一、类2型糖尿病db/db鼠的体外巨噬细胞细胞因子及一氧化氮分泌改变（论文文献综述）
马骥[1]（2021）在《盐酸小檗碱外用对糖尿病创面愈合的作用及机制研究》文中研究指明目的:糖尿病慢性难愈性创面修复异常主要表现为新生血管及胶原沉积减少、炎症反应时间延长、氧化应激增强等。盐酸小檗碱（Berberine hydrochloride,BBR）具有降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗及抗炎、抗氧化等药理作用,对糖尿病及其并发症治疗具有一定作用。本研究拟通过动物及细胞实验探讨盐酸小檗碱外用对糖尿病创面愈合的作用及主要机制。方法:1.应用STZ腹腔注射SD大鼠（220g-260g）诱导糖尿病大鼠模型,采用背部全层皮肤切除法制备糖尿病大鼠全层皮肤缺损创面模型。大鼠随机分为正常对照组（NC组）、空白对照组（DM组）、药物溶剂组（BBRSolvent）、药物低剂量组（LBBR）、药物高剂量组（HBBR）,观察创面愈合一般情况及创面面积的变化。在创面愈合过程的第3,8,12,16天切取创面组织进行分析。采用HE和MASSON染色观察创面形态学的变化。ELISA法检测创面晚期糖基化终末产物（AGEs）的生成和堆积。Western Blotting检测创面RAGE受体和Ⅰ型胶原的表达水平。免疫荧光染色检测创面成纤维细胞增殖和凋亡水平。2.分离提取人真皮来源成纤维细胞（HDFs）并鉴定其Vimentin蛋白表达情况。体外制备糖基化白蛋白（AGEs-HSA）,检测其浓度;细胞实验分为对照组,AGEs-HSA组,HSA组,摸索其对HDFs的作用效果及合适的作用浓度。检测RAGE受体的蛋白表达;进一步检测细胞凋亡相关指标,并检测Caspase家族蛋白以明确AGEs-HSA诱导细胞凋亡的信号通路;检测线粒体凋亡信号通路中相关指标的改变,包括Bax/Bcl-2,线粒体膜电位,细胞色素C等,同时检测细胞内ROS的含量。3.探讨BBR是否可以调控AGEs-HSA对成纤维细胞的作用。细胞分为对照组,AGEs-HSA处理组,HSA处理组,BBR溶剂组、低剂量BBR及高剂量BBR处理组。首先通过细胞增殖实验（CCK-8法）及细胞毒性实验（LDH法）摸索合适的BBR浓度;检测RAGE受体的蛋白水平,并通过TUNEL,流式细胞术等方法检测细胞凋亡水平;进一步检测细胞内ROS水平,并通过ROS激活剂代替BBR的方式探索ROS是否为BBR的作用靶点;检测线粒体凋亡信号通路中相关指标的改变,包括线粒体膜电位,细胞色素C,Caspase-9和Caspase-3的蛋白表达等。结果:1.应用STZ腹腔注射SD大鼠后,糖尿病大鼠血糖明显高于正常大鼠。与NC组相比,DM组大鼠创面愈合延迟（P<0.05）,出现血管生成减少,炎症消散延迟,成纤维细胞及基质沉积减少等特征。BBR可有效促进胶原纤维的增生与成熟,加速创面新生上皮的覆盖。同时,BBR可促进肉芽组织的生长,提高创面愈合率,缩短愈合时间。2.在糖尿病创面愈合的过程中,AGEs处于不断生成和堆积的状态。BBR可抑制糖尿病创面中AGEs的生成和堆积,降低创面中RAGE受体的过度表达。同时,BBR可提高糖尿病创面中Ⅰ型胶原的表达,促进创面细胞外基质的沉积。此外,盐酸小檗碱可提高糖尿病创面中成纤维细胞的增殖能力,降低成纤维细胞的凋亡水平。3.人真皮来源成纤维细胞分离及生长情况良好;150μg/mL以内的AGEs-HSA可以呈剂量依赖性地诱导成纤维细胞凋亡,相同浓度下HSA溶液对成纤维细胞无明显促凋亡作用。AGEs-HSA可以上调RAGE受体蛋白表达水平,增加剪切形式的Caspase-9的表达,进一步实验发现AGEs-HSA可以增加Bax/Bcl-2的比值,引起线粒体膜电位丢失,促进细胞色素C的释放,提示其主要影响线粒体凋亡信号通路。同时,AGEs-HSA可以增加细胞内ROS的水平。4.BBR在75μg/mL浓度以内时,可呈剂量依赖性地拮抗AGEs-HSA的作用,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,降低其细胞毒性。BBR不影响成纤维细胞RAGE受体的表达。BBR可以下调细胞内ROS的水平,提示其可能通过调控ROS发挥拮抗AGEs-HSA的作用。BBR可以调控线粒体凋亡信号通路相关的指标,包括增加线粒体膜电位,减少细胞色素C释放入胞浆,下调Caspase-9和Caspase-3的活化水平。结论:1.盐酸小檗碱外用可有效促进糖尿病大鼠创面的愈合。高浓度的盐酸小檗碱效果更为显着。BBR可抑制糖尿病创面中晚期糖基化终末产物的生成,提高糖尿病创面中成纤维细胞的增殖活性,降低成纤维细胞的凋亡水平。2.AGEs-HSA可以通过结合RAGE受体,激活ROS/细胞色素C/Caspase-9/Caspase-3的线粒体凋亡信号通路,诱导人真皮来源成纤维细胞凋亡,从而影响糖尿病创面的愈合;BBR可以抑制细胞内ROS的生成,阻断AGEs-HSA对线粒体凋亡信号通路的激活,从而逆转AGEs-HSA对成纤维细胞的作用。
官劲帆[2]（2021）在《利拉鲁肽通过上调PPARα调控小胶质细胞/巨噬细胞极化改善糖尿病大鼠脑缺血损伤的研究》文中指出目的:研究利拉鲁肽对糖尿病大鼠脑缺血损伤后M1型小胶质细胞/巨噬细胞表面标记物CD16、MHCII,M2型小胶质细胞/巨噬细胞表面标记物CD206、Arg-1,促炎因子白介素（interleukin-1β,IL）-1β,抗炎因子IL-10以及过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferators-activated receptorα,PPARα）表达的影响,进一步探讨利拉鲁肽的神经保护作用机制,以期为临床治疗糖尿病合并脑梗死患者提供理论基础及实验室依据。方法:75只健康雄性斯普拉格-道利（sprague-dawley,SD）大鼠（8-12周龄,280-320 g）随机分为5组:脑梗死（CI）组、糖尿病脑梗死（DCI）组、胰岛素治疗（Ins）组、利拉鲁肽治疗（Lir）组和利拉鲁肽+PPARα拮抗剂GW6471（Lir+GW6471）组。每组15只大鼠。糖尿病大鼠模型是通过予普通大鼠高糖高脂饮食4周后腹腔注射链脲佐菌素（streptozocin,STZ）（50mg/kg）诱导形成。继而通过改良的Zea Longa线栓法建立永久性大脑中动脉闭塞（permanent middlecerebral arteryocclusion,p MCAO）模型。Lir+GW6471组大鼠于p MCAO前30 min,给予左侧侧脑室注射GW6471（10μg,溶解于5μL 2%二甲亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO））;p MCAO造模成功后再给予左下腹腹腔注射利拉鲁肽（700μg/kg/d）。其余四组大鼠于p MCAO前30 min,给予左侧侧脑室注射相同体积的2%DMSO;于p MCAO造模成功后,Lir组大鼠左下腹腹腔注射利拉鲁肽（700μg/kg/d）;Ins组大鼠左下腹腹腔注射注射胰岛素（2U/kg/d）;CI组和DCI组大鼠左下腹腹腔注射等体积的生理盐水。p MCAO造模后72 h,对大鼠行神经功能缺损评分;随后处死大鼠,行2,3,5-氯化二苯四氮唑（2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色检测脑梗死体积;实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR,RT-q PCR）测定缺血侧脑组织中PPARα、M1型小胶质细胞/巨噬细胞表面标记物CD16、MHCII和M2型小胶质细胞/巨噬细胞表面标记物CD206、Arg-1 m RNA表达水平;蛋白免疫印迹（western blot,WB）法检测缺血侧脑组织中IL-1β、IL-10及PPARα的表达水平;免疫荧光双标法测定M1型小胶质/巨噬细胞表面标记物Iba-1+CD16/32阳性细胞数及M2型小胶质/巨噬细胞表面标记物Iba-1+CD206阳性细胞数。结果:1.随机血糖变化:DCI组、Ins组、Lir组、Lir+GW6471组于注射STZ后,其随机血糖水平均明显升高（P<0.05）。行p MCAO术后72 h,Ins组、Lir组和Lir+GW6471组血糖水平显着下降（P<0.05）。2.神经功能缺损评分:与CI组相比,DCI组评分显着升高（P<0.05）;DCI组与Ins组相比,评分无明显变化（P=0.784）;而Lir组分别与DCI组、Lir+GW6471组相比,评分均显着降低（P<0.05）。3.脑梗死体积:与CI组相比,DCI组脑梗死体积显着增大（P<0.05）;DCI组与Ins组相比,脑梗死体积无明显变化（P=0.101）;Lir组较DCI组梗死体积明显减小（P<0.05）;而Lir+GW6471组与Lir组相比,梗死体积均明显增大（P<0.05）。4.PPARα:与CI组比较,DCI组PPARαm RNA表达量显着减少（P<0.05）;与DCI组比较,Lir组PPARαm RNA表达量显着升高（P<0.05）;而Lir+GW6471组与Lir组比较PPARαm RNA表达量显着降低（P<0.05）。与CI组相比,DCI组PPARα蛋白表达显着减少（P<0.05）;与DCI组相比,Lir组PPARα蛋白表达显着升高（P<0.05）;而Lir+GW6471组与Lir组相比PPARα蛋白表达显着降低（P<0.05）。5.M1型小胶质细胞/巨噬细胞:与CI组相比,DCI组CD16和MHCII m RNA表达量显着增加（P<0.05）;而Lir组分别与DCI组、Lir+GW6471组相比CD16和MHCII m RNA表达量均显着减少（P<0.05）。Iba-1+CD16/32阳性细胞数表达:与Lir组相比,DCI组和Lir+GW6471组Iba-1+CD16/32阳性细胞数/mm2明显增多（P<0.05）。6.M2型小胶质细胞/巨噬细胞:与CI组相比,DCI组CD206、Arg-1 m RNA表达量显着减少（P<0.05）;而Lir组分别与DCI组、Lir+GW6471组相比CD206、Arg-1m RNA表达量均显着增加（P<0.05）。Iba-1+CD206阳性细胞数表达:与Lir组相比,DCI组和Lir+GW6471组Iba-1+CD206阳性细胞数/mm2明显减少（P<0.05）。7.IL-1β:与CI组相比,DCI组IL-1β表达显着增加（P<0.05）;而Lir组分别与DCI组、Lir+GW6471组相比IL-1β表达均显着减少（P<0.05）。8.IL-10:与CI组比较,DCI组IL-10表达显着减少（P<0.05）;而Lir组分别与DCI组、Lir+GW6471组比较IL-10表达均显着增加（P<0.05）。结论:1.利拉鲁肽在糖尿病脑梗死大鼠模型中具有神经保护作用;2.通过激活PPARα进而抑制小胶质细胞/巨噬细胞向M1表型转换,促进小胶质细胞/巨噬细胞向M2表型转换,可能是利拉鲁肽的对糖尿病合并脑缺血损伤的神经保护作用机制之一。
雷思思[3]（2020）在《白芷对2型糖尿病小鼠皮肤溃疡促愈的作用机制的研究》文中研究指明目的本研究选用自发2型糖尿病C57BLKS/Jdb/db（db/db）雄性小鼠和同龄同源C57BLKS/Jdb/+（db/m）雄性小鼠背部打孔法建立糖尿病皮肤溃疡小鼠模型,同时体外进行相关细胞实验,采用白芷（Angelica dahuricae,AD）干预治疗,探究其对2型糖尿病小鼠创面组织炎症,血管形成与成熟等方面的影响,体外实验进一步探究其作用的相关机制。方法1.144只雄性db/db小鼠与36只同源雄性db/m小鼠,8周龄,适应性喂养1周后,使用苯巴比妥麻醉,采用直径为6mm的皮肤打孔器在其背部皮肤双侧对称打孔制备皮肤溃疡模型。死亡小鼠予以剔除后,随机将小鼠分为正常溃疡对照组（db/m）组、糖尿病溃疡（db/db）组和白芷低、中、高剂量（db/db+ADL、ADM、ADH）组,每组9只。白芷低、中、高组分别给予白芷1.8g/kg、3.6g/kg、7.2g/kg灌胃,db/m和db/db组给予等量生理盐水灌胃。每天给药一次,连续给药21d,分别于创伤后4、7、11、21d处死一批小鼠,取创面组织分析。使用HE、Masson、免疫组织化学染色观察创面炎症、血管形成及胶原纤维形成等改变;免疫荧光双染及Western Bloting检测AD干预后db/db小鼠创面组织中巨噬细胞极化及新生血管成熟相关因子表达情况。2.体外使用AD预处理巨噬细胞后再诱导巨噬细胞极化,应用细胞免疫荧光及Western Bloting检测观察AD对巨噬细胞向M1、M2极化及及相关因子表达水平。同时利用transwell小室将AD预处理后再诱导极化的巨噬细胞与内皮细胞共培养,观察AD预处理后再诱导极化的巨噬细胞对内皮细胞趋化作用。3.体外培养人脐静脉内皮细胞与人脑血管周细胞。给予1umol/LCo Cl2使内皮细胞化学缺氧。内皮细胞根据不同干预条件分为:低糖缺氧组（NG+C）、高糖缺氧组（HG+C）、高渗缺氧组（MA+C）、高塘缺氧+AD组（HG+C+AD）。观察AD干预高塘缺氧下内皮细胞后对周细胞趋化作用及体外管状结构形成的影响,并检测AD作用于高糖缺氧下内皮细胞后,细胞中与新生血管成熟障碍密切相关的FOXO1与Ang-2等表达改变。结果1.AD对2型糖尿病小鼠创面愈合情况的影响创伤后4d起至21d,AD各剂量组创面相对愈合面积均大于db/db组（P<0.05）,创面愈合早期,AD治疗后db/db小鼠创面炎性渗出,炎症细胞数量明显减少,创面愈合增殖阶段,AD给药后能促进db/db小鼠创面新生血管明显增加,胶原纤维形成,创面肉芽组织填充。其中,db/db+ADL组愈合情况始终明显优于db/db+ADM与db/db+ADH组（P<0.05）。2.AD对2型糖尿病小鼠创面愈合早期炎症阶段巨噬细胞极化的影响AD给药后db/db小鼠创面M1亚型巨噬细胞数量减少,M2亚型明显增加;此外,AD给药后db/db小鼠创面组织炎症因子IL-1β,TNF-α蛋白表达明显减少（P<0.05）,VEGF蛋白表达显着增加（P<0.05）,促进巨噬细胞向M1极化SOCS3表达明显减少（P<0.05）,而促进巨噬细胞向M2极化SOCS1表达明显增加（P<0.05）;体外细胞实验也得到以上相类似结果。此外AD预处理M1巨噬细胞后促进与其共培养的HUVEC向下层迁移（P<0.05）。3.AD对2型糖尿病小鼠创面增殖阶段新生血管成熟的影响AD治疗后db/db小鼠创面新生血管中周细胞标记因子α-SMA荧光染色明显增强,AD干预后db/db小鼠创面组织及高糖缺氧下内皮细胞中FOXO1,Ang-2蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）,p-AKT、p-FOXO1蛋白表达增加（P<0.05）。体外对AD干预后的高糖缺氧下内皮细胞与周细胞共培养发现,AD能促进高糖缺氧条件下内皮细胞对周细胞的趋化作用（P<0.05）,并且促进高糖缺氧内皮细胞与周细胞体外管状结构形成（P<0.05）。结论1.白芷能在2型糖尿病小鼠创面愈合多个时期发挥积极作用,早期可减轻创面炎症浸润,增殖阶段可促进创面血管新生及成熟,胶原基质沉淀,从而提高db/db小鼠创面愈合速率与质量。其中,白芷低剂量治疗效果更佳。2.白芷缓解2型糖尿病小鼠创面愈合早期炎症浸润,可能与调节SOCS1/SOCS3表达抑制糖尿病小鼠创面巨噬细胞向M1过度极化有关。3.白芷能促进2型糖尿病小鼠创面及体外高糖缺氧下内皮细胞-周细胞管状结构形成,且其相关机制可能与上调p-AKT促进叉头蛋白FOXO1磷酸化,抑制FOXO1激活,降低Ang-2表达有关。
浦强[4]（2020）在《基于PKM2调控M1型巨噬细胞活化途径探讨黄葵素对糖尿病肾病模型肾保护作用的机制研究》文中进行了进一步梳理糖尿病肾病（Diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病最常见也是最严重的微血管并发症之一,严重威胁着人类健康。免疫系统激活、微炎症状态是目前一致认可的糖尿病肾病发病机制,如何克服免疫炎症反应,阻止和延缓DKD的进程,是糖尿病肾病防治领域的重要课题。巨噬细胞是关键的免疫炎症效应细胞。糖尿病环境下,肾脏局部巨噬细胞浸润,并活化为促炎M1型,产生多种炎性细胞因子、趋化因子、促纤维化因子等,改变肾脏局部微环境,引起肾小球损伤、结构重塑、硬化,小管萎缩,间质炎症及纤维化等。巨噬细胞从静息状态至促炎M1型经典活化状态发生了糖代谢重编程（从静止转变为活跃代谢状态）。M1型巨噬细胞主要依靠快速供能的有氧糖酵解途径获取能量及中间介质以发挥促炎效应。M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2,PKM2）是细胞代谢重编程的关键酶,是糖酵解最重要的限速酶。生理状态下,PKM2以高激酶活性的四聚体构象存在于细胞质内,能与其他糖代谢酶,如己糖激酶、丙酮酸脱氢酶激酶等构成复合体驱动三羧酸循环,调节细胞的能量代谢。微环境刺激下,PKM2四聚体解离为低活性的二聚体易位至细胞核,作为转录因子,驱动糖酵解进程。核PKM2是巨噬细胞活化M1的关键决定因素。因此,在糖尿病状态下,基于免疫代谢酶点深入研究巨噬细胞相关的肾损伤机制,以筛选出防治DKD新的作用靶点,具有重要的理论及临床意义。中医药在延缓糖尿病肾病病情进展方面具有不可替代的优势。中药黄蜀葵花及其制剂目前已成为治疗糖尿病肾病、慢性肾炎等慢性肾脏病的重要药物。本研究以db/db小鼠及RAW264.7巨噬细胞为研究对象,探讨黄蜀葵花醇提取物-黄葵素对DKD肾脏的保护作用,及其机制是否与巨噬细胞浸润、活化相关,进一步探寻其中可能作用靶点,为黄蜀葵花治疗糖尿病肾病的药理机制提供新的实验依据。目的:从动物和细胞水平,应用分子生物学实验技术,观察黄葵素对db/db小鼠肾组织炎症、纤维化的影响,并初步探明其中机制是否与调控M2型丙酮酸激酶（PKM2）及M1型巨噬细胞浸润、活化相关,为黄蜀葵花治疗糖尿病肾病提供科学依据。方法:1.动物实验:20只雄性db/db小鼠按随机数字表法均分为黄葵素低剂量、中剂量、高剂量治疗组（97.5mg/kg/d,195mg/kg/d,390mg/kg/d）及糖尿病肾病模型组,每组各5只小鼠,空白对照组用5只相同背景的db/m小鼠。黄葵素治疗组分别相应剂量黄葵素混悬液灌胃,对照组及模型组以等体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。连续给药16周,期间定期检测尿ACR。第24周处死小鼠并收集标本。HE染色和Masson染色观察肾脏形态学改变和肾纤维化程度;免疫组化染色法检测肾组织F4/80标记的巨噬细胞表达情况;蛋白质印迹法检测F4/80蛋白、III型胶原蛋白、波形蛋白、iNOS蛋白和PKM2蛋白表达情况;RT-qPCR法检测TNF-α、IL-1β、iNOS和PKM2基因的mRNA表达情况;ELISA法检测血清TNF-α、MCP-1水平。2.细胞实验:CCK-8法检测不同浓度梯度的黄葵素对RAW264.7巨噬细胞存活率的影响,初步确定适宜浓度黄葵素进行后续药效学实验。不同糖浓度梯度刺激RAW264.7细胞,流式细胞术筛选巨噬细胞M1型活化最佳糖浓度。将RAW264.7巨噬细胞分为低糖组,高糖组,高糖+黄葵素组,流式细胞术分析黄葵素对RAW264.7巨噬细胞M1型活化的影响,蛋白质印迹法检测PKM2蛋白表达,探讨量效关系。结果:1.与对照组db/m小鼠相比:糖尿病肾病模型组db/db小鼠体重明显上升（P<0.01）;肾脏指数下降（P<0.01）;尿ACR水平明显升高（P<0.01）;血肌酐水平明显升高（123.50±17.91 vs 13.40±1.36,P<0.01）,尿素氮水平明显升高（15.22±0.63 vs 6.53±1.38,P<0.01）;肾脏病理损害明显、胶原纤维的沉积;免疫组化提示肾组织中标记F4/80的巨噬细胞浸润增多（P<0.05）;肾组织中巨噬细胞标记F4/80蛋白、M1型巨噬细胞活化标志iNOS蛋白和mRNA、及炎症因子IL-1β、TNF-α基因的mRNA转录均增加（P<0.01）;血清中促炎因子TNF-α、MCP-1水平升高（P<0.01）;肾组织中Collagen Ⅲ蛋白和Vimentin蛋白表达明显上调（P<0.01）;糖代谢重编程关键酶PKM2的蛋白和mRNA表达水平明显上调（P<0.01）。2.与DKD模型组小鼠相比:黄葵素组小鼠尿ACR水平均下降（P<0.05）;黄葵素组小鼠血Scr、血BUN水平总体呈抑制的趋势,其中中剂量组血Scr和高剂量组血BUN水平显着下降（P<0.05）,高剂量组血Scr下降水平更明显（P<0.01）;黄葵素组小鼠肾组织中Collagen Ⅲ蛋白和Vimentin蛋白表达均降低,呈量效关系,中、高剂量治疗组降低更显着（P<0.01）;黄葵素组小鼠F4/80标记的棕染细胞浸润呈不同程度降低,呈一定量效关系,中、高剂量组降低更明显（P<0.05）;黄葵素组小鼠肾组织F4/80蛋白表达均下调,呈量效关系,高剂量组下调最明显（P<0.01）,中剂量组次其次（P<0.05）;黄葵素组小鼠肾组织TNF-α、IL-1β和iNOS基因的mRNA转录均下调（P<0.01）;黄葵素组小鼠血清中TNF-α、MCP-1水平均下调（P<0.05）,高剂量组下调更显着（P<0.01）;黄葵素组小鼠肾组织PKM2的蛋白和mRNA表达均呈不同程度的下调（P<0.05,P<0.01）;但体重与肾脏指数方面,黄葵素组与DKD模型组差异无统计学意义（P>0.05）。3.细胞实验结果:高糖（30mM）刺激RAW264.7巨噬细胞后,PKM2蛋白表达上调（P<0.01）,巨噬细胞M1型活化率上升（P<0.05）;而经过25ug/ml、50ug/ml的黄葵素药液处理后,PKM2蛋白表达下调（P<0.01）,M1型巨噬细胞活化率下降（P<0.05）。结论:1.黄葵素显着降低db/db小鼠蛋白尿水平,减轻db/db小鼠肾脏病理损伤,减少胶原纤维沉积,抑制肾纤维化程度,呈量效关系;2.黄葵素可抑制肾组织局部巨噬细胞浸润及M1型巨噬细胞活化,减轻肾组织炎症及纤维化,呈量效关系;3.黄葵素抑制M1型巨噬细胞活化作用,可能与调控PKM2表达相关。
王艳明[5]（2020）在《基于肠道菌群探讨乳源性复合益生菌诱导结肠GLP-1分泌及M2极化的分子机制研究》文中研究指明目的:肠道菌群与Ⅱ型糖尿病（T2D）发生发展密切相关。肠道菌群的失调会引起肠渗透性的增加,促使脂多糖等毒性物质透过肠粘膜系统进入血液,引起胰岛素敏感器官的低度炎症及胰岛素抵抗,加速糖尿病进程。益生菌能通过调节肠道菌群发挥抗糖尿病作用。前期研究已初步明确乳源性复合益生菌发酵的驼乳能改善链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠血糖及血脂代谢,其可能与促进胰高血糖素样肽-1（GLP-1）分泌有关,但乳源性复合益生菌是否具有抗糖尿病作用以及其可能的抗糖尿病分子机制仍不明确。本研究首先探讨乳源性复合益生菌的抗糖尿病药效学作用;其次探讨乳源性复合益生菌对肠道菌群的影响,最后探讨乳源性复合益生菌诱导结肠GLP-1分泌以及M2极化的分子机制研究。方法:第一部分:以C57BL/Ks小鼠作为正常对照组。以db/db小鼠作为T2D模型组。实验分为正常组、模型组、二甲双胍组、利拉鲁肽组、低剂量及高剂量乳源性复合益生菌组。所有组平行操作干预六周。试剂盒检测各组鼠血糖参数（FBG、OGTT、AUC、Hb Alc、C肽）及血脂（TG、TC、HDL-C、LDL-C）参数指标,HE染色观察胰腺、肝脏、附睾白色脂肪组织形态,验证乳源性复合益生菌的抗糖尿病药效学作用。第二部分:提取各组鼠粪便细菌总DNA,琼脂糖凝胶电泳及核酸蛋白仪检测细菌总DNA纯度及浓度,q RT-PCR构建目标菌群标准曲线及检测目标菌群含量,明确乳源性复合益生菌对肠道菌群的调节作用。第三部分（一）:1)气相色谱法检测粪便中乙酸、丙酸及丁酸含量,Elisa、q RT-PCR及Western blot分别检测血浆GLP-1含量、GLP-1R基因以及GLP-1蛋白表达,q RT-PCR检测结肠组织前胰高血糖素（GCG）、前激素转化酶1/3（PC1/3）、G蛋白偶联受体43（GPR43）、GPR41m RNA表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过激活短链脂肪酸受体GPR43及GPR41活性,并上调GCG、PC1/3 m RNA表达,诱导GLP-1分泌;2)Western blot及免疫组化法检测胰腺组织炎症因子（IL-1β、TNF-α、IFN-γ、NF-κB、p-NF-κB、ICAM-1、VCAM-1）表达,Elisa法检测血清抗氧化物酶（SOD、CAT及GSH/GSSG）活性,免疫组化法检测胰腺组织insulin蛋白表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过抗炎、抗氧化作用改善胰腺功能;3)Western blot及免疫组化法检测凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K及AKT）表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过激活PI3K/AKT信号通路抑制胰腺凋亡。第三部分（二）:1)试剂盒检测粪便及血清中脂多糖（LPS）含量,免疫组化法检测结肠炎症因子（ICAM-1、VCAM-1、NF-κB、p-NF-κB）表达,q RT-PCR及免疫组化法检测紧密连接蛋白及黏蛋白（Claudin-1、Occludin-1、ZO-1、Mucin-2）表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过减少LPS生成,抑制炎症因子表达,增加紧密连接蛋白及黏蛋白表达,改善肠屏障功能;2)q RT-PCR检测结肠组织抗氧化酶（CAT、SOD1、GR、GSH-Px等）表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过抗氧化作用抑制结肠氧化应激损伤;3)q RT-PCR及western blot检测M1极化因子（IL-1β、TNF-α、IFN-γ等）、M2极化因子（IL-10、Arg-1、TGF-β等）及TLRs/My D88/NF-κB表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过TLRs/My D88/NF-κB信号通路诱导结肠M2型极化。结果:第一部分:1)乳源性复合益生菌降低FBG、Hb A1c含量,升高C-肽含量及口服葡萄糖耐受能力,具有降血糖作用;2)乳源性复合益生菌降低TG、TC、LDL-C含量,具有降血脂作用;3)HE染色结果显示,乳源性复合益生菌显着改善db/db鼠胰腺、肝脏及脂肪形态。第二部分:1)乳源性复合益生菌显着减少Firmicutes/Bacteroidetes、革兰氏阴性菌（Gram-negative bacteria）、大肠埃希菌属（Escherichia coli）含量;2)乳源性复合益生菌对革兰氏阳性菌（Gram-positive bacteria）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）及屎肠球菌（Enterococcus faecium）无影响。3)乳源性复合益生菌显着增加db/db鼠产短链脂肪酸菌,包括乳酸杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、罗斯伯里氏菌属（Roseburia）、柔嫩梭菌属（Clostridium leptum）、普氏菌属（Prevotella）;第三部分（一）:1)乳源性复合益生菌显着增加丙酸及丁酸含量,上调GPR43、GPR41、GCG、PC1/3m RNA表达,增加结肠GLP-1分泌;2)乳源性复合益生菌抑制炎症因子及黏附分子（NF-κB、p-NF-κB、ICAM-1、VCAM-1）表达,增加血清抗氧化物酶（CAT、SOD、GSH/GSSG）活性,改善胰腺功能;3)乳源性复合益生菌激活PI3K/AKT信号通路抑制胰腺凋亡。第三部分（二）:1)乳源性复合益生菌减少血清及粪便LPS含量,抑制粘附（ICAM-1、VCAM-1）表达、促进紧密连接蛋白及黏蛋白（Claudin-1、Occludin-1、ZO-1、Mucin-2）表达,改善肠道屏障功能;2)乳源性复合益生菌促进结肠抗氧化物酶CAT、SOD1、GSH-Px m RNA表达,下调i NOS及COX-2 m RNA表达,抑制结肠氧化应激损伤;3)乳源性复合益生菌能抑制TLRs/My D88/NF-κB信号通路,诱导结肠由M1型促炎极化转为M2型抗炎极化。结论:1)乳源性复合益生菌有效降低db/db鼠血糖及血脂,改善胰腺、肝脏、附睾白色脂肪形态,具有抗糖尿病药效学的作用;2)乳源性复合益生菌显着增加产短链脂肪酸菌群及其代谢产物丙酸及丁酸,激活GPR43及GPR41活性,并增加GCG及PC1/3m RNA表达,促进GLP-1分泌;3)乳源性复合益生菌能增加血清抗氧化物酶活性,抑制炎症因子表达,以及激活PI3K/AKT信号通路抑制胰腺凋亡,促进胰岛素分泌;4)乳源性复合益生菌显着减少革兰氏阴性菌及其代谢产物LPS含量,增加结肠抗氧化物酶活性,抑制黏附分子表达,上调紧密连接蛋白及黏蛋白表达,改善肠道屏障功能,并通过抑制TLRs/My D88/NF-κB信号通路诱导结肠M2型极化。
刘燕[6]（2020）在《水飞蓟素对糖尿病肾病的保护作用及机制研究》文中提出研究背景:糖尿病是一组以糖脂代谢紊乱、高血糖为特征的内分泌代谢性疾病,是由胰岛素产生不足或胰岛素抵抗所致。长期的高血糖可以导致糖尿病并发症的发生,肾脏是主要的靶器官。大约40%的1型和2型糖尿病患者会发展为糖尿病肾病,是导致终末期肾病的主要原因。尽管目前有许多方法可预防和治疗糖尿病肾病,包括降糖、控制血压、肾素-血管紧张素-醛固酮系统阻断剂、抗氧化、抗炎等,但这些方法的单一防治效果并不令人十分满意,需要不断寻找治疗糖尿病肾病的新型治疗方法和药物。AKT信号转导通路是抑制细胞凋亡,促进细胞分化、存活的重要通路。该通路既是药物保护肾脏细胞的重要作用靶点,又是调节抑制细胞凋亡的上游通路。水飞蓟素是从乳蓟中提取的黄酮类化合物,它由水飞蓟宾,水飞蓟宁和水飞蓟亭等组成,其中水飞蓟宾是生物活性最高的成分。据报道,它具有抗氧化、抗炎、抗脂肪生成、保肝、抗菌、抗癌等多种药理作用,对心血管、中枢神经系统有保护作用。近年来,水飞蓟素在糖尿病及慢性并发症方面的治疗作用日益受到重视。尽管有报道称水飞蓟素对链脲佐菌素及四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠肾脏损伤有保护作用,但水飞蓟素对db/db糖尿病小鼠生化参数变化和肾脏损伤的影响,特别是水飞蓟素对db/db小鼠生物学功能的潜在分子机制尚不完全清楚。本研究通过动物实验和临床研究评估了水飞蓟素对糖尿病肾病的影响,并探讨其中潜在的作用机制。研究目的:1.通过检测db/db小鼠体重、生化参数及肾脏损伤指标的变化评估水飞蓟宾对糖尿病肾病的保护作用;2.通过检测db/db小鼠氧化应激、细胞凋亡、AKT信号通路指标探讨水飞蓟宾肾脏保护作用的潜在机制;3.进一步评价水飞蓟素对早期2型糖尿病肾脏病患者临床应用的疗效,通过检测生化指标和氧化应激指标探讨其作用机制。研究方法:1.实验一:C57BL/Ks J db/db小鼠作为研究对象,以年龄匹配野生型非糖尿病（db/m）小鼠为对照组。将血糖超过11.1mmol/l的db/db小鼠随机分为三组:db/db小鼠、db/db小鼠+水飞蓟宾（15mg/kg/day）、db/db小鼠+水飞蓟宾（30mg/kg/day）。治疗10周后,采集血液,收集尿液,并测量小鼠体重及生化参数(血糖、糖化血红蛋白、血清胰岛素、肌酐及尿素氮、尿白蛋白肌酐比值,组织病理学分析肾小球系膜扩张指数和肾小管间质损伤指数评估肾脏损伤情况。2.实验二:动物造模及分组同实验一。检测血清和肾脏组织匀浆中氧化应激指标丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化酶水平,免疫印迹法检测p-AKT、AKT、p-GSK3β、GSK3β、Bax、裂解Caspase-3蛋白水平。3.实验三:选择了80例早期2型糖尿病肾脏病患者,随机分为水飞蓟素组及安慰剂组。水飞蓟素组接受水飞蓟素胶囊（140mg/次,每日3次,N=40）,安慰剂组（N=40）接受相同剂量的安慰剂,持续12周。治疗前后测量患者的血清生化参数、尿白蛋白肌酐比值、血清丙二醛、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等氧化应激指标。研究结果:1.实验一:与正常对照组db/m小鼠相比,db/db小鼠的体重、糖化血红蛋白、胰岛素、尿素氮、肌酐、尿白蛋白肌酐比值显着升高。水飞蓟宾治疗可以阻止体重增加,降低糖化血红蛋白、胰岛素水平、尿素氮、肌酐和尿白蛋白肌酐比值,且呈剂量依赖性。与正常对照组db/m小鼠相比,db/db小鼠的肾小球系膜扩张指数和肾小管损伤指数明显升高,水飞蓟素治疗可使肾小球系膜扩张指数和肾小管损伤指数降低且呈剂量依赖性。2.实验二:与正常对照组db/m小鼠相比,db/db小鼠血清及肾脏中丙二醛水平明显升高,而超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平明显降低,给予水飞蓟宾治疗后丙二醛水平明显降低,而超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平明显升高。与正常对照组db/m小鼠相比,db/db小鼠的p-AKT水平下降,p-GSK-3β水平增加,下游蛋白Bax和裂解Caspase-3蛋白水平增加,水飞蓟宾治疗使p-AKT水平增加,并且阻止了db/db小鼠p-GSK-3β、Bax和裂解Caspase-3蛋白水平的升高。3.实验三:两组间比较,治疗前的血压,体重指数,空腹血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿素氮、肌酐、尿蛋白肌酐比值均无显着差异。治疗后两组血压,体重指数,空腹血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、尿素氮、肌酐水平差异无统计学意义,水飞蓟素组较安慰剂组治疗后总胆固醇、低密度脂蛋白水平、尿白蛋白肌酐比值及丙二醛显着降低,高密度脂蛋白水平及总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平显着升高。两组内比较,水飞蓟素组治疗前后血压,体重指数,空腹血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯、尿素氮、肌酐水平差异无统计学意义,而总胆固醇、低密度脂蛋白、尿白蛋白肌酐比值及丙二醛水平治疗后显着降低,高密度脂蛋白及总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平显着升高。安慰剂组治疗前后的血压,体重指数,血糖、糖化血红蛋白、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、尿白蛋白肌酐比值、尿素氮、肌酐及丙二醛、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平均无显着差异。研究结论:水飞蓟宾可以降低db/db小鼠的血糖和尿白蛋白肌酐比值,改善肾小球和小管间质损伤,具有肾脏保护作用。水飞蓟宾可预防db/db小鼠氧化应激,抗细胞凋亡。水飞蓟素对早期糖尿病肾病患者的临床应用同样显示出肾脏保护作用,同时具有改善氧化应激及调脂作用。水飞蓟素肾脏保护作用潜在的机制可能与其活化AKT信号通路、抗氧化应激、抗细胞凋亡和调脂等有关。但是需要进行更大样本量和更长干预时间的进一步研究,以确认水飞蓟素在糖尿病肾病患者临床应用中的有益作用,并探讨确切的肾脏保护机制。
孙璇君[7]（2020）在《基于巨噬细胞探讨Bruton酪氨酸激酶调控NLRP3炎症小体激活在糖尿病肾病炎症机制中的作用》文中研究指明背景和目的:糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是终末期肾脏病（end-stage renal disease,ESRD）的主要原因之一。研究发现,DN发生发展的过程中炎症免疫反应起着重要作用。巨噬细胞是一种常见的免疫炎性细胞,其浸润活化可作为DN发生发展的关键环节。巨噬细胞激活后可以释放炎症介质损伤细胞和组织,但是否还有其它机制会加重肾损伤,近年来引起极大关注。DN的发病机制包括炎症、纤维化等,如何诱导炎症的发生,通过何种通路,是我们需要关注的问题。Bruton酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase,BTK）,是非受体酪氨酸激酶Tec家族中的一员,其参与介导人类、动物体内不同信号通路,在细胞的增殖、分化和凋亡中起到十分重要的作用。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3）炎症小体包括NLRP3、凋亡相关点样蛋白包含caspase募集域（Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC）及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1（cysteine aspartic acid specific protease-1,caspase-1）,NLRP3募集ASC,进而活化caspase-1前体。近期有研究表明,NLRP3可单独或协调BTK加重炎症反应。在本实验中,我们将从DN患者、BTK敲基因小鼠以及骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMMs）三个层面对BTK介导下的NLRP3炎症小体如何调节DN炎症反应及其作用机制进行探讨,为DN治疗提供新的方向和策略。方法:第一部分:2型糖尿病肾病患者肾脏内巨噬细胞激活及NLRP3炎症小体的激活收集2017年1月到2019年12月于安徽医科大学第一附属医院肾内科行肾穿刺活检,并通过病理学检查确诊为糖尿病肾病的患者共16例,并对患者的临床资料进行统计。同期收集我院泌尿外科肾脏肿瘤术后病变旁2cm以上肾组织作为对照组共10例,收集我院体检中心正常体检对象的清晨空腹血作为对照组共10例。留取糖尿病肾病患者（DN组）及对照组（Control组）的血清标本,ELISA法测定血清中炎症因子白介细胞素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）,肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）水平。免疫组化检测DN组及Control组（来源于癌旁正常肾组织）肾组织中CD68和BTK的表达。免疫荧光检测DN组及Control组中CD68与诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）、BTK、p-BTK、NLRP3共表达的情况。第二部分:Bruton酪氨酸激酶基因敲除及抑制剂应用对高糖刺激下的巨噬细胞炎症小体激活的影响提取小鼠骨髓来源原代巨噬细胞（BMMs）,F4/80与CD11b标记细胞,流式细胞术鉴定细胞纯度。CCK-8法检测BTK抑制剂PCI-32765在不同浓度梯度下对BMMs活性的影响;蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）检测各组中p-BTK与BTK蛋白表达变化,选取药物最适浓度;设置不同的时间梯度,检测高糖（high glucose,HG）刺激下不同时间点NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表达变化,选取最适刺激时间。巨噬细胞分组为:C组（含5.5 mmol/L glucose）,M组（含24.5 mmol/L甘露醇+5.5 mmol/L glucose）,C+PCI组（5.5 mmol/L glucose+PCI-32765）,HG组（含30 mmol/L glucose）,HG+PCI组（30 mmol/L glucose+PCI-32765）,BTK-/-组（BTK基因敲除低糖组）,HG+BTK-/-组（BTK基因敲除高糖组）。Transwell实验观察各组BMMs的趋化功能变化;ELISA检测各组BMMs培养基上清液中炎症因子IL-1β和MCP-1水平变化;实时定量PCR检测各组BMMs中IL-1β,TNF-α和MCP-1 mRNA表达水平变化;激光共聚焦检测各组BMMs中M1型极化标志物i NOS表达变化及炎症小体蛋白NLRP3表达变化;免疫荧光共标及免疫共沉淀验证各组BMMs中NLRP3和ASC相互结合作用。Western blot实验检测各组BMMs炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC及caspase-1的表达。第三部分:Bruton酪氨酸激酶基因敲除通过减少NLRP3炎症小体激活对糖尿病小鼠肾组织损伤的保护作用及机制探讨动物分组为野生C57BL/6J小鼠组（WT）,糖尿病模型组（STZ）,BTK敲基因对照组（BTK-/-）,BTK敲基因糖尿病模型组（BTK-/-+STZ）,每组8只。造模方法为通过小鼠腹腔注射链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）,每只小鼠剂量为50 mg/kg,对照组注射相同体积的枸橼酸钠溶液,5天内进行连续注射,1周后检测随机血糖,血糖值≥16.7 mmol/L视为造模成功。小鼠常规饲养12周后收集各组小鼠血液、尿液及肾脏组织标本,测定肾重与体重之比、血糖及24小时尿白蛋白排泄率。PAS染色观察各组小鼠肾组织病理变化情况;免疫组化染色观察各组小鼠肾组织中巨噬细胞标志物F4/80、足细胞标志物WT1及Nephrin表达变化;透射电镜观察各组小鼠肾组织的超微结构,包括足细胞、足突、系膜区及基底膜的病变程度,同时测定基底膜厚度变化;Western blot检测各组小鼠肾组织中p-BTK、BTK及炎症因子IL-1β,TNF-α以及MCP-1的蛋白表达变化;实时定量PCR法检测各组小鼠肾组织中IL-1β,TNF-α和MCP-1 mRNA水平表达变化;Western blot检测各组小鼠肾组织中NLRP3、ASC及caspase-1的蛋白表达变化。结果:第一部分:2型糖尿病肾病患者肾脏内巨噬细胞激活及NLRP3炎症小体的激活ELISA结果提示,DN组血清中炎症因子IL-1β,TNF-α及MCP-1较Control组明显升高（P<0.05）;免疫组化结果提示,DN组巨噬细胞标志物CD68和BTK表达增多（P<0.05）;激光共聚焦结果提示,DN组巨噬细胞中i NOS、BTK、p-BTK、NLRP3较Control组表达明显增多（P<0.05）。DN患者血清中炎性因子水平升高,炎性介质可以将巨噬细胞招募进入肾脏,肾脏内巨噬细胞浸润增加。同时,肾脏巨噬细胞激活及BTK,NLRP3的活化均明显增加。第二部分:Bruton酪氨酸激酶基因敲除及抑制剂应用对高糖刺激下的巨噬细胞炎症小体激活的影响流式细胞术结果显示F4/80和CD11b双阳性的细胞占总细胞数的93.88%,符合实验需求下的纯度以及成熟度。实验条件优化:CCK-8结果显示抑制剂浓度在10-8到10-5 mmol/L时对细胞活性没有影响,Western blot结果显示最佳抑制剂浓度为10-6 mmol/L,最佳高糖刺激时间为12 h。Transwell结果表明高糖刺激下巨噬细胞细胞的趋化功能增加,而HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组细胞迁移能力较HG组明显减弱。ELISA结果显示HG组细胞培养基上清液中炎症因子MCP-1、TNF-α及IL-1β较C组明显升高（P<0.05）,C组与M组无明显差异（P>0.05）,HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组较HG组明显下降（P<0.05）。PCR结果显示HG组MCP-1、TNF-α及IL-1β的mRNA水平表达较C组明显上升（P<0.05）,而HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组较HG组则明显下降（P<0.05）。激光共聚焦结果提示HG组iNOS表达较C组明显上升（P<0.05）,而在HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组明显下降（P<0.05）,同时免疫荧光结果提示NLRP3炎症小体活化在HG组较C组明显增多（P<0.05）,而在HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组明显减少（P<0.05）。激光共聚焦结果提示NLRP3和ASC在细胞内表达位置一致,并且HG组表达较C组上升（P<0.05）,而HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组表达较HG组下降（P<0.05）。免疫共沉淀结果显示NLRP3可以与ASC发生共作用。Western blot结果显示HG组中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1p20蛋白表达较C组明显上升（P<0.05）,而HG+BTK-/-组和HG+PCI-32765组表达较HG组下降（P<0.05）。第三部分:Bruton酪氨酸激酶基因敲除通过减少NLRP3炎症小体激活对糖尿病小鼠肾组织损伤的保护作用及机制探讨STZ组小鼠血糖、肾体比及24小时尿蛋白排泄率较WT组有显着升高（P<0.05）;BTK-/-+STZ组小鼠相关指标较STZ组有下降（P<0.05）。PAS染色结果显示STZ组小鼠系膜扩张以及肾小管间质损伤较WT组增加,系膜扩张指数增加（P<0.05）,BTK-/-+STZ组的病理改变则得到明显缓解（P<0.05）。免疫组化结果提示STZ组较WT组中F4/80表达增加,足细胞标志物WT1及Nephrine表达减少,有统计学差异（P<0.05）,而BTK-/-+STZ组较STZ组中F4/80表达减少,WT1及Nephrine表达增加,差异有统计学差异（P<0.05）。电镜结果提示与WT组相比,STZ组基底膜厚度增宽（P<0.05）,系膜细胞及基质增生,足突部分融合,足细胞数量减少,而BTK-/-+STZ组基底膜厚度较STZ组变薄（P<0.05）,系膜细胞及基质增生减少,足细胞数量增加,足突融合减轻。蛋白免疫印迹提示BTK,p-BTK,i NOS及炎症因子IL-1β,TNF-α,MCP-1蛋白表达量在STZ组较WT组明显增多（P<0.05）,而经BTK基因敲除后表达下降（P<0.05）。实时定量PCR结果显示肾组织炎症因子TNF-α,MCP-1,IL-1βmRNA表达在STZ组较WT组明显升高（P<0.05）,而经BTK基因敲除后表达量明显降低（P<0.05）。Western blot显示炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC与caspase-1相对表达量STZ组较WT组明显上升（P<0.05）,而在BTK基因敲除后表达量明显下降（P<0.05）。结论:1、2型糖尿病肾病患者血清中炎症因子升高,肾组织内巨噬细胞浸润增加且BTK表达增多,进一步研究发现巨噬细胞内i NOS、BTK、p-BTK和NLRP3表达增多,提示DN患者处于微循环炎症状态,肾组织内巨噬细胞浸润增加,炎症小体激活增加。2、高糖可以刺激巨噬细胞活化,并且炎症因子TNF-α、MCP-1及IL-1β的表达明显上升。在作用机制方面,高糖可以增加巨噬细胞中p-BTK,NLRP3,ASC和caspase-1的蛋白表达,而BTK抑制和敲除后炎症减轻,炎症小体信号通路相关蛋白表达量降低,提示BTK可以通过NLRP3-ASC-caspase1轴调控巨噬细胞的炎症作用。3、糖尿病小鼠尿蛋白排泄增加,肾组织中p-BTK、i NOS、NLRP3、ASC、caspase1、IL-1β、TNF-α,MCP-1的蛋白表达较对照组明显上升,并且炎症因子的mRNA相对表达量增加。而经BTK基因敲除后,小鼠尿蛋白减少,肾组织内巨噬细胞浸润及足细胞损伤减少,肾组织内炎症减轻,提示BTK可能参与了糖尿病小鼠肾组织的炎症作用。进一步研究发现,肾组织内NLRP3,ASC和caspase1的蛋白表达下降,这说明BTK可以通过NLRP3-ASC-caspase1轴来介导糖尿病小鼠的肾组织内的炎症,并且BTK敲除后可以减轻小鼠糖尿病肾损伤。
王婷婷[8]（2019）在《糖尿病患者血清高尿酸水平与糖尿病肾病发生、进展的关系研究》文中提出研究目的糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）是糖尿病患者严重的微血管并发症之一,是终末期肾衰竭的主要病因,同时还可导致患者心血管相关死亡风险的上升,其特征性临床表现为蛋白尿的升高。本研究旨在探讨2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）患者蛋白尿短期进展的相关危险因素。研究方法搜集资料:采用回顾性队列研究设计,连续收集2010年4月—2015年4月210例符合入选标准的T2DM住院患者,其中男性102例,女性108例。分别收集患者2次住院（分别作为基线和随访资料）的一般资料、生化检测结果和用药情况。实验设计:1、T2DM患者基线临床数据比较2、蛋白尿进展组与非进展组的尿酸水平及其临床特征分析3、基线蛋白尿的风险因素分析4、采用多因素logistic回归模型进行分析血清尿酸水平与蛋白尿进展的关系。研究结果1、基线糖尿病患者中,大量蛋白尿组血清尿酸水平明显高于正常蛋白尿组（5.58 vs 4.67 mg/dL,P=0.002）。2、经平均2.5年随访后,其中51例蛋白尿（24.6%）有进展,156例（75.4%）无进展。蛋白尿进展组血清尿酸水平明显高于蛋白尿非进展组（5.50 vs 4.89 mg/dL,P=0.009）。3、高血压、空腹血糖、血清尿酸水平为蛋白尿的危险因素,而降糖药物二甲双胍的使用为蛋白尿的保护因素。4、多因素logistic回归分析结果显示,在不同的模型中,校正了混杂因素后,血清尿酸水平与蛋白尿进展均呈显着的正相关,是蛋白尿进展的独立危险因素,基线尿酸水平每升高1mg/dl,蛋白尿短期进展的风险提高约34%。研究结论T2DM患者中,血清高尿酸水平可能是T2DM患者白蛋白尿短期进展的独立危险因素,对高尿酸进行早期干预可能会延缓糖尿病肾病的发展。
赵秋宸[9]（2019）在《HDAC3在血脑屏障损伤中的作用及机制研究》文中研究表明工作目的:血脑屏障是由内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞等构成的复杂结构,位于脑实质和血管系统之间。血脑屏障的存在主要是将中枢神经系统与外周组织分开。为了维持中枢神经系统内的稳态平衡。血脑屏障控制着从血液到大脑以及从大脑到血液的物质、营养和细胞转移。包括脑损伤、缺血性中风、多发性硬化症、癫痫、帕金森病、阿尔茨海默病和重度抑郁症在内的多种神经系统疾病均发现了血脑屏障破坏的病理学基础。血脑屏障完整性的丧失将导致循环内的细胞因子和免疫细胞进入中枢神经系统,进一步激活神经胶质细胞并引起细胞外环境的改变,对神经系统的功能造成十分严重的破坏。因此,在神经系统疾病中探索一种有效的保护血脑屏障的方法十分必要,将会为临床上的治疗提供新的思路进而改善患者预后并减轻其造成的巨大社会负担。在多种神经系统疾病中,组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）及组蛋白去乙酸化酶3（Histone deacetylase3,HDAC3）的作用已被发掘并应用。然而不同HDAC亚型,尤其是HDAC3在神经系统血脑屏障方面的调控作用还知之甚少。已知HDAC3在调控神经炎症和神经保护方面的作用,在多种神经系统疾病造成的血脑屏障损伤,调控HDAC3是否发挥针对性的保护作用还不得而知。研究方法:本研究中,在不同的部分我们探索了特异性抑制HDAC3在不同神经系统疾病血脑屏障损伤模型中的作用及机制。第一部分中,我们使用氧糖剥夺/复氧（Oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）处理人脑微血管内皮细胞（Human Brain Microvascular Endothelial cells,HBMEC）模拟卒中血脑屏障损伤的体外模型。第二部分中,我们使用高糖合并白介素1β（High glucose and interleukin 1β,HG-IL1β）处理HBMEC模拟2型糖尿病血脑屏障（The blood-brain barrier,BBB）损伤的体外模型,以及db/db基因鼠的2型糖尿病体内模型。第三部分中,我们在db/db鼠上建立光化学栓塞的卒中模型以模拟2型糖尿病合并脑卒中。在以上模型中我们使用HDAC3特异性抑制剂RGFP966或小分子干扰核糖核酸（Small interfering RNA,siRNA）干预。通过荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（Fluorescein isothiocyanate labeled dextran,FITC-dextran）渗透实验、跨上皮细胞膜电阻（Transendothelial electrical resistance,TEER）实验、荧光素钠（Sodium fluorescein,NaFl）渗透实验、依文思蓝染色和免疫荧光染色等方法,评估给药前后体内体外血脑屏障的损伤情况。运用蛋白印迹法、免疫荧光染色、定量聚合酶链式反应（Polymerase chainreaction,PCR）和分子活性检测试剂盒观察HDAC3在损伤后的表达及活性变化。使用蛋白印迹法、免疫荧光染色、定量PCR和免疫共沉淀等方法探究保护作用中的具体机制。并同时使用前肢踩空试验、拉力试验和Y字迷宫来观察保护血脑屏障的同时对损伤后行为学的影响。结果:（1）在HBMEC的OGD/R模型中,伴随着内皮细胞的损伤,HDAC3进入细胞核增多且活性升高而过氧化物酶体增殖物活化受体γ（Peroxisome proliferator-activatedreceptorgamma,PPARγ）的活性下降。特异性抑制HDAC3可以通过乙酰化修饰的方式增强PP ARγ的活性、改善Claudin-5的在内皮细胞上的表达并减轻HBMEC的通透性增加。（2）在2型糖尿病诱导血脑屏障损伤的体内和体外研究证实,特异性抑制HDAC3可以保护2型糖尿病诱导的血脑屏障损伤。其发挥保护作用的机制与小分子核糖核酸-200a（microRNA-200a,miR-200a）/Keleh样环氧氯丙烷相关蛋白 1（Keleh-like ECH-associatedprotein l,Keapl）/核因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-relatedfactor2,Nrf2）通路的激活有关。（3）而在2型糖尿病合并卒中模型中,HDAC3的信使RNA（messenger RNA,mRNA）表达水平较非糖尿病卒中组及对照组明显升高。而在卒中后使用HDAC3的特异性抑制剂RGFP966,可以显着降低卒中合并2型糖尿病模型鼠的脑梗死体积与前肢踩空试验、Y字迷宫实验的行为学评分,这些保护作用可能是与特异性抑制HDAC3后对血脑屏障的通透性的保护作用有关。结论:特异性抑制HDAC3可在多种血脑屏障损伤模型中发挥保护作用,是其在神经系统疾病中发挥保护作用的新机制,可能会为临床上治疗血脑屏障损伤提供新的靶点。
李莉芳[10]（2019）在《Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导Apelin-13/APJ促动脉粥样硬化作用研究》文中进行了进一步梳理背景与目的:动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一个复杂的病理过程,其发病机制仍未完全清楚。研究表明Apelin/APJ系统与AS形成有密切关系,但Apelin/APJ系统在AS过程中的具体作用和机制仍不明确。Pannexin-1半通道-NLRP3途径在细胞增殖、迁移、炎症反应、氧化应激等过程中发挥着重要作用,参与了AS形成的过程。本研究旨在探讨Apelin-13是否通过Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导血管平滑肌增殖、巨噬细胞炎症反应、血管内皮氧化应激、单核细胞-内皮细胞粘附,进而探讨Apelin-13是否对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成产生影响,及Pannexin-1半通道-NLRP3途径在此过程中的作用,为AS的治疗提供新的研究靶点。第一部分Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导Apelin-13/APJ促人主动脉血管平滑肌细胞增殖目的:血管平滑肌细胞增殖与AS密切相关。本实验目的旨在研究Apelin-13对HA-VSMCs增殖的影响,以及在此过程中Pannexin-1半通道-NLRP3途径所发挥的作用。方法:1.采用MTT法、Brud分析法检测不同浓度Apelin-13对HA-VSMCs增殖的影响,以及Apelin-13刺激不同时间对HA-VSMCs增殖的影响。2.采用q RT-PCR法和Western Blot法,检测Apelin-13对HA-VSMCs中Pannexin-1 m RNA和蛋白表达的影响;免疫荧光法检测Apelin-13对HAVSMCs中Pannexin-1表达的影响;q RT-PCR法和Western Blot法检测Apelin-13刺激HA-VSMCs后,NLRP3m RNA和蛋白的表达;3.采用ATP生物荧光法检测不同浓度Apelin-13对HA-VSMCs中ATP释放的影响。4.应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理后,Western Blot检测Apelin-13对HA-VSMCs中Pannexin-1、NLRP3蛋白表达的影响。5.应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理后,ATP生物荧光检测Apelin-13对HA-VSMCs中ATP释放的影响,MTT法、Brud法检测Apelin-13对HA-VSMCs增殖的影响。6.应用si RNA-NLRP3转染,沉默NLRP3后,MTT法、Brud法检测Apelin-13对HA-VSMCs增殖的影响。结果:1.MTT法、Brud法检测结果显示,Apelin-13呈浓度（0-10μM）和时间（0-72h）依赖性促HA-VSMCs增殖。2.q RT-PCR法和Western Blot法检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HA-VSMCs中Pannexin-1 m RNA和蛋白的表达。免疫荧光法检测结果显示,Apelin-13促进HA-VSMCs中Pannexin-1蛋白的表达。3.ATP生物荧光检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HA-VSMCs中ATP释放。4.q RT-PCR法和Western Blot法检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HA-VSMCs中NLRP3m RNA和蛋白的表达。5.应用Probenecid阻断Pannexin-1半通道后,能显着抑制Apelin-13促HA-VSMCs中Pannexin-1和NLRP3蛋白的表达。6.应用Probenecid阻断Pannexin-1半通道,能显着抑制Apelin-13促HA-VSMCs ATP释放的作用,抑制Apelin-13促HA-VSMCs增殖的作用。7.应用si RNA-NLRP3转染后,NLRP3蛋白表达下降,显着抑制Apelin-13促HA-VSMCs增殖的作用。小结:Apelin-13能促进HA-VSMCs增殖,Pannexin-1半通道-NLRP3途径参与了Apelin-13促HA-VSMCs增殖过程,阻断Pannexin-1半通道-NLRP3途径后,Apelin-13促HA-VSMCs增殖的作用受到明显抑制。第二部分Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导Apelin-13/APJ促人源性巨噬细胞（THP-1）炎症反应目的:巨噬细胞浸润及其炎症因子释放引起的炎症反应在AS的发生发展过程中起到重要作用。本实验的目的旨在研究Apelin-13对人源性巨噬细胞（THP-1）炎症反应的影响,以及在此过程中Pannexin-1半通道-NLRP3途径所发挥的作用。方法:1.应用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测不同浓度Apelin-13刺激后,THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的水平。2.采用q RT-PCR法和Western Blot法,检测Apelin-13刺激THP-1巨噬细胞后,Pannexin-1m RNA和蛋白的表达;免疫荧光法检测Apelin-13对THP-1巨噬细胞中Pannexin-1表达的影响;q RT-PCR法和Western Blot法检测Apelin-13刺激THP-1巨噬细胞后,NLRP3 m RNA和蛋白的表达。3.采用ATP生物荧光检测不同浓度Apelin-13刺激后,THP-1巨噬细胞ATP释放的水平。4.应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理THP-1巨噬细胞后,Western Blot法检测Apelin-13对THP-1中Pannexin-1、NLRP3蛋白表达的影响。5.应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理THP-1巨噬细胞后,ELISA检测Apelin-13对IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的影响,ATP生物荧光检测Apelin-13对THP-1巨噬细胞ATP释放的影响。6.应用si RNA-NLRP3转染,沉默NLRP3后,ELISA检测Apelin-13刺激THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的作用。结果:1.ELISA检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性刺激THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌。2.q RT-PCR和Western Blot检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进THP-1巨噬细胞中Pannexin-1m RNA和蛋白的表达。免疫荧光法检测结果显示,Apelin-13促进THP-1巨噬细胞中Pannexin-1蛋白的表达。3.ATP生物荧光检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性刺激THP-1巨噬细胞ATP的释放。4.q RT-PCR和Western Blot检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进THP-1巨噬细胞中NLRP3 m RNA和蛋白的表达。5.应用Probenecid阻断Pannexin-1半通道,能显着抑制Apelin-13促THP-1巨噬细胞中Pannexin-1和NLRP3蛋白的表达。6.应用Probenecid阻断Pannexin-1半通道,能显着抑制Apelin-13促THP-1巨噬细胞ATP释放的作用,抑制Apelin-13促THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的作用。7.应用si RNA-NLRP3转染后,NLRP3蛋白表达下降,能显着抑制Apelin-13促THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α分泌的作用。小结:Apelin-13能促进THP-1巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌,Pannexin-1半通道-NLRP3途径参与了这一过程。阻断Pannexin-1半通道-NLRP3途径后,Apelin-13促THP-1巨噬细胞炎症反应的作用明显受到抑制。促内皮细胞氧化应激以及单核细胞-内皮细胞粘附第三部分Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导Apelin-13/APJ目的:内皮细胞氧化应激以及单核细胞-内皮细胞粘附在AS的过程中起到重要作用。本实验目的旨在研究Apelin-13对内皮细胞氧化应激以及单核细胞-内皮细胞粘附的影响,以及在此过程中Pannexin-1半通道-NLRP3途径所发挥的作用。方法:1.采用DCFH-DA探针标记,流式细胞术检测Apelin-13对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）中ROS生成的影响。2.采用q RT-PCR法和Western Blot法,检测Apelin-13对HUVECs中Pannexin-1、NLRP3 m RNA和蛋白的表达。3.采用ATP生物荧光法检测不同浓度Apelin-13对HUVECs中ATP释放的影响。4.应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理后,Western Blot检测Apelin-13对HUVECs中Pannexin-1和NLRP3蛋白表达的影响;用ATP生物荧光法检测Apelin-13对HUVECs中ATP释放的影响;流式细胞术检测Apelin-13对HUVECs中ROS水平的影响。5.应用si RNA-NLRP3转染,沉默NLRP3后,流式细胞术检测Apelin-13对HUVECs中ROS水平的影响。6.用Calcein AM标记单核细胞,多功能酶标仪检测Apelin-13刺激后单核细胞-HUVECs粘附的情况;应用Pannexin-1半通道的阻断剂Probenecid预处理后,检测Apelin-13刺激后单核细胞-HUVECs粘附的情况;应用si RNA-NLRP3转染,沉默NLRP3后,检测Apelin-13刺激后单核细胞-HUVECs粘附的情况。结果:1.流式细胞术检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性和时间依赖（0-72h）性促进HUVECs中ROS生成。2.q RT-PCR和Western Blot检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HUVECs中Pannexin-1 m RNA和蛋白的表达。3.ATP生物荧光检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HUVECs中ATP的释放。4.q RT-PCR和Western Blot检测结果显示,Apelin-13呈浓度依赖（0-10μM）性促进HUVECs中NLRP3 m RNA和蛋白的表达;5.应用Probenecid阻断Pannexin-1半通道后,能显着抑制Apelin-13促HUVECs中Pannexin-1和NLRP3蛋白的表达,抑制Apelin-13促HUVECs中ROS生成以及ATP释放的作用。6.应用si RNA-NLRP3转染后,NLRP3蛋白表达下降,显着抑制Apelin-13促HUVECs中ROS生成的作用。7.用Calcein AM标记单核细胞,多功能酶标仪检测结果显示,Apelin-13能显着促进单核细胞-HUVECs的粘附;Probenecid能显着抑制Apelin-13促单核细胞-HUVECs粘附的作用;应用si RNA-NLRP3转染,沉默NLRP3表达后,能显着抑制Apelin-13诱导单核细胞-HUVECs的粘附。Apelin-13能促进HUVECs中ROS的生成,促进单核细胞-HUVECs的粘附,Pannexin-1半通道-NLRP3途径参与了这一过程。阻断Pannexin-1半通道-NLRP3途径后,Apelin-13促HUVECs中ROS生成和促进单核细胞-HUVECs粘附的作用均受到抑制。小结:第四部分Pannexin-1半通道-NLRP3途径参与Apelin-13/APJ促ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化目的:采用高脂高胆固醇饮食喂养诱导ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化（AS）形成,观察不同浓度Apelin-13对ApoE-/-小鼠AS形成的影响,进一步探讨Pannexin-1半通道-NLRP3途径是否参与Apelin-13促ApoE-/-小鼠AS。方法:1.实验动物造模和分组:雄性ApoE-/-小鼠作为研究对象,随机分为3组:模型组、低剂量Apelin-13处理组（1 mg/kg）、高剂量Apelin-13处理组（5 mg/kg）。2.将各组小鼠主动脉根部的石蜡切片用Movat染色法染色,在显微镜下观察组织切片并拍照,计算各组小鼠AS斑块的面积;3.对各组小鼠主动脉弓分支和主动脉根部的石蜡切片进行VerhoeffVan Gieson染色,在显微镜下观察斑块的着色,计算各组AS斑块的破裂率和破裂面积。4.用免疫组化法检测ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块中α-SMC-actin、MAC-3含量的变化。5.天狼星红染色检测主动脉AS斑块中胶原纤维的含量。6.用Western blot检测ApoE-/-小鼠主动脉中Pannexin-1、NLRP3蛋白的表达。结果:1.Movat染色结果显示,Apelin-13能促进ApoE-/-小鼠主动脉AS的形成。高剂量Apelin-13组小鼠AS损伤面积明显大于模型组小鼠AS损伤面积（P<0.05）。2.Verhoeff-Van Gieson染色结果显示,高剂量Apelin-13组ApoE-/-小鼠主动脉根部的斑块破裂率和平均破裂面积较低剂量组、模型组明显增加（P<0.05）,但对小鼠主动脉弓分支的破裂率和平均破裂面积均未见显着性影响。3.免疫组化检测结果显示,各组小鼠AS斑块中α-actin的表达水平没有显着性差异。高剂量Apelin-13组中MAC-3阳性反应面积占斑块总面积明显增加,与模型组和低剂量Apelin-13组相比有显着性增加（P<0.05）。提示高剂量外源性Apelin-13可以显着促进巨噬细胞浸润,加重小鼠AS斑块的形成。4.天狼星红染色结果显示各组小鼠主动脉动脉粥样斑块内胶原成分没有显着性差异。5.Western blot检测结果显示,Apelin-13显着增加ApoE-/-小鼠主动脉中Pannexin-1和NLRP3蛋白的表达。小结:Apelin-13能促进ApoE-/-小鼠AS的发展,使AS斑块中巨噬细胞浸润显着增加,Pannexin-1半通道-NLRP3途径可能参与了这一过程。总结论:Pannexin-1半通道-NLRP3途径能够介导Apelin-13/APJ促进HAVSMCs、THP-1巨噬细胞炎症反应、HUVECs氧化应激和单核内皮细胞粘附。Pannexin-1半通道-NLRP3途径可能参与Apelin-13/APJ促ApoE-/-小鼠AS的形成。
二、类2型糖尿病db/db鼠的体外巨噬细胞细胞因子及一氧化氮分泌改变（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、类2型糖尿病db/db鼠的体外巨噬细胞细胞因子及一氧化氮分泌改变（论文提纲范文）
（1）盐酸小檗碱外用对糖尿病创面愈合的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1. 创面的修复过程 |
| 1.1 凝血期 |
| 1.2 炎症期 |
| 1.3 增殖期 |
| 1.4 重塑期 |
| 2. 糖尿病创面的修复异常 |
| 2.1 糖尿病创面血管生成减少 |
| 2.2 糖尿病创面炎症消退延迟 |
| 2.3 糖尿病创面氧化应激增强 |
| 3. 糖尿病创面的治疗现状及盐酸小檗碱的应用 |
| 3.1 盐酸小檗碱对葡萄糖代谢的影响 |
| 3.2 盐酸小檗碱对脂质代谢的影响 |
| 3.3 盐酸小檗碱对胰岛素抵抗的影响 |
| 3.4 盐酸小檗碱对血管内皮细胞的影响 |
| 3.5 盐酸小檗碱对炎症反应的影响 |
| 3.6 盐酸小檗碱对氧化应激的影响 |
| 第二部分 盐酸小檗碱外用对糖尿病大鼠创面愈合的作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验结果 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 糖尿病大鼠一般状态的观察 |
| 2.2 各组大鼠的血糖变化 |
| 2.3 各组大鼠的体重变化 |
| 2.4 创面模型制备后各组创面愈合情况的观察 |
| 2.5 各组大鼠创面愈合率的比较 |
| 2.6 各组大鼠创面愈合时间的比较 |
| 2.7 各组大鼠创面组织HE染色 |
| 2.8 各组大鼠创面组织Masson染色 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 盐酸小檗碱外用对糖尿病创面AGEs及成纤维细胞的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 各组大鼠创面AGEs的含量 |
| 2.2 各组大鼠创面胶原及RAGE受体的蛋白表达情况 |
| 2.3 各组大鼠创面中成纤维细胞增殖及凋亡水平的差异 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第四部分 盐酸小檗碱对人成纤维细胞的影响及作用机制 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 AGEs-HSA对糖尿病创面愈合过程中人真皮来源成纤维细胞的影响 |
| 2.2 盐酸小檗碱对AGEs刺激的成纤维细胞的影响及作用机制 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）利拉鲁肽通过上调PPARα调控小胶质细胞/巨噬细胞极化改善糖尿病大鼠脑缺血损伤的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 过氧化物酶体增殖物激活受体 α 与脑梗死的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）白芷对2型糖尿病小鼠皮肤溃疡促愈的作用机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、白芷对2型糖尿病小鼠创面愈合的作用 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.2.1 药物 |
| 1.2.2 试剂 |
| 1.2.3 仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 皮肤溃疡模型制备及分组 |
| 1.3.2 给药方法 |
| 1.3.3 HE染色 |
| 1.3.4 Masson染色 |
| 1.3.5 免疫组化检测糖尿病小鼠创面组织中炎症及血管内皮细胞标记物的表达 |
| 1.4 统计学方法 |
| 1.5 结果 |
| 1.5.1 皮肤溃疡模型建立后小鼠生存情况 |
| 1.5.2 AD给药后2型糖尿病小鼠体重变化情况 |
| 1.5.3 AD给药后2型糖尿病小鼠血糖变化情况 |
| 1.5.4 AD给药后2型糖尿病小鼠创面大体形态改变 |
| 1.5.5 AD给药后对2型糖尿病小鼠创面闭合的影响 |
| 1.5.6 AD给药后对2型糖尿病小鼠创面组织病理形态影响 |
| 1.5.7 AD给药后2型糖尿病小鼠创面炎症细胞浸润情况 |
| 1.5.8 AD给药后2型糖尿病小鼠创面血管形成情况 |
| 1.5.9 AD给药后对2型糖尿病小鼠创面胶原纤维形成影响 |
| 1.6 讨论 |
| 1.6.1 慢性难愈性糖尿病皮肤溃疡修复过程中异常炎症反应 |
| 1.6.2 慢性难愈性糖尿病皮肤溃疡修复过程中血管形成异常 |
| 1.6.3 白芷与糖尿病创面愈合 |
| 1.7 小结 |
| 二、白芷对2型糖尿病小鼠创面巨噬细胞极化的调控作用 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 中药提取物制备 |
| 2.3.2 免疫荧光双染检测创面组织中iNOS/Arg-1与CD68 的表达 |
| 2.3.3 Western Blotting检测创面组织中巨噬细胞极化相关蛋白的表达 |
| 2.3.4 细胞培养相关溶液配制 |
| 2.3.5 细胞冻存 |
| 2.3.6 细胞复苏 |
| 2.3.7 细胞传代 |
| 2.3.8 体外诱导巨噬细胞极化 |
| 2.3.9 CCK-8检测巨噬细胞活性 |
| 2.3.10 体外巨噬细胞AD给药及分组情况 |
| 2.3.11 体外巨噬细胞与内皮细胞共培养体系建立与分组 |
| 2.3.12 免疫荧光染色检测巨噬细胞中iNOS和 Arg-1 的表达 |
| 2.3.13 Western Blotting检测巨噬细胞中巨噬细胞极化相关蛋白表达 |
| 2.4 统计学方法 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 AD对2型糖尿病小鼠创面巨噬细胞极化的影响 |
| 2.5.2 AD对2 型糖尿病小鼠创面炎症因子与VEGF表达的影响 |
| 2.5.3 AD对2 型糖尿病小鼠创面调控巨噬细胞极化的SOCS蛋白表达的影响 |
| 2.5.4 体外诱导巨噬细胞极化及AD给药后对巨噬细胞活性影响 |
| 2.5.5 AD对体外诱导巨噬细胞极化的影响 |
| 2.5.6 AD干预后的巨噬细胞对与其共培养的内皮细胞趋化作用 |
| 2.5.7 AD对体外诱导极化后巨噬细胞中炎症因子及VEGF蛋白表达的影响 |
| 2.5.8 AD对体外诱导极化后巨噬细胞中SOCS1及SOCS3 蛋白表达的影响 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 巨噬细胞极化与糖尿病创面难愈的关系 |
| 2.6.2 SOCS蛋白对巨噬细胞极化的作用 |
| 2.6.3 AD对2型糖尿病小鼠创面中巨噬细胞极化的影响 |
| 2.7 小结 |
| 三、白芷促2型糖尿病小鼠创面血管成熟及体外管状结构形成作用及机制 |
| 3.1 实验对象 |
| 3.2 主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫荧光双染检测创面组织新生血管中CD31与α-SMA的定位与表达 |
| 3.3.2 免疫组织化学法检测db/db小鼠创面组织中FOXO1与Ang-2 定位及表达情况 |
| 3.3.3 Western Blotting检测创面组织中FOXO1,Ang-2 等蛋白表达水平 |
| 3.3.4 体外对高糖缺氧下内皮细胞细胞AD给药及分组情况 |
| 3.3.5 CCK-8检测内皮细胞活性 |
| 3.3.6 内皮细胞与周细胞共培养体系的建立及分组 |
| 3.3.7 内皮细胞与周细胞matrigel共成管体系的建立及分组 |
| 3.4 统计学方法 |
| 3.5 结果 |
| 3.5.1 AD对2型糖尿病小鼠创面组织新生血管成熟的影响 |
| 3.5.2 AD对2 型糖尿病小鼠创面组织中FOXO1,Ang-2 表达的影响 |
| 3.5.3 AD对2 型糖尿病小鼠创面组织FOXO1,Ang-2 等蛋白表达的影响 |
| 3.5.4 建立内皮细胞体外缺氧模型及AD给药后测定内皮细胞活性 |
| 3.5.5 AD干预高糖缺氧下内皮细胞后对周细胞迁移能力的影响 |
| 3.5.6 AD干预高糖缺氧下内皮细胞后对内皮细胞与周细胞体外管状结构形成的影响 |
| 3.5.7 AD对高塘缺氧条件下内皮细胞中FOXO1,Ang-2 等蛋白表达的影响 |
| 3.6 讨论 |
| 3.6.1 周细胞与糖尿病创面新生血管成熟障碍 |
| 3.6.2 FOXO1、Ang-2 与糖尿病创面新生血管成熟障碍 |
| 3.6.3 白芷与糖尿病创面新生血管成熟障碍 |
| 3.7 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 白芷的化学成分与药理作用的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）基于PKM2调控M1型巨噬细胞活化途径探讨黄葵素对糖尿病肾病模型肾保护作用的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 中医学对糖尿病肾病病因病机的认识 |
| 1.1 病因 |
| 1.2 病机 |
| 1.3 黄蜀葵花及其制剂治疗糖尿病肾病的作用机制研究 |
| 1.4 问题与展望 |
| 2. 现代医学基于免疫炎症角度对糖尿病肾病的认识 |
| 2.1 糖尿病肾病与免疫炎症机制 |
| 2.2 免疫细胞 |
| 2.3 免疫细胞受体 |
| 2.4 炎性细胞因子 |
| 2.5 趋化因子 |
| 2.6 粘附分子 |
| 2.7 免疫复合物沉积 |
| 2.8 补体激活 |
| 2.9 问题和展望 |
| 第二部分 动物实验 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验主要仪器设备 |
| 1.5 实验主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 给药方案 |
| 2.3 小鼠一般情况观察 |
| 2.4 小鼠血清、尿液和肾脏组织样本采集 |
| 2.5 肾脏组织苏木精-伊红(HE)染色、胶原纤维(Masson)染色 |
| 2.6 小鼠肾组织免疫组化法检测 |
| 2.7 实时荧光定量聚合酶链技术(RT-qPCR)检测 |
| 2.8 蛋白质印迹法(WB)检测 |
| 2.9 酶联免疫吸附法(ELISA)检测 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 各组小鼠一般状态的观察 |
| 3.2 各组小鼠体重、肾脏指数的比较 |
| 3.3 各组小鼠尿ACR、血Scr和BUN的比较 |
| 3.4 各组小鼠肾脏病理改变的比较 |
| 3.5 各组小鼠肾脏纤维化指标(Collagen Ⅲ、Vimentin)蛋白表达的比较 |
| 3.6 各组小鼠炎症因子表达结果的比较 |
| 3.7 各组小鼠肾组织M1型巨噬细胞活化结果的比较 |
| 3.8 各组小鼠肾脏组织PKM2蛋白和mRNA的表达比较 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 细胞实验 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 实验主要仪器设备 |
| 1.5 实验主要试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养、复苏、传代及冻存 |
| 2.2 Cell Counting Kit (CCK)-8实验 |
| 2.3 流式细胞术 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 不同剂量黄葵素(TFA)对RAW264.7细胞的存活率影响 |
| 3.2 不同糖浓度刺激RAW264.7细胞,筛选巨噬细胞M1型活化最佳糖浓度 |
| 3.3 黄葵素对RAW264.7巨噬细胞活化为M1型状态的影响 |
| 3.4 黄葵素对RAW264.7巨噬细胞活化为M1型下PKM2蛋白的影响 |
| 4. 小结 |
| 第四部分 讨论 |
| 结论 |
| 1. 研究的主要成果 |
| 2. 研究存在的不足和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）基于肠道菌群探讨乳源性复合益生菌诱导结肠GLP-1分泌及M2极化的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 乳源性复合益生菌的抗糖尿病药效学研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 乳源性复合益生菌对DB/DB鼠肠道菌群影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 乳源性复合益生菌的抗糖尿病分子机制研究 |
| (一)乳源性复合益生菌诱导结肠GLP-1分泌的分子机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| (二)乳源性复合益生菌诱导结肠M2极化的分子机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 Ⅱ型糖尿病与肠道菌群的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）水飞蓟素对糖尿病肾病的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 水飞蓟宾对db/db糖尿病小鼠的肾脏保护作用 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要仪器和设备 |
| 2.2 主要材料及试剂 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.4 实验设计 |
| 2.5 血液和组织标本的收集 |
| 2.6 生化参数测量 |
| 2.6.1 体重的测量 |
| 2.6.2 空腹血糖测量 |
| 2.6.3 糖化血红蛋白测定 |
| 2.6.4 空腹胰岛素测定 |
| 2.6.5 肾功能测定 |
| 2.6.6 尿白蛋白肌酐比值测定 |
| 2.7 组织学分析 |
| 2.7.1 肾组织石蜡包埋 |
| 2.7.2 PAS染色 |
| 2.7.3 肾小球系膜扩张评分和肾小管间质损伤评分 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 水飞蓟宾对db/db小鼠的代谢参数的影响 |
| 3.1.1 体重 |
| 3.1.2 空腹血糖 |
| 3.1.3 糖化血红蛋白 |
| 3.1.4 空腹胰岛素 |
| 3.2 水飞蓟宾对db/db小鼠肾脏功能损伤的影响 |
| 3.2.1 尿素氮 |
| 3.2.2 肌酐 |
| 3.2.3 尿白蛋白肌酐比值 |
| 3.3 水飞蓟宾对db/db小鼠肾脏组织病理学的影响 |
| 3.3.1 PAS染色结果 |
| 3.3.2 肾小球系膜扩张评分和肾小管损伤评分 |
| 4 讨论 |
| 4.1 糖尿病肾病的发生和发展 |
| 4.2 水飞蓟素的特征 |
| 4.3 实验动物模型的选择 |
| 4.4 水飞蓟素的肾脏保护作用 |
| 4.4.1 水飞蓟素对体重的影响 |
| 4.4.2 水飞蓟素对血糖的影响 |
| 4.4.3 水飞蓟素对血胰岛素水平的影响 |
| 4.4.4 水飞蓟素对肾脏的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 水飞蓟宾对db/db糖尿病小鼠的肾脏保护作用的机制探讨 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要仪器和设备 |
| 2.2 主要材料及试剂 |
| 2.3 动物和处理 |
| 2.4 氧化应激指标的测量 |
| 2.4.1 血清氧化应激指标的测量 |
| 2.4.2 肾脏组织氧化应激指标的测量 |
| 2.5 肾脏组织中AKT信号通路的检测 |
| 2.5.1 组织蛋白提取 |
| 2.5.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 2.5.3 Western Blot操作流程 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 水飞蓟宾对db/db小鼠氧化应激的影响 |
| 3.1.1 水飞蓟宾对血清氧化应激指标的影响 |
| 3.1.2 水飞蓟宾对肾脏氧化应激指标的影响 |
| 3.2 水飞蓟宾对db/db小鼠AKT信号通路的影响 |
| 3.2.1 水飞蓟宾对AKT蛋白的影响 |
| 3.2.2 水飞蓟宾对GSK-3β蛋白的影响 |
| 3.2.3 水飞蓟宾对Bax和裂解Caspase-3 蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 糖尿病肾病的发病机制 |
| 4.2 水飞蓟素对糖尿病肾脏的保护作用 |
| 4.3 水飞蓟素的肾脏保护机制——抗氧化应激 |
| 4.3.1 糖尿病肾病与氧化应激 |
| 4.3.2 水飞蓟素的抗氧化应激作用 |
| 4.4 水飞蓟素的肾脏保护机制——抗细胞凋亡 |
| 4.4.1 糖尿病肾病与细胞凋亡 |
| 4.4.2 糖尿病肾病和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT信号通路 |
| 4.4.3 AKT信号通路与细胞凋亡 |
| 4.4.4 水飞蓟素对肾组织AKT信号通路的影响 |
| 4.5 水飞蓟素肾脏保护作用的其他机制探讨 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 水飞蓟素胶囊治疗早期糖尿病肾病的临床观察 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 研究人群 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.3 人体指标测量 |
| 2.4 生化参数指标测定 |
| 2.5 氧化应激指标测定 |
| 2.6 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 基线特征比较 |
| 3.2 人体测量指标比较 |
| 3.3 生化参数指标比较 |
| 3.4 血清氧化应激指标比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 糖尿病肾病的治疗现状 |
| 4.2 水飞蓟素的作用及安全性 |
| 4.3 水飞蓟素对糖尿病肾病的动物模型研究 |
| 4.4 水飞蓟素对糖尿病肾病的临床研究 |
| 4.5 水飞蓟素对糖尿病肾病相关危险因素的作用探讨 |
| 4.5.1 水飞蓟素与高血糖 |
| 4.5.2 水飞蓟素与高血压 |
| 4.5.3 水飞蓟素与肥胖 |
| 4.5.4 水飞蓟素与脂质代谢 |
| 4.5.5 水飞蓟素与氧化应激 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 水飞蓟素与糖尿病及其慢性并发症 |
| 参考文献 |
（7）基于巨噬细胞探讨Bruton酪氨酸激酶调控NLRP3炎症小体激活在糖尿病肾病炎症机制中的作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 2型糖尿病肾病患者肾脏内巨噬细胞激活及NLRP3炎症小体的激活 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 第二部分 Bruton酪氨酸激酶基因敲除及抑制剂应用对高糖刺激下的巨噬细胞炎症小体激活的影响 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 第三部分 Bruton酪氨酸激酶基因敲除通过减少NLRP3 炎症小体激活对糖尿病小鼠肾组织损伤的保护作用及机制探讨 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 NLRP3炎症小体在糖尿病肾病中的作用 |
| 参考文献 |
（8）糖尿病患者血清高尿酸水平与糖尿病肾病发生、进展的关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景、目的和意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究目的和意义 |
| 2 研究对象、内容及统计学方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 纳入标准 |
| 2.1.2 诊断标准 |
| 2.1.3 排除标准 |
| 2.1.4 伦理学要求 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.2.1 基线和随访数据采集 |
| 2.2.2 研究对象分组 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 T2DM患者基线临床数据比较 |
| 3.2 蛋白尿进展组与非进展组的尿酸水平及其临床特征分析 |
| 3.3 基线蛋白尿的风险因素分析 |
| 3.4 血清尿酸水平与蛋白尿进展的关系 |
| 4 讨论 |
| 4.1 糖尿病肾病危险因素的探讨 |
| 4.1.1 性别 |
| 4.1.2 血糖水平 |
| 4.1.3 糖尿病病程 |
| 4.1.4 高血压 |
| 4.1.5 年龄 |
| 4.1.6 血脂异常 |
| 4.1.7 体重指数(Body mass index,BMI) |
| 4.1.8 吸烟 |
| 4.1.9 维生素D缺乏 |
| 4.1.10 视网膜病变 |
| 4.1.11 种族,遗传和人口因素 |
| 4.2 尿酸的代谢及生理作用 |
| 4.3 尿酸的流行病学 |
| 4.4 高尿酸血症导致肾病的机制 |
| 4.5 血清尿酸水平与糖尿病肾病进展的关系 |
| 4.6 DKD的治疗策略 |
| 4.7 降尿酸药物治疗对DKD的影响 |
| 5 研究结论 |
| 6 研究不足 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 学术论文和科研成果 |
| 糖尿病肾病发病机制 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）HDAC3在血脑屏障损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1. HDAC和HDAC抑制剂 |
| 2. HDAC3和HDAC3抑制剂 |
| 3. HDAC及HDAC3在中枢神经系统疾病中的作用 |
| 3.1 在缺血性脑卒中中的作用 |
| 3.2 在阿尔茨海默病中的作用 |
| 3.3 在脊髓损伤中的作用 |
| 3.4 在亨廷顿氏病中的作用 |
| 3.5 在弗里德赖希氏共济失调中的作用 |
| 4. 研究展望 |
| 5. 本论文研究的目的及意义 |
| 6. 本论文使用的理论工具和研究方法以及论文的基本思路及逻辑结构 |
| 7. 参考文献 |
| 第二章 特异性抑制HDAC3激活PPARγ通路并保护OGD/R诱导的体外血脑屏障模型损伤 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验材料和方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 细胞培养及OGD/R模型的建立 |
| 2.3 FITC-dextran渗透实验 |
| 2.4 TEER实验 |
| 2.5 细胞活性实验 |
| 2.6 siRNA沉默基因表达 |
| 2.7 蛋白印迹法(Western Blots)检测 |
| 2.8 免疫荧光染色 |
| 2.9 PPARγ蛋白乙酰化和活性测定 |
| 2.10 TUNEL实验 |
| 2.11 数据分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 HBMEC处以OGD/R后HDAC3入核增多并且表达活性增高 |
| 3.2 特异性抑制HDAC3可以保护OGD/R后HBMEC损伤 |
| 3.3 特异性抑制HDAC3可以恢复OGD/R后紧密连接蛋白Claudin-5的表达 |
| 3.4 特异性抑制HDAC3通过提高PPARγ蛋白的乙酰化水平增强其活性 |
| 3.5 使用HDAC3的siRNA可以保护OGD/R后HBMEC损伤并恢复下调Claudin-5的表达 |
| 4. 讨论 |
| 5. 总结 |
| 6. 参考文献 |
| 第三章 特异性抑制HDAC3在2型糖尿病血脑屏障损伤中的作用及机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验材料和方法 |
| 2.1 动物及药物使用 |
| 2.2 小鼠血脑屏障通透性检测实验 |
| 2.3 HBMEC培养及其活性检测 |
| 2.4 FITC-dextran渗透实验 |
| 2.5 TEER实验 |
| 2.6 蛋白印迹法检测 |
| 2.7 RNA提取及定量PCR |
| 2.8 HDAC3的活性检测 |
| 2.9 免疫荧光染色 |
| 2.10 免疫共沉淀 |
| 2.11 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 在db/db模型的海马和皮层区域HDAC3的表达及活性显着增高 |
| 3.2 特异性抑制HDAC3可以减轻2型糖尿病诱导的血脑屏障通透性损伤并改善紧密连接蛋白的表达 |
| 3.3 特异性抑制HDAC3可以减轻HG-IL1β诱导的HBMEC通透性损伤 |
| 3.4 特异性抑制HDAC3可以逆转HG-IL1β诱导的HBMEC紧密连接蛋白损伤 |
| 3.5 特异性抑制HDAC3可以改善体内体外模型中Nrf2和Keap1的结合异常 |
| 3.6 特异性抑制HDAC3后Nrf2下游相关基因同时被调控且Nrf2参与特异性抑制HDAC3对内皮细胞通透性的保护作用 |
| 3.7 在db/db鼠中使用HDAC3特异性抑制剂RGFP966治疗10天内对血糖和体重均无影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 参考文献 |
| 第四章 特异性抑制HDAC3在2型糖尿病合并卒中的作用及机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 实验材料和方法 |
| 2.1 动物模型建立及药物使用 |
| 2.2 TTC染色 |
| 2.3 行为学实验 |
| 2.4 依文思蓝小鼠血脑屏障通透性检测实验 |
| 2.5 RNA提取及定量PCR |
| 2.6 统计分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 卒中后HDAC3的mRNA水平在合并2型糖尿病组中的反应性更高 |
| 3.2 特异性抑制HDAC3减少2型糖尿病合并卒中后的脑梗死体积 |
| 3.3 特异性抑制HDAC3改善2型糖尿病合并卒中后的行为学功能 |
| 3.4 HDAC3特异性抑制剂RGFP966治疗7天内对血糖和体重均无影响 |
| 3.5 特异性抑制HDAC3减轻2型糖尿病合并卒中后的血脑屏障损伤 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 6. 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 攻读学位期间发表文章情况 |
（10）Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导Apelin-13/APJ促动脉粥样硬化作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词简表 |
| 总前言 |
| 第一部分Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导Apelin-13/APJ促HA/VSMC增殖 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 Apelin-13对HA-VSMCs增殖的影响 |
| 3.2 Apelin-13对HA-VSMCs中 Pannexin-1 基因和蛋白表达的影响 |
| 3.3 Apelin-13对HA-VSMCs中 ATP释放的影响 |
| 3.4 Apelin-13对HA-VSMCs中 NLRP3 基因和蛋白表达的影响 |
| 3.5 Probenecid对 Apelin-13促HA-VSMCs增殖作用的影响 |
| 3.6 Probenecid对 Apelin-13促HA-VSMCs中 Pannexin-1 蛋白表达的影响 |
| 3.7 Probenecid对 Apelin-13促HA-VSMCs中 ATP释放的影响 |
| 3.8 Probenecid对 Apelin-13促HA-VSMCs中 NLRP3 蛋白表达的影响 |
| 3.9 siRNA-NLRP3对Apelin-13促HA-VSMCs增殖作用的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 第二部分 Pannexin-1 半通道-NLRP3 途径介导Apelin-13/APJ促巨噬细胞炎症反应 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 Apelin-13对THP-1 巨噬细胞炎症因子分泌的影响 |
| 3.2 Apelin-13对THP-1 巨噬细胞中Pannexin-1 基因和蛋白表达的影响 |
| 3.3 Apelin-13对THP-1 巨噬细胞ATP释放的影响 |
| 3.4 Apelin-13对THP-1 巨噬细胞中NLRP3 基因和蛋白表达的影响 |
| 3.5 Probenecid对 Apelin-13促THP-1 巨噬细胞炎症因子释放的影响 |
| 3.6 Probenecid对 Apelin-13促THP-1 巨噬细胞Pannexin-1 蛋白表达的影响 |
| 3.7 Probenecid对 Apelin-13促THP-1 巨噬细胞ATP释放的影响 |
| 3.8 Probenecid对 Apelin-13促THP-1 巨噬细胞NLRP3 蛋白表达的影响 |
| 3.9 siRNA-NLRP3对Apelin-13促THP-1 巨噬细胞NLRP3 蛋白表达的影响 |
| 3.10 siRNA-NLRP3对Apelin-13促THP-1 巨噬细胞炎性因子分泌的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 第三部分 Pannexin-1 半通道-NLRP3 途径介导Apelin-13/APJ促内皮细胞氧化应激以及单核细胞-内皮细胞粘附 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 Apelin-13对HUVECs中 ROS生成的影响 |
| 3.2 Apelin-13对HUVECs中 Pannexin-1 基因和蛋白表达的影响 |
| 3.3 Apelin-13对HUVECs中 ATP释放的影响 |
| 3.4 Apelin-13促HUVECs中 NLRP3 基因和蛋白的表达 |
| 3.5 Probenecid对 Apelin-13促HUVECs中 Pannexin-1 蛋白表达的影响 |
| 3.6 Probenecid对 Apelin-13促HUVECs中 ATP释放的影响 |
| 3.7 Probenecid对 Apelin-13促HUVECs中 NLRP3 蛋白表达的影响 |
| 3.8 Probenecid对 Apelin-13促HUVECs中 ROS生成的影响 |
| 3.9 siRNA-NLRP3对Apelin-13促HUVECs中 NLRP3 蛋白表达的影响 |
| 3.10 siRNA-NLRP3对Apelin-13促HUVECs中 ROS生成的影响 |
| 3.11 Probenecid对 Apelin-13 促单核细胞-内皮细胞粘附的影响 |
| 3.12 siRNA-NLRP3 抑制Apelin-13 诱导单核细胞-内皮细胞的粘附 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 第四部分 Pannexin-1 半通道-NLRP3 途径参与Apelin-13促ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 Apelin-13对ApoE~(-/-)小鼠动脉内AS斑块大小的影响 |
| 3.2 Apelin-13对ApoE~(-/-)小鼠主动脉内AS斑块破裂率和破裂面积的影响 |
| 3.3 Apelin-13对ApoE~(-/-)小鼠主动脉AS斑块中平滑肌细胞的影响 |
| 3.4 Apelin-13对ApoE~(-/-)小鼠主动脉AS斑块中胶原成分的影响 |
| 3.5 Apelin-13对ApoE~(-/-)小鼠主动脉AS斑块中MAC-3 的影响 |
| 3.6 Apelin-13对ApoE~(-/-)小鼠Pannexin-1 和NLRP3蛋白表达的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 全文讨论 |
| 参考文献 |
| 综述: Apelin/APJ系统生物学功能研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间成果目录 |
| 致谢 |
四、类2型糖尿病db/db鼠的体外巨噬细胞细胞因子及一氧化氮分泌改变（论文参考文献）
- [1]盐酸小檗碱外用对糖尿病创面愈合的作用及机制研究[D]. 马骥. 南京中医药大学, 2021(01)
- [2]利拉鲁肽通过上调PPARα调控小胶质细胞/巨噬细胞极化改善糖尿病大鼠脑缺血损伤的研究[D]. 官劲帆. 遵义医科大学, 2021
- [3]白芷对2型糖尿病小鼠皮肤溃疡促愈的作用机制的研究[D]. 雷思思. 天津医科大学, 2020(06)
- [4]基于PKM2调控M1型巨噬细胞活化途径探讨黄葵素对糖尿病肾病模型肾保护作用的机制研究[D]. 浦强. 南京中医药大学, 2020(01)
- [5]基于肠道菌群探讨乳源性复合益生菌诱导结肠GLP-1分泌及M2极化的分子机制研究[D]. 王艳明. 新疆医科大学, 2020(03)
- [6]水飞蓟素对糖尿病肾病的保护作用及机制研究[D]. 刘燕. 安徽医科大学, 2020(01)
- [7]基于巨噬细胞探讨Bruton酪氨酸激酶调控NLRP3炎症小体激活在糖尿病肾病炎症机制中的作用[D]. 孙璇君. 安徽医科大学, 2020(01)
- [8]糖尿病患者血清高尿酸水平与糖尿病肾病发生、进展的关系研究[D]. 王婷婷. 上海交通大学, 2019(06)
- [9]HDAC3在血脑屏障损伤中的作用及机制研究[D]. 赵秋宸. 南京大学, 2019(01)
- [10]Pannexin-1半通道-NLRP3途径介导Apelin-13/APJ促动脉粥样硬化作用研究[D]. 李莉芳. 南华大学, 2019(01)