 PmTRIM50-like cDNA克隆和分子结构特征分析 |
| 2.2.2 PmTRIM50-like的重组表达和多克隆抗体制备 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 PmTRIM50-like在感染WSSV过程中的功能解析 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 WSSV接种液的制备、注射及组织取样 |
| 3.1.2 组织总DNA提取 |
| 3.1.3 WSSV拷贝数检测 |
| 3.1.4 荧光定量PCR |
| 3.1.5 干扰RNA实验 |
| 3.1.6 过表达实验 |
| 3.1.7 Western blotting |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 WSSV感染后PmTRIM50-like的表达模式 |
| 3.2.2 干扰PmTRIM50-like表达对WSSV复制的影响 |
| 3.2.3 过表达PmTRIM50-like对WSSV复制的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 细胞自噬在WSSV感染中的作用 |
| 4.1 实验方法 |
| 4.1.1 注射实验设计 |
| 4.1.2 RNA提取和荧光定量PCR |
| 4.1.3 cDNA模板逆转录和荧光定量PCR |
| 4.1.4 透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM) |
| 4.1.5 免疫细胞荧光化学 |
| 4.1.6 Western blotting |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 WSSV感染和细胞自噬的关系 |
| 4.2.2 细胞自噬对WSSV复制的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 PmTRIM50-like在抗病毒细胞自噬中的作用 |
| 5.1 实验方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 PmTRIM50-like的表达水平和细胞自噬的关系分析 |
| 5.2.2 PmTRIM50-like参与调控细胞自噬分析 |
| 5.2.3 PmTRIM50-like在细胞自噬和WSSV感染之间的作用 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 PmTRIM50-like和WSSV囊膜蛋白体外互作和泛素化分析 |
| 6.1 实验方法 |
| 6.1.1 Pull down实验 |
| 6.1.2 体外泛素化实验 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 PmTRIM50-like和WSSV囊膜蛋白体外互作分析 |
| 6.2.2 PmTRIM50-like和WSSV囊膜蛋白体外泛素化分析 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 PmTRIM9在副溶血弧菌感染下的表达特征及免疫调节作用 |
| 7.1 实验材料和方法 |
| 7.1.1 实验仪器,试剂和耗材 |
| 7.1.2 实验动物 |
| 7.1.3 副溶血弧菌注射及组织取样 |
| 7.1.4 总RNA提取和cDNA的合成 |
| 7.1.5 PmTRIM9 cDNA克隆和序列分析 |
| 7.1.6 PmTRIM9重组蛋白的表达纯化 |
| 7.1.7 Western blotting分析 |
| 7.1.8 荧光定量PCR |
| 7.1.9 干扰RNA实验 |
| 7.1.10 注射实验的设计 |
| 7.1.11 免疫细胞化学 |
| 7.1.12 双荧光素酶报告分析 |
| 7.2 实验结果 |
| 7.2.1 PmTRIM9分子克隆和结构特征分析 |
| 7.2.2 PmTRIM8的组织表达分布 |
| 7.2.3 感染副溶血弧菌后Pm TRIM9的表达模式分析 |
| 7.2.4 PmTRIM9与副溶血弧菌感染的关系 |
| 7.2.5 PmTRIM9参与调节对虾Relish信号通路分析 |
| 7.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）人源和斑马鱼源PKA alpha催化亚基蛋白的原核表达及体外特性比较研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语和缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 cAMP依赖的蛋白激酶A研究进展 |
| 1.1.1 蛋白激酶A基因和蛋白的结构特征 |
| 1.1.2 蛋白激酶A抑制剂研究进展 |
| 1.2 蛋白原核表达研究进展 |
| 1.2.1 原核表达的启动子研究进展 |
| 1.2.2 提高可溶性表达的策略 |
| 1.3 多克隆抗体制备方法 |
| 1.4 同源建模与分子对接技术 |
| 1.4.1 同源建模技术 |
| 1.4.2 分子对接技术 |
| 1.5 戊唑醇的应用现状与内分泌干扰效应研究进展 |
| 1.6 研究内容及意义 |
| 1.6.1 研究目的及意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 研究设计(技术路线) |
| 1.7 课题来源 |
| 第二章 蛋白激酶Aα催化亚基的原核表达、纯化与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试药剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 质粒与菌株 |
| 2.1.4 主要溶液配方 |
| 2.1.5 对人源和鱼源PKAcα的生物信息学分析 |
| 2.1.6 hPKAcα蛋白的表达纯化与鉴定 |
| 2.1.7 zPKAcα蛋白的表达纯化与鉴定 |
| 2.1.8 重组hPKAcα和重组zPKAcα的活性比较 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 对人源和鱼源PKAcα蛋白的生物信息学分析 |
| 2.2.2 重组质粒pEASY Blunt-E2-PRKACA与pET-28a-prkacaa的构建 |
| 2.2.3 重组hPKAcα和重组zPKAcα的表达与鉴定 |
| 2.2.4 重组hPKAcα和重组zPKAcα的纯化 |
| 2.2.5 重组hPKAcα和重组zPKAcα的活性验证与比较 |
| 2.3 讨论与小结 |
| 2.3.1 讨论 |
| 2.3.2 小结 |
| 第三章 重组hPKAcα与zPKAcα体外抗原抗体反应交叉性检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试药剂 |
| 3.1.2 主要仪器及设备 |
| 3.1.3 zPKAcα多克隆抗体制备及纯化 |
| 3.1.4 间接ELISA测定抗zPKAcα抗体效价 |
| 3.1.5 抗zPKAcα多克隆抗体的纯化和浓缩 |
| 3.1.6 Western-blot检测两种重组蛋白的抗原抗体反应交叉性 |
| 3.1.7 ELISA检测两种重组蛋白的抗原抗体反应交叉性 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 重组蛋白多克隆抗体的效价检测 |
| 3.2.2 Western-blot检测两种重组蛋白的抗原抗体反应交叉性 |
| 3.2.3 ELISA检测两种重组蛋白的抗原抗体反应交叉性 |
| 3.3 小结 |
| 3.3.1 讨论 |
| 3.3.2 小结 |
| 第四章 计算机辅助zPKAcα和hPKAcα与戊唑醇分子虚拟对接 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 分析软件及在线工具 |
| 4.1.2 对人源和鱼源PKAcα蛋白的同源性分析 |
| 4.1.3 同源建模 |
| 4.1.4 分子对接 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 同源性分析 |
| 4.2.2 同源建模 |
| 4.2.3 重组zPKAcα与TEB的分子对接研究 |
| 4.2.4 重组hPKAcα与TEB的分子对接研究 |
| 4.3 小结 |
| 4.3.1 讨论 |
| 4.3.2 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 论文创新点 |
| 5.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间取得的科研成果 |
（7）日本七鳃鳗SLP-76基因的克隆表达、抗体制备及相关免疫学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 SLP-76概述 |
| 1.2 SLP-76的结构域 |
| 1.2.1 SAM结构域 |
| 1.2.2 SH2结构域 |
| 1.2.3 富含脯氨酸的结构域 |
| 1.3 SLP-76的各磷酸化位点 |
| 1.4 SLP-76参与的信号转导 |
| 1.4.1 SLP-76参与TCR信号通路 |
| 1.4.2 SLP-76参与BCR信号通路 |
| 1.4.3 SLP-76参与的其他通路 |
| 1.5 SLP-76与疾病的关系 |
| 1.6 七鳃鳗简介 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 2 日本七鳃鳗SLP-76基因的分子克隆及生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂与药品 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 日本七鳃鳗的外周血淋巴细胞提取 |
| 2.1.5 日本七鳃鳗的外周血淋巴细胞的总RNA的提取 |
| 2.1.6 mRNA的反转录 |
| 2.1.7 ORF区扩增引物设计 |
| 2.1.8 Lja-SLP76OFR区PCR扩增 |
| 2.1.9 扩增产物目的条带回收 |
| 2.1.10 同源序列比对 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 Lja-SLP76的ORF区扩增 |
| 2.2.3 Lja-SLP76的ORF区测序结果 |
| 2.2.4 日本七鳃鳗Lja-SLP76生物信息学分析 |
| 2.2.5 Lja-SLP76ORF区序列的抗原表位预测 |
| 2.2.6 Lja-SLP76序列比对结果 |
| 2.2.7 SLP-76分子家族系统演化分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 日本七鳃鳗SLP-76原核表达及蛋白纯化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验试剂与药品 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 截短Lja-SLP76序列引物设计 |
| 3.1.4 截短Lja-SLP76与pET32a(+)重组质粒的构建 |
| 3.1.5 Lja-SLP76-pET32a(+)重组蛋白小量诱导与可溶性鉴定 |
| 3.1.6 Lja-SLP76-pET32a(+)重组蛋白的纯化 |
| 3.1.7 Lja-SLP76-pET32a(+)重组蛋白浓度测定及His标签免疫印迹检测 |
| 3.1.8 Lja-SLP76-pET32a(+)重组蛋白的质谱鉴定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 截短Lja-SLP76-pET32a(+)重组质粒的构建 |
| 3.2.2 截短Lja-SLP76-pET32a(+)重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.3 截短Lja-SLP76-pET32a(+)重组蛋白的浓度测定 |
| 3.2.4 截短Lja-SLP76-pET32a(+)重组蛋白的His标签及质谱检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 兔抗Lja-SLP76多克隆抗体制备及其鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂与药品 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 免疫方法 |
| 4.1.5 ELISA检测抗体效价 |
| 4.1.6 Lja-SLP76多克隆抗体纯化 |
| 4.1.7 重组蛋白多克隆抗体特异性检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Lja-SLP76多克隆抗体的效价检测 |
| 4.2.2 Lja-SLP76多克隆抗体浓度测定及特异性检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 七鳃鳗SLP-76在组织中的表达及相关免疫学研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验药品及试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 对日本七鳃鳗的免疫 |
| 5.1.5 日本七鳃鳗各个组织中总蛋白的提取 |
| 5.1.6 七鳃鳗外周血淋巴细胞、鳃囊、髓样小体总RNA提取 |
| 5.1.7 Lja-SLP76的mRNA在各组织中的相对表达 |
| 5.1.8 Western Blot检测Lja-SLP76蛋白在七鳃鳗各组织中的表达情况 |
| 5.1.9 Lja-SLP76多克隆抗体免疫共沉淀功能研究 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 QPCR检测Lja-SLP76在各组织中的相对表达 |
| 5.2.2 Lja-SLP76在各组织蛋白水平上的表达谱 |
| 5.2.3 免疫共沉淀技术检测鳃组织中与Lja-SLP76相互作用的蛋白质 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录A SLP76 全长cDNA核酸序列 |
| 附录B Lja-SLP76测序结果 |
| 附录C p ET32a(+)质粒图谱 |
| 附录D Lja-SLP76稀有密码子含量分析 |
| 附录E 免疫共沉淀质谱结果 |
| 攻读硕士学位期间发表学士论文情况 |
| 致谢 |
（8）杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语与缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 农药残留及免疫检测技术发展现状 |
| 1.2 农药小分子特异性单克隆抗体研究进展 |
| 1.3 杂交瘤细胞技术 |
| 1.4 杂交瘤细胞识别特异性基础——B淋巴细胞 |
| 1.5 CRISPR/Cas基因编辑在杂交瘤细胞生物学研究中的应用 |
| 1.5.1 基因编辑技术概况 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas系统结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas系统机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9基因编辑原理 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9基因编辑文库 |
| 1.5.6 CRISPR/Cas9系统及文库在抗体基因编辑上的应用 |
| 1.6 研究内容及预期目标 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 预期目标 |
| 1.6.3 研究技术路线 |
| 第2章 杂交瘤细胞株及抗百菌清单抗表型的多样性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与设备 |
| 2.2.1.1 试剂材料 |
| 2.2.1.2 试剂盒 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.1.4 培养液及缓冲液配方 |
| 2.2.1.5 试验动物 |
| 2.2.2 农药特异性杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备 |
| 2.2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2.2 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)及饲养细胞的准备 |
| 2.2.2.3 细胞融合 |
| 2.2.2.4 阳性杂交瘤单克隆细胞株筛选 |
| 2.2.3 腹水单抗制备与表征 |
| 2.2.3.1 小鼠腹水单抗制备 |
| 2.2.3.2 腹水单抗灵敏度测定 |
| 2.2.3.3 腹水单抗轻重链类型测定 |
| 2.2.4 不同农药特异性杂交瘤细胞株不同处理后阴性率统计 |
| 2.2.5 杂交瘤细胞株抗体分泌FACS分析 |
| 2.2.6 阴阳性单克隆杂交瘤细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.2.7 BJQ单克隆杂交瘤细胞株抗体产生情况表征 |
| 2.2.7.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.2.7.2 BJQ杂交瘤细胞不同生长阶段Ig G分泌表征 |
| 2.2.7.3 杂交瘤细胞胞内总蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.7.4 胞内蛋白抗体亲和特异性检测 |
| 2.2.7.5 胞内蛋白Ig G定量 |
| 2.2.7.6 胞内蛋白抗体轻重链类型鉴定 |
| 2.2.7.7 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 阳性单克隆杂交瘤细胞株筛选及腹水单抗表征 |
| 2.3.2 单克隆杂交瘤细胞株阴性率测定 |
| 2.3.3 抗体分泌情况FACS分析 |
| 2.3.4 各农药阴阳性细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.3.5 BJQ单克隆细胞周期及抗体表达表征 |
| 2.3.5.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.3.5.2 BJQ阳性细胞株E2生长阶段与Ig G分泌 |
| 2.3.5.3 胞内蛋白的抗体特异性鉴定 |
| 2.3.5.4 胞内蛋白IgG定量 |
| 2.3.5.5 胞内蛋白抗体轻重链类型表征 |
| 2.3.5.6 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与设备 |
| 3.2.1.1 试剂材料 |
| 3.2.1.2 仪器设备 |
| 3.2.1.3 主要缓冲液 |
| 3.2.1.4 实验材料 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞测序 |
| 3.2.2.1 杂交瘤细胞总RNA提取 |
| 3.2.2.2 5’RACE反转录及PCR扩增抗体轻重链可变区序列 |
| 3.2.2.3 抗体基因克隆及Sanger测序 |
| 3.2.3 HEK293(F)重组全抗体瞬时表达 |
| 3.2.3.1 质粒提取 |
| 3.2.3.2 瞬时表达质粒构建及验证 |
| 3.2.3.3 重组全抗体瞬时表达及纯化 |
| 3.2.3.4 瞬时表达重组抗体表征 |
| 3.2.4 HEK293重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.1 构建慢病毒表达载体 |
| 3.2.4.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.4.3 重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.4 稳定表达重组抗体表征 |
| 3.2.5 杂交瘤细胞株免疫组库测序及分析 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞转录组测序及生物信息分析 |
| 3.2.6.1 转录组测序 |
| 3.2.6.2 转录组数据生物信息分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞测序 |
| 3.3.1.1 总RNA的提取 |
| 3.3.1.2 特异性PCR产物分析 |
| 3.3.2 百菌清重组抗体瞬时表达 |
| 3.3.2.1 瞬时表达载体构建及验证 |
| 3.3.2.2 重组抗体瞬时表达及纯化表征 |
| 3.3.3 百菌清重组抗体稳定表达 |
| 3.3.3.1 不同表达质粒和表达体系稳定表达重组抗体效果表征 |
| 3.3.3.2 腹水抗体以及瞬时/稳定表达的重组抗体亲和性表征 |
| 3.3.4 BJQ杂交瘤细胞株免疫组库测序 |
| 3.3.5 BJQ阴阳性细胞转录组学测序及分析 |
| 3.3.5.1 RNA样品检测结果 |
| 3.3.5.2 测序数据过滤及测序质量分析 |
| 3.3.5.3 参考基因组比对 |
| 3.3.5.4 样品组间相关性 |
| 3.3.5.5 杂交瘤细胞株抗体基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 抗百菌清单抗表达差异的杂交瘤细胞株转录组分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.1.1 试剂材料 |
| 4.2.1.2 仪器设备 |
| 4.2.1.3 实验材料 |
| 4.2.2 转录组差异表达基因筛选及GO/KEGG富集 |
| 4.2.3 qPCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.2.3.1 RNA提取 |
| 4.2.3.2 cDNA合成 |
| 4.2.3.3 qPCR反应 |
| 4.2.4 RNA干扰 |
| 4.2.4.1 基因siRNA片段设计 |
| 4.2.4.2 siRNA转染条件优化 |
| 4.2.4.3 RNA基因干扰 |
| 4.2.4.4 qPCR验证RNAi效果 |
| 4.2.4.5 流式分析RNAi杂交瘤细胞抗体分泌情况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 差异表达基因分析 |
| 4.3.2 差异基因GO富集分析 |
| 4.3.3 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.3.4 显着差异表达基因分析 |
| 4.3.5 qPCR验证转录组数据 |
| 4.3.6 RNAi验证基因功能 |
| 4.3.6.1 siRNA转染效率优化 |
| 4.3.6.2 RNA干扰功能基因表达及抗体分泌 |
| 4.3.7 杂交瘤细胞抗体表达途径及转阴可能因素 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9文库筛选杂交瘤细胞抗体表达的功能基因 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 文库质粒扩增 |
| 5.2.4 慢病毒包装 |
| 5.2.4.1 去内毒素质粒中提 |
| 5.2.4.2 慢病毒包装 |
| 5.2.4.3 慢病毒滴度测定 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞慢病毒文库感染 |
| 5.2.5.1 细胞准备 |
| 5.2.5.2 嘌呤霉素筛选浓度优化 |
| 5.2.5.3 慢病毒感染效率测定 |
| 5.2.6 GeCKO慢病毒文库感染E2细胞株 |
| 5.2.7 农药压力筛选 |
| 5.2.7.1 筛选原理 |
| 5.2.7.2 百菌清农药对杂交瘤细胞致死效应及抗体“中和作用” |
| 5.2.7.3 百菌清农药筛选浓度优化 |
| 5.2.7.4 百菌清农药筛选GeCKOv2E2细胞文库 |
| 5.2.8 流式细胞分选 |
| 5.2.8.1 分选原理 |
| 5.2.8.2 流式细胞分选 |
| 5.2.9 NGS扩增子测序 |
| 5.2.9.1 基因组DNA提取 |
| 5.2.9.2 特异性PCR |
| 5.2.9.3 NGS扩增子测序及数据分析 |
| 5.2.10 sh RNA功能基因验证 |
| 5.2.10.1 shRNA慢病毒质粒构建及慢病毒包装 |
| 5.2.10.2 shRNA慢病毒感染 |
| 5.2.10.3 qPCR验证基因功能 |
| 5.2.10.4 FACS检测杂交瘤细胞抗体表达情况 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 GeCKOv2 library质粒扩增 |
| 5.3.2 GeCKO library慢病毒包装与检测 |
| 5.3.3 杂交瘤细胞慢病毒文库构建 |
| 5.3.3.1 puro筛选浓度优化 |
| 5.3.3.2 慢病毒感染效率测定 |
| 5.3.3.3 GeCKOv2 E2 library慢病毒敲除文库构建 |
| 5.3.4 百菌清农药压力筛选 |
| 5.3.4.1 百菌清农药对杂交瘤细胞的毒性作用 |
| 5.3.4.2 特异性单抗对百菌清农药的“中和作用” |
| 5.3.4.3 百菌清农药筛选时间及浓度优化 |
| 5.3.4.4 百菌清农药筛选GeCKO v2 E2细胞文库 |
| 5.3.5 流式细胞分选 |
| 5.3.6 农药压力筛选NGS扩增子测序分析 |
| 5.3.6.1 核酸样品质控 |
| 5.3.6.2 测序数据质控 |
| 5.3.6.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.6.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.6.5 样品间相似性分析 |
| 5.3.6.6 显着富集基因分析 |
| 5.3.6.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.6.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.6.9 药筛富集的功能基因、通路与转录组比对分析 |
| 5.3.7 流式细胞分选测序结果分析 |
| 5.3.7.1 核酸样品质控 |
| 5.3.7.2 测序数据质控 |
| 5.3.7.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.7.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.7.5 样本间相似性分析 |
| 5.3.7.6 显着差异基因分析 |
| 5.3.7.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.7.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.7.9 CRISPR library流式筛选及药物筛选功能基因通路与RNA-seq比对分析 |
| 5.3.8 shRNA干扰验证功能基因 |
| 5.3.8.1 shRNA慢病毒感染效率优化 |
| 5.3.8.2 qPCR验证干扰基因及抗体基因表达情况 |
| 5.3.8.3 FACS检测抗体表达情况 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 百菌清抗原免疫小鼠脾脏细胞转录组学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 转录组测序与生物信息分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 脾脏转录组RNA样品检测结果 |
| 6.3.2 脾脏转录组测序数据过滤及测序质量分析 |
| 6.3.3 脾脏转录组数据参考基因组比对 |
| 6.3.4 基因表达分析及显着性DEG筛选 |
| 6.3.5 差异基因GO富集分析 |
| 6.3.6 差异基因KEGG富集分析 |
| 6.3.7 显着差异基因分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第7章 抗百菌清杂交瘤细胞抗体表达的调控途径及分子机制探究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 BJQ特异性杂交瘤细胞株及其单抗的多样性分析 |
| 7.2.1 杂交瘤细胞株及其单抗表型的多样性分析 |
| 7.2.1.1 阴阳性单克隆杂交瘤细胞的定义 |
| 7.2.1.2 不同处理方式测定杂交瘤细胞株阴性率 |
| 7.2.1.3 杂交瘤细胞增殖及抗体分泌情况 |
| 7.2.1.4 流式分析杂交瘤细胞抗体分泌情况及抗体亚型检测 |
| 7.2.1.5 BJQ杂交瘤细胞株抗体产生情况分析 |
| 7.2.2 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 7.2.2.1 BJQ特异性杂交瘤细胞抗体序列测定及验证 |
| 7.2.2.2 BJQ阴阳性细胞及SP2/0 细胞免疫组库测序 |
| 7.2.2.3 BJQ五株阴阳性细胞及SP2/0 细胞抗体基因表达情况 |
| 7.3 BJQ特异性抗体表达差异的杂交瘤细胞株转录组学分析 |
| 7.3.1 DEG筛选及RNA-seq可靠性验证 |
| 7.3.2 GO功能及KEGG通路富集分析 |
| 7.3.3 差异表达基因分析 |
| 7.3.4 RNAi相关功能基因分析 |
| 7.4 CRISPR文库筛选杂交瘤细胞抗体表达相关基因及通路分析 |
| 7.4.1 GeCKO文库质粒扩增及慢病毒包装 |
| 7.4.2 慢病毒文库感染杂交瘤细胞 |
| 7.4.3 农药压力筛选与流式细胞分选 |
| 7.4.4 NGS扩增子测序数据分析 |
| 7.4.5 差异基因与功能通路富集分析 |
| 7.4.6 shRNA验证Pet2基因和Ccnd2基因功能 |
| 7.5 BJQ杂交瘤细胞转录组与CRISPR library筛选综合分析 |
| 7.5.1 转录组与CRISPR library筛选方法比较 |
| 7.5.2 两种筛选方式共同富集的基因功能及信号通路 |
| 7.5.3 两种筛选方式共同富集的差异基因分析 |
| 7.5.4 杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.6 骨髓瘤细胞SP2/0 与杂交瘤细胞功能基因表达差异分析 |
| 7.7 百菌清农药抗原免疫小鼠脾细胞各阶段转录组分析 |
| 7.7.1 研究对象的选择 |
| 7.7.2 转录组基因表达分析及差异基因筛选 |
| 7.7.3 脾脏转录组显着差异基因GO/KEGG富集分析 |
| 7.7.4 小鼠机体产生抗BJQ特异性抗体的过程 |
| 7.7.5 杂交瘤细胞与机体B细胞抗体合成途径异同 |
| 7.8 抗百菌清特异性单抗合成及分泌途径及调控机制 |
| 7.8.1 杂交瘤细胞的融合与体外培养 |
| 7.8.2 杂交瘤细胞抗体基因编码与表达 |
| 7.8.2.1 DNA编码水平 |
| 7.8.2.2 表观遗传学编码水平 |
| 7.8.2.3 杂交瘤细胞抗体基因表达调控 |
| 7.8.3 杂交瘤细胞周期进程调控 |
| 7.8.4 信号通路与转录因子调控杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.8.5 杂交瘤细胞抗体基因转录后调控 |
| 7.8.6 杂交瘤细胞抗体装配与修饰 |
| 7.8.7 杂交瘤细胞抗体运输及分泌 |
| 7.8.8 杂交瘤细胞调控抗体合成及分泌的相关机制 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 全文创新点 |
| 8.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
（9）沙棘木蠹蛾幼虫EhHsp90-1和EhHsp90-2基因的克隆表达及EhHsp90-1基因RNA干扰体系的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 沙棘木蠹蛾的研究进展 |
| 1.1.1 分布和危害 |
| 1.1.2 生物学特性 |
| 1.1.3 灾害发生机制 |
| 1.1.4 防治方法 |
| 1.2 昆虫耐寒性的研究进展 |
| 1.2.1 昆虫耐寒性分类 |
| 1.2.2 昆虫耐寒的策略 |
| 1.3 Hsp90的研究进展 |
| 1.3.1 热激蛋白概述 |
| 1.3.2 Hsp90的分类与特征 |
| 1.3.3 Hsp90的生物学功能 |
| 1.4 RNAi在昆虫功能基因研究中的应用 |
| 1.4.1 RNAi的作用机制 |
| 1.4.2 dsRNA的呈递方式 |
| 1.4.3 昆虫对RNAi的敏感性 |
| 1.4.4 基因功能分析中的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 EhHsp90-1和EhHsp90-2 基因的克隆和生物信息学分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.1.3 研究方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 基因的克隆和序列特征分析 |
| 2.2.2 系统发育分析 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 3 EhHsp90-1和EhHsp90-2 在低温处理下的表达规律 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 研究方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 EhHsp90-1和EhHsp90-2 在同一时间不同温度下的表达规律 |
| 3.2.2 EhHsp90-1和EhHsp90-2 在同一温度不同时间下的表达规律 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 4 EhHsp90-1和EhHsp90-2 蛋白的原核表达及免疫印迹检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂和仪器 |
| 4.1.2 研究方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 EhHsp90-1和EhHsp90-2 基因的双酶切鉴定 |
| 4.2.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达 |
| 4.2.3 EhHsp90-1和EhHsp90-2 蛋白的抗体效价 |
| 4.2.4 EhHsp90-1和EhHsp90-2 蛋白的免疫印迹试验检测 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 5 EhHsp90-1 基因的RNAi体系的构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试昆虫 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器 |
| 5.1.3 研究方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 dsRNA质量检测 |
| 5.2.2 注射1μg dsRNA对 EhHsp90-1 基因表达量的影响 |
| 5.2.3 注射5μg dsRNA对 EhHsp90-1 基因表达量的影响 |
| 5.2.4 注射10μg dsRNA对 EhHsp90-1 基因表达量的影响 |
| 5.2.5 注射5μg dsRNA的72h处理组的目的蛋白免疫印迹检测 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 6 主要结论 |
| 7 创新点与展望 |
| 7.1 创新点 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（10）家蚕质型多角体病毒诱导细胞自噬的分子机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 家蚕质型多角体病毒的研究进展 |
| 1.1 家蚕质型多角体病毒的危害 |
| 1.2 家蚕质型多角体病毒的结构 |
| 1.3 家蚕质型多角体病毒的基因组和蛋白 |
| 2 线粒体自噬研究进展 |
| 2.1 细胞自噬概述 |
| 2.2 细胞自噬对于病毒感染是把双刃剑 |
| 2.3 线粒体自噬研究进展 |
| 3 研究目的与研究内容 |
| 3.1 研究的目的与意义 |
| 3.2 研究内容 |
| 3.3 技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 BmCPV感染诱导细胞自噬 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 电镜观察BmCPV感染家蚕中肠细胞病变 |
| 3.2 BmCPV感染pIZ-EGFP-LC3处理BmN细胞的自噬体观察 |
| 3.3 家蚕ATG8 (LC3)蛋白抗体制备 |
| 3.4 BmCPV感染BmN细胞LC3-Ⅱ蛋白水平的变化 |
| 3.5 BmCPV感染家蚕中肠LC3-Ⅱ蛋白水平的变化 |
| 3.6 BmCPV感染BmN细胞自噬相关基因表达水平的变化 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 BmCPV感染诱导的自噬类型研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 BmCPV感染后电镜观察细胞线粒体形态的变化 |
| 3.2 BmCPV感染BmN细胞线粒体自噬通路蛋白检测 |
| 3.3 Parkin和Drp-1基因沉默对细胞自噬的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 BmCPV诱导的细胞自噬与病毒增殖的关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Rap和3-MA对BmN细胞的毒性 |
| 3.2 Rap和3-MA处理对BmCPV感染引起自噬的影响 |
| 3.3 Rap和3-MA处理对BmCPV增殖的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 BmCPV感染诱导细胞自噬的关键病毒蛋白的鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 pIZT-CS1-pIZT-CS10转染pIZT-LC3-GFP-mCherry BmN细胞 |
| 3.2 BmCPV VP4对自噬相关蛋白水平的影响。 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录一 缩略词表 |
| 附录二 载体图谱 |
| 附录三 常用仪器 |
| 附录四 qPCR原始数据 |
| 附录五 抗体可用性分析 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
四、RAP蛋白的纯化和抗体制备（论文参考文献）
- [1]转基因兔乳汁中重组吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂的纯化、结构分析和药效研究[D]. 张婷. 扬州大学, 2021
- [2]基于羊巴贝斯虫球状体蛋白3（SBP3）基因的检测方法建立[D]. 吕照勇. 中国农业科学院, 2021(09)
- [3]羊巴贝斯虫自噬相关基因结构与功能研究[D]. 王晓星. 中国农业科学院, 2021
- [4]p62/Keap1-Nrf2途径介导自噬促进贝类抗氧化应激研究[D]. 吴杰连. 南昌大学, 2021(02)
- [5]TRIM50-like和TRIM9在斑节对虾先天免疫中的功能研究[D]. 彭超. 上海海洋大学, 2021
- [6]人源和斑马鱼源PKA alpha催化亚基蛋白的原核表达及体外特性比较研究[D]. 蒋瑶. 浙江大学, 2021
- [7]日本七鳃鳗SLP-76基因的克隆表达、抗体制备及相关免疫学研究[D]. 赵婷婷. 辽宁师范大学, 2021(08)
- [8]杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制[D]. 柳颖. 浙江大学, 2020(01)
- [9]沙棘木蠹蛾幼虫EhHsp90-1和EhHsp90-2基因的克隆表达及EhHsp90-1基因RNA干扰体系的构建[D]. 王倩倩. 北京林业大学, 2020(02)
- [10]家蚕质型多角体病毒诱导细胞自噬的分子机理[D]. 张明天. 苏州大学, 2020(02)